UNIVERSITE AIX-MARSEILLE Licences Sciences et technologies-mention Biologie L2S3 Partiel Biochimie-réactions cellulaires - 6 novembre 2012
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- Renaud Labbé
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1 Durée 2heures - Documents non autorisés UNIVERSITE AIX-MARSEILLE Licences Sciences et technologies-mention Biologie L2S3 Partiel Biochimie-réactions cellulaires - 6 novembre 2012 Purification et caractérisation d une enzyme bactérienne E sécrétée par Bacillus halodurans L enzyme E est purifiée à partir du surnageant de culture débarrassé des bactéries par centrifugation selon un protocole contenant trois étapes (Table 1). Le surnageant de culture centrifugé est soumis à une précipitation au sulfate d ammonium. Le précipité est récupéré par centrifugation, resolubilisé, dialysé contre un tampon Tris-HCl 50 mm ph 9 (tampon A) et chargé sur une colonne de DEAE-cellulose (chromatographie échangeuse d anions) (figure 1). L élution des protéines est réalisée à l aide d un gradient de 0 à 1 M NaCl dans le tampon A. Les fractions contenant l enzyme sont regroupées, concentrées et chargées sur une colonne de séphadex G50 équilibrée en tampon A (chromatographie d exclusion). L élution des protéines est réalisée avec le tampon A. Les fractions contenant l enzyme sont regroupées et constituent le pool d enzyme purifiée. Les fractions issues des différentes étapes de purification sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturantes (figure 2). Le pool d enzyme purifiée a été utilisé comme source d enzyme pour étudier son activité sur un substrat spécifique et les résultats sont reportés dans la table 2. Table 1 : Bilan des étapes de purification de l enzyme E Etapes Surnageant centrifugé culture enzymatique totale (U) Quantité de protéine totale (mg) spécifique (U/mg) Facteur de purification Rendement de purification (%) Précipitation sulfate d ammonium échangeuse d anions d exclusion , Figure 1 : Profil de la chromatographie échangeuse d anions. La barre noire représente les fractions contenant l enzyme
2 Figure 2 : Analyse des étapes de purification par électrophorèse en conditions dénaturantes. Ligne M : marqueur de taille Ligne 1 : surnageant de culture Ligne 2 : précipitation sulfate d ammonium Ligne 3 : chromatographie échangeuse d anions Ligne 4 : chromatographie d exclusion. Table 2 : Etude de l activité de l enzyme E sur un substrat S. Les mesures ont été faites avec 10 µl d enzyme à 0,5 mg/ml. [Substrat] 0 (mm) vi (µmole/min) 10 0, , ,149 1,5 0,131 1,25 0,119 Questions: 1) Après avoir défini les termes activité spécifique, facteur de purification et rendement de purification, compléter la table 1. Quels commentaires à propos de l efficacité des différentes étapes pouvez-vous faire? - L activité spécifique d une solution enzymatique est le rapport entre l activité enzymatique totale et la quantité de protéine totale de cette solution. Elle s exprime en U/mg - Le facteur de purification est le rapport entre l activité spécifique d une solution après l étape de purification et l activité spécifique de la solution avant l étape de purification - Le rendement de purification est le rapport, exprimé en pourcentage, entre l activité enzymatique totale après une étape de purification et l activité enzymatique totale avant l étape de purification. On calcule ces paramètres étape par étape. On peut aussi les calculer globalement (chiffres entre parenthèse) Etapes Surnageant centrifugé culture enzymatique totale (U) Quantité de protéine totale (mg) spécifique (U/mg) Facteur de purification Rendement de purification (%) ,1 Précipitation sulfate d ammonium échangeuse d anions d exclusion ,95 1,9 85, ,4 25,17 6,37 (12) 36,05 (31) ,2 1,36 (16,29) 78,08 (24,2)
3 On observe donc qu au final l enzyme a été purifiée environ 16 fois avec un rendement global de 24,2%. Lorsqu on s intéresse à chaque étape, on observe que la chromatographie échangeuse d anions est celle qui a la meilleure efficacité en terme de purification, mais la moins bonne efficacité en terme de rendement. Inversement la précipitation au sulfate d ammonium et la chromatographie d exclusion permettent un bon rendement de purification mais présentent une moins bonne efficacité de purification. 2) Après avoir donné le principe de la chromatographie échangeuse d anions, commentez le profil d élution de la figure 1. Que représente la mesure de l absorbance à 280 nm.? Comment peut-on repérer les fractions contenant l enzyme? quelle information concernant le phi de l enzyme peuton en déduire? La chromatographie échangeuse d anions est une méthode de purification basée sur la séparation des molécules selon leur charge globale. La colonne est constituée d une matrice sur laquelle sont greffés des groupements ionisables chargés positivement au ph de travail. Cette matrice sera donc capable de retenir des molécules chargées négativement (anions). Dans le cas des protéines elles seront chargées négativement si leur phi est inférieur au ph de travail. Les protéines chargées négativement seront retenues sur la colonne alors que les protéines neutres ou chargées positivement ne seront pas retenues et seront éluées en premier. Pour éluer les molécules négatives retenues sur la colonne, il faut appliquer un gradient de force ionique (NaCl par exemple) ou l ion Cl - jouera le rôle d un compétiteur. On peut aussi utiliser un gradient de ph décroissant. - Le profil d élution de la figure 1 représente l absorbance à 280 nm en fonction du numéro des fractions. L absorbance à 280 nm