THÈSE. Aziza IBN HADJ HASSINE

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1 NNT : 2014 EMSE 0740 THÈSE présentée par Aziza IBN HADJ HASSINE pour obtenir le grade de Docteur de l École Nationale Supérieure des Mines de Saint-Étienne Spécialité : Sciences et Génie de l Environnement EVALUATION DE L ACTIVITE OESTROGENIQUE DE CONTAMINANTS ET DEVELOPPEMENT D UN BIO-RECEPTEUR D AFFINITE POUR LA DETECTION D UNE XENO-HORMONE soutenue à Alès, le 23 avril 2014 Membres du jury Président : Rapporteurs : Loïc BLUM Professeur, Directeur de l'icbms, Université de Lyon I Jean-Louis MARTY Professeur, Université de Perpignan Via Domitia, Examinateur(s) : Serge CHIRON Directeur de recherche, Université de Montpellier II Directeur(s) de thèse : Catherine GONZALEZ Professeur, Ecole des mines d Alès Ingrid BAZIN Chargé de recherche, Ecole des mines d Alès Jacques BOURGOIS Professeur Emérite, Ecole des Mines de Saint- Etienne

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3 Remerciements Je tiens à remercier le Professeur Catherine Gonzalez, mon directeur de thèse, de m avoir accueilli au sein de son équipe pour mon stage de master 2 et ensuite pour ma thèse. Vous avez été toujours présente lors des moments clefs de cette thèse. Merci de votre confiance et votre soutien tant sur le plan professionnel que personnel. Je tiens à exprimer ma sincère reconnaissance au Dr Ingrid Bazin, Chargé de recherche à l Ecole des mines d Alès, qui a également joué un rôle important pendant mon master et durant toute ma thèse. Je tiens à lui exprimer ma profonde gratitude pour sa disponibilité de chaque instant, pour son aide précieuse et ses conseils avisés durant les expérimentations et la rédaction de ce manuscrit. Merci Ingrid! Je tiens à remercier également le Professeur Miguel Lopez-Ferber, Directeur du LGEI de l Ecole des mines d Alès, de m avoir permis d effectuer ma thèse au sein de son laboratoire. J exprime mes sincères remerciements au Professeur Loïc Blum, Directeur de l'icbms, Université de Lyon I et au Professeur Jean-Louis Marty, Laboratoire IMAGES EA, Université de Perpignan Via Domitia, pour avoir accepté d être rapporteurs de ce manuscrit et d apporter un éclairage pertinent sur ce travail de recherche. Je souhaite également adresser mes remerciements à Mr Serge Chiron, Directeur de recherche, Laboratoire HSM, Université Montpellier II et à Mr Jacques Bourgois, Professeur Emérite, Centre SPIN-Département GSE, Ecole Nationale Supérieure des Mines de Saint Etienne, pour accepter de juger ce manuscrit et participer au jury de ma soutenance. Je remercie tout naturellement mes collègues de l équipe EcoDiag qui m ont aidé tout au long de cette thèse et sans qui ce travail ne serait pas ce qu il est. Je remercie particulièrement Sylvie, Roro, Christine et Mumu. Je remercie également tous les autres collaborateurs avec qui j ai pu travailler durant ma thèse ainsi que les membres du LGEI que je n ai pu citer ici. A Andrey. Tu as été un super collègue et ami tout au long de ce travail de thèse. Chaque jour j ai pu compter sur ton aide précieuse. Au moment où j écris ces remerciements, je me remémore tous les moments qu on a pu passer ensemble depuis l été Je te souhaite plein de bonheur et de réussite pour la suite. A Andrey (toujours le même!), Romain, Imtiaz, Rita et Nibal que j ai appris à connaître et à apprécier durant ces 3 années de thèse. Merci pour votre aide et votre soutien dans les moments de doute. Le travail au sein du laboratoire m a permis de faire votre rencontre et je n oublierai pas les bons moments que nous avons passé ensemble. A bientôt!

