RECHERCHE DE LA SPÉCIFICITÉ D UN ANTICORPS PAR LE TEST D IMMUNODIFFUSION OU TEST D OUCHTERLONY

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1 Fiche sujet - élève La spécificité d un anticorps est liée à sa capacité de liaison avec une molécule donnée présentant des propriétés antigéniques. Le test d immunodiffusion, ou test d Ouchterlony, permet la mise en évidence de cette liaison antigène-anticorps. On cherche à savoir si les anticorps contre l albumine de sérum de bœuf (BSA) ont une spécificité stricte vis à vis de la BSA. Matériel - deux petites boîtes de Petri contenant du gel d agar (dont une pour s exercer) ; éventuellement un gabarit de perçage ; - un tube emporte-pièce, un cure-dent + une aiguille lancéolée + marqueur (pour marquer la boîte de Petri) ; - sérum de lapin (= S) contenant des anticorps anti BSA (albumine de sérum de bœuf) ; - eau distillée (= E) et 4 solutions d albumines extraites de : œuf de poule = O lait de vache = L sérum de bœuf = B sérum de cheval = C - un compte-goutte pour chaque produit, des gants ; - si besoin une lampe de bureau et petite feuille de papier noir pour observer les résultats. Activités et conditions des activités - Après lecture du protocole fourni, choisir la disposition des produits dans la boîte de Petri et l indiquer sur le schéma de la fiche réponse. Justifier ce choix. Appeler l examinateur pour vérifier et pour obtenir éventuellement un document de secours. Capacités et principaux critères d'évaluation Adopter une démarche explicative Barème 3 - Réaliser le protocole en utilisant les indications de la fiche technique. Appeler l examinateur pour obtenir la boîte des résultats. 3- Représenter sur la fiche réponse les résultats de la boîte fournie en réalisant un schéma sur le modèle du précédent. Schématiser les associations moléculaires que révèle un arc de précipitation. Respecter les modèles proposés dans la fiche document. Réaliser une manipulation d après un protocole respect des étapes du protocole utilisation maîtrisée du matériel organisation et rangement de la paillasse Traduire des informations par des schémas Exploiter les résultats fournis pour discuter le degré de spécificité de l anticorps anti-bsa.. Adopter une démarche explicative

2 Fiche technique - élève Principe de la méthode d Ouchterlony C est l immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu elles ont suffisamment progressé. Cette zone de contact reste invisible s il n y a pas de réaction entre les deux solutions. En revanche, elle se traduit par un arc de précipitation visible à l œil nu lorsque les deux solutions réagissent. Le temps de réaction est de l ordre de 4h. PROTOCOLE TECHNIQUE - Creuser les puits nécessaires dans la gélose de la boîte de Petri Au fond de la boîte de Petri est coulé un gel d agar. Utiliser le gabarit ci-contre (ou celui fourni), pour répartir les puits nécessaires. S exercer avec la boîte d apprentissage pour creuser les puits avec l emporte-pièce. Utiliser le cure-dent pour éliminer les cylindres de gélose si nécessaire.. Choisir et marquer sur la boîte de Petri la disposition des produits à déposer dans les puits permettant de révéler la réaction de l anticorps étudié avec les différents antigènes proposés. 3. Remplir les puits Le produit prélevé dans un tube avec un compte-goutte propre doit être déposé dans le puits approprié sans débordement ni bulles et sans endommager le gel d agar. S exercer avec la boîte d apprentissage et de l eau distillée. Gabarit de perçage 4. Observer les résultats fournis sur fond noir et en éclairage rasant.

3 Fiche réponse élève ETABLISSEMENT : Classe : NOM et Prénom : Schéma à compléter Modèles moléculaires pour schématisation A rendre à l issue de l épreuve