caractérise la présence de matériel protéique du fait de l absorption des UV par les acides aminés aromatiques (trp, phe et tyr) qui entrent dans la composition des protéines. On observe donc trois pics d absorbance à 280nm. Le premier est observé avant la mise en place du gradient de NaCl. Il représente la fraction des protéines non retenues par la colonne et qui sont donc soit neutres soit chargées positivement. Les deux autres pics sont observés après la mise en place du gradient de NaCl et représentent les fractions des protéines retenues par la colonne. Le deuxième pic contient l enzyme. On peut donc en conclure que le phi de l enzyme est inférieur à 9 mais est supérieur à celui des protéines contenues dans le 3 ème pic, qui sont retenues plus tardivement et donc plus négatives. - Pour repérer l enzyme dans les fractions, il suffit de mesurer l activité enzymatique de chacune des fractions sur un substrat de l enzyme. 3) Après avoir donné le principe de l électrophorèse en conditions dénaturantes, analyser la figure 2. Quelle information avez-vous concernant la masse molaire de l enzyme? L électrophorèse est une méthode de séparation des molécules sous l effet d un champ électrique. Dans le cas des protéines, l électrophorèse est réalisée sur un gel de polyacrylamide constitué d un réseau de maille plus ou moins large dans lequel les plus grosses molécules sont freinées par rapport au plus petites. La séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dépend donc de la charge et de la taille des protéines. En conditions dénaturantes, on utilise du -mercaptoéthanol ou du dithiothreitol (DTT) qui permet la coupure des ponts disulfures et du sodium dodecyl sulfate (SDS) qui entoure les protéines de charges négatives. En condition dénaturantes, les protéines chargées négativement se déplaceront toutes vers l anode et leur séparation sur le gel dépendra uniquement de leur taille. La figure 2 est une analyse par électrophorèse en conditions dénaturantes des protéines contenues dans les fractions à différents stades de la purification. La ligne M correspond au dépôt de protéines de référence de masse molaire connue. Cette piste permet d établir la relation entre la masse molaire et la distance de migration. La ligne 1 est une analyse du contenu protéique du surnageant de culture. On distingue de nombreuses bandes comprises entre 116 et 25 kda. La ligne 2 est une analyse des protéines récupérées après la précipitation au sulfate d ammonium. On distingue encore de nombreuses bandes avec néanmoins un enrichissement au niveau de 66 kda et de 25 kda. La ligne 3 correspond à la fraction obtenue après la chromatographie échangeuse d anions. On observe deux bandes protéiques principales à 66 kda et à 25 kda. La ligne 4 correspond à la fraction obtenue après gel filtration et ne fait apparaître qu une bande principale à 66 kda. En accord ave le tableau de purification, l électrophorèse montre qu on élimine plusieurs protéines contaminantes au cours du protocole de purification pour ne conserver que la protéine d intérêt dont la masse molaire est aux alentours de g/mol.
4 4) En précisant le principe de la chromatographie d exclusion et en utilisant les informations données par la figure 2, donnez un schéma du profil d élution probablement obtenu lors de l étape de purification de l enzyme sur sephadex G50 (limite d exclusion 50000Da). Vous préciserez bien sur dans quel pic se trouve l enzyme. La chromatographie d exclusion est une méthode de séparation des molécules selon leur taille. La colonne est composée de billes poreuses. Les molécules de taille supérieure au diamètre des pores des billes ne rentrent pas dans les billes et sont entrainées par le tampon d élution. Les molécules de taille inférieure au diamètre des pores des billes vont pouvoir entrer dans les billes et seront donc ralenties lors de l élution. Par conséquent, lors de la chromatographie d exclusion, les plus grosses molécules sont éluées en premier et les plus petites en dernier. Dans notre protocole de purification, l étape de la chromatographie d exclusion est réalisée après l étape de la chromatographie échangeuse d anions. D après l électrophorèse, on voit qu il y a donc 2 protéines de 25 et 66 kda à séparer par tamisage moléculaire. Le profil attendu est donc : DO à 280 nm Pic 1 contient la protéine à 66 kda Pic 2 contient la protéine à 25 kda Vo= volume mort N des fractions 5) A l aide des données de la table 2, tracez la représentation graphique 1/vi en fonction de 1/[S] 0. Déterminez Km et Vm. Calculez l activité spécifique et la constante catalytique de l enzyme E. Les mesures ont été faites avec 10 µl d enzyme à 0,5 mg/ml. [Substrat] 0 (mm) -1 1/[S] 0 mm vi (µmole/min) 1/vi min/µmole 10 0,1 0,235 4,25 4 0,25 0,196 5,1 2 0,5 0,149 6,71 1,5 0,66 0,131 7,63 1,25 0,8 0,119 8,4 Selon l équation de Michaelis Menten D où l équation de Lineweaver Burk On trace donc la représentation graphique en double inverse 1/vi=f(1/[S] 0 ) pour déterminer Vmax et Km
5 1/vi min/µmole Représentation de Lineweaver Burk /Vmax ,5 0 0,5 1-1/Km 1/[S] mm -1 A partir de la représentation graphique on déduit Vmax et Km -1/Km = -0,6077 d où Km = 1,65 mm 1 /Vmax = 3,6461 d où Vmax = 0,274 µmole/min On a utilisé 10 µl d enzyme à 0,5 mg/ml. On a donc 0,005 mg d enzyme. AS = 0,274/0,005 = 54,8 µmole/min x mg La masse molaire est de g/mol. On a donc 5 x 10-6 /66000 = 75 x mole soit 75 x 10-6 µmole Vmax = kcat x [E] total Donc kcat = Vmax/[E] total = 0,274/75 x 10-6 = 3,65 x 10 3 min -1
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