4 A mon Papou. Cette thèse c est aussi la tienne. Depuis le début chaque jour, chaque instant tu as été là pour me soutenir. Tu as été là quand le doute s installait et tu as toujours eu ton oreille attentive pour m écouter te raconter les derniers résultats du jour. Je n aurai jamais assez de ces quelques lignes dans ce manuscrit pour te remercier pour ton amour. Je crois savoir que tu es content que tout cela s achève enfin.

5 Table des matières Liste des figures... iv Liste des Tableaux... v Liste d abréviations... vi Introduction... 1 Chapitre I : Synthèse bibliographique... 2 I. Contrôle de la qualité de l eau et des rejets : micropolluants à activité endocrinienne et législation européenne... 6 II. Mécanismes de la perturbation endocrinienne A. Fonctionnement du système hormonal B. Récepteurs stéroïdiens sexuels ) Organisation structurelle ) Récepteur aux oestrogènes : ER ) Mécanismes d action du récepteur aux oestrogènes III. Définition des perturbateurs endocriniens : un débat d actualité A. Mécanismes de la perturbation endocrinienne B. Xéno-hormones et récepteur aux oestrogènes C. Cas particulier : les xéno-estrogènes et le récepteur à la dioxine D. Action à faible dose et en mélange de perturbateurs endocriniens IV. Perturbateurs endocriniens : substances d origines multiples A. Hormones ) Hormones naturelles ) Hormones synthétiques B. Xéno-hormones d origine naturelle ) Phyto-oestrogènes ) Myco-oestrogènes C. Xéno-hormones d origine anthropique ) Xéno-hormones d origines industrielles ) Produits de consommation courante et d hygiène corporelle, les parabènes V. Evaluation des altérations des écosystèmes en lien avec la présence des perturbateurs endocriniens A. Effet sur les invertébrés B. Poissons/Amphibiens C. Effet sur les mammifères i

6 D. Observations chez l Homme VI. Perturbateurs endocriniens dans les effluents et les milieux aquatiques A. Présences des parabènes B. Présence des mycotoxines C. Autres perturbateurs endocriniens VII. Détection des perturbations endocriniennes et des xéno-hormones A. Détection de la perturbation endocrinienne de contaminants et d effluents ) Bioessais pour détecter la perturbation endocrinienne a) Méthodes in vivo b) Méthodes in vitro b.1. Tests de liaison au récepteur b.2 Tests de prolifération cellulaire b.3 Dosage de l activité oestrogèno-mimétique; le Yeast Estrogen Screen (YES) et autres tests utilisant le gène rapporteur ) Immunoessais pour détecter la perturbation endocrinienne B. Détection des xéno-hormones avérées ) Méthodes physico-chimiques ) Bioessais, méthodes immunochimiques ) Détection de la perturbation oestrogénique dans l environnement et les eaux usées via le Yeast Estrogen Screen (YES) C. Biocapteurs pour le suivi des PE dans l environnement ) Définition ) Bio-récepteurs d affinité ) Bio-récepteurs métaboliques et cellulaires ) Application des biocapteurs pour le contrôle environnemental Chapitre II : Résultats et discussions I. Observation et détection des effets biologiques des xéno-oestrogènes A. Observation des effets biologiques sur les écosystèmes côtiers tunisiens : étude des déformations squelettiques chez Aphanius faciatus B. Détermination de l activité oestrogénique d échantillons réels et de contaminants par le Yeast Estrogen Screen (YES) Activité oestrogénique d effluents de stations d épuration du Sahel tunisien et présence de parabènes Activité oestrogéniques de colorants alimentaires dans le Yeast Estrogen Screen (YES) ii

7 3. Activité oestrogénique de colorants textiles dans le Yeast Estrogen Screen (YES) 110 II. Développement d un nouveau bio-récepteur d affinité pour la détection des xéno-oestrogènes 118 Conclusion générale et perspectives Références bibliographiques iii