4 Fiche laboratoire MATERIEL NECESSAIRE : - petites boîtes de Petri en plastique de diamètre 6 cm, petit matériel (voir fiche sujet-élève) ; - gabarit de perçage des puits (certains lycées utilisent comme gabarit de perçage un couvercle percé de boîte de Petri ; le fournir alors à l élève) ; - agar-agar ; - chambre humide ; - pipettes pasteur ; - papier filtre ; - eau physiologique ; - bec bunsen ; - emporte-pièces de 4 et 5 mm de diamètre (certains lycées utilisent un tube avec poire d aspiration, le fournir alors à l élève) ; - tampon PBS ; - sérum anti-bsa ; - solutions d albumines nécessaires à la manipulation (ex. : BSA à 0,% dans PBS). PREPARATION DES BOITES DE GELOSE Les boîtes peuvent être préparées quelques jours avant le TP. Les quantités sont données pour 0 boîtes. - Préparer 50 ml d une solution d agar-agar à,5% dans le PBS ph 7, ; - placer 7 ml de la solution tiède dans les boîtes de Petri ; - laisser reposer 0 min de papier filtre du diamètre interne du couvercle, l imprégner d eau et la placer dans le couvercle ; - placer la boîte refroidie sur le gabarit et évider les puits à l emporte pièce ; - deux possibilités pour terminer la préparation :. récupérer l agar-agar des puits et le faire fondre sur la veilleuse du bec Bunsen dans un tube à essai avec un peu de tampon PBS ; reverser dans chaque puits quelques gouttes de cette solution pour refaire un fond de puits ;. laisser les puits sans fond reconstitué ; - refermer les boîtes avec les couvercles tapissés de papier filtre humide et les conserver au réfrigérateur, enveloppées dans du film plastique éventuellement. PREPARATION DE BOITES RESULTATS AU MOINS 4H AVANT L EPREUVE (en cas d impossibilité on utilisera la fiche de résultats élève) - Les puits ayant été remplis avec les réactifs grâce à une pipette Pasteur (sans bulles ni débordement), l incubation est réalisée en plaçant les boîtes dans la chambre humide à température ambiante. - La lecture peut se faire au bout de 4 à 48 h, en plaçant les boîtes sur un fond noir et éventuellement en éclairage rasant. - Pour conserver les résultats, placer alors les boîtes à 4 C. Pour éviter l utilisation de produits on pourra : utiliser des boîtes de résultats conservées au congélateur après un TP formatif (veiller à ce que les désignations et la position de l arc soient corrects), faire des boîtes avec des sérums restants après le TP formatif, conservés au congélateur : au minimum le sérum anti-bsa et la solution de BSA nécessaires pour obtenir l arc. Utiliser alors le même protocole que pour le TP formatif. FOURNISSEURS : - SIGMA, l Isle d Abeau Chesnes BP 70, 3897 ST QUENTIN FALLAVIER ; tampon PBS en pastilles, sérums divers, protéines antigéniques... ( section immunologie du catalogue ) - SORDALAB, ZA des Poupettes, 9580 VILLENEUVE SUR AUVERS ; kit test d Ouchterlony.

5 Fiche document secours élève BOITE PRESENTANT LA DISPOSITION DES PRODUITS DANS LES PUITS

6 Fiche résultats élève BOITE DE RÉSULTATS PRESENTEE SUR FOND NOIR ET ÉCLAIRAGE RASANT

7 Fiche barème d'évaluation Capacités et critères d évaluation (en gras, évaluation pendant de la séance) Barème Noms des élèves - Adopter une démarche explicative - puits central avec sérum lapin ; puits périphériques contenant chacun un antigène ou l eau distillée - justification : possibilité de rencontre entre les anticorps du sérum central et tous les antigènes périphériques * * fournir un document de secours à l élève qui ne franchit pas cette étape. - Réaliser une manipulation d après un protocole - réalisation soignée des 6 puits - marquage efficace des puits sur la boîte - utilisation judicieuse du matériel : compte-goutte par produit dépôts soignés dépôt des produits conforme au marquage vérifiable lors de la manipulation et/ou au vu des résultats - organisation et rangement de la paillasse 3- Représenter une observation par un schéma - conformité avec la boîte de résultats fournie - schéma représentant un complexe antigène -anticorps ; conformité au modèle ; titre pertinent et adapté, travail soigné 4 - Adopter une démarche explicative pour répondre au problème posé Les anticorps testés réagissent en présence de l albumine de sérum de bœuf (BSA). Ils ne réagissent pas en présence des albumines des autres espèces testées ni même en présence de l albumine de lait de Vache (même espèce). On peut donc estimer qu ils sont strictement spécifiques de la BSA. (NB : on n attend pas du candidat qu il dise qu on ne sait pas si toutes les albumines du Bœuf ont été testées). 4 Note /0

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