8 Liste des figures Figure 1 : Système endocrinien chez l homme Figure 2 : Organisation structurelle des récepteurs stéroïdiens Figure 3: Différentes voies de signalisation cellulaire du récepteur ER et de l oestradiol Figure 4 : Modes d action des perturbateurs endocriniens Figure 5 : Activation illégitime du récepteur des oestrogènes Figure 6 : Voies de signalisation des oestrogènes médiées par les récepteurs membranaires et nucléaires Figure 7: Structure et mécanismes moléculaires du récepteur nucléaire AhR Figure 8 : Intéraction de la signalisation du récepteur AhR Figure 9:Activation illégitime de la voie de signalisation du ER (récepteur des oestrogènes) par le récepteur de la dioxine activé AhR Figure 10: Interaction de la signalisation des dioxines avec les oestrogénes Figure 11 : Quelques exemples de xéno-hormones Figure 12 : Déformation de la colonne vertébrale chez des médakas âgés de 10 semaines Figure 13 : Substances à action endocrinienne dans les eaux résiduaires d une station d épuration allemande Figure 14 : Principe du YES (Yeast Estrogen Screen) Figure 15 : Schéma présentant les 3 principes utilisés pour la technique ELISA Figure 16 : Schéma du principe de fonctionnement d'un biocapteur Figure 17 : Représentation des différents types de bio-récepteurs Figure 18 : Localisation géographique des sites d échantillonnage Figure 19 : Niveau de pollution en métaux et en HAP au niveau des quatre sites étudiés iv

9 Liste des Tableaux Tableau 1 : Substances prioritaires de la DCE et leurs effets endocrinniens Tableau 2 : Relation entre les hormones endocrines et les réponses correspondantes Tableau 3 : Récepteurs des hormones stéroïdes Tableau 4 : Cibles des perturbateurs endocriniens Tableau 5 : Structures des trois catégories de ligands du récepteur aux oestrogènes humains Tableau 6 : Classes de perturbateurs endocriniens. Archives des maladies professionnelles et de l environnement Tableau 7 : Sources de perturbateurs endocriniens entrant dans les eaux environnementales Tableau 8 : Comparaison des limites de détection, des valeurs de EC 50 et des durées des essais pour les différents tests in vitro Tableau 9 : Techniques d'analyse utilisées pour la quantification des différentes classes de perturbateurs endocriniens dans l'environnement aquatique Tableau 10 : Exemples de kits commerciaux Tableau 11 : Niveaux des EEQ trouvés dans différentes matrices environnementales analysées dans de nombreux pays en utilisant le test in vitro YES Tableau 12 : Biocapteurs électrochimiques pour l'analyse environnementale Tableau 13 : Biocapteurs électrochimiques pour l'analyse environnementale Tableau 14 : Liste des polluants organiques analysés par les systèmes RIANA ou AWACSS Tableau 15 : Activité oestrogénique exprimée en équivalent oestradiol (EEQ) Tableau 16 : Activité oestrogénique relative des cinq colorants alimentaires (1g/l) v

10 Liste d abréviations Abs : anticorps AChE : Acétylcholinestérase Ags : antigènes AhR : récepteur de la dioxine et des hydrocarbures aromatiques AMPc : adénosine mono phosphate cyclique PAL : phosphatase alcaline AP : Alkylphénols APCI : Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique APE : Alkylphénols Polyéthoxylates AR : récepteurs des androgènes Arnt : Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator BaP : Benzo(a)pyrène BChE : Butyrylcholinesterase bhlh-pas : Basic Helix-loop-helix/Per-Arnt-Sim BLYES : Bioluminescent Yeast Assay BPA : bisphénol A BuP : butyl parabène BzP : benzyl parabène CEVAM : Centre européen pour la validation de méthodes alternatives CFC : chlorofluocarbones CIRC : Centre international de recherche sur le cancer CMR : Cancerigène, Mutagène, Reprotoxique CPRG : chlorophénol rouge-beta-d-galactopyranoside DAD : détection à barrette de diodes DBD : DNA Binding Domain DCE : Directive Cadre sur l eau DDD : dichlorodiphényldichloroéthane 4,4 -DDE : 4,4'- Dichlorodiphényldichloroéthane DDT : 4,4'-(2,2,2-trichloroethane-1,1-diyl)bis(chlorobenzene) DES : diéthylstilbestrol DHEA : déhydroépiandrostérone DHT : dihydrotestostérone DON : déoxynivalénol DRE : éléments de réponse à la dioxine E1 : oestrone E102 : tartazine E127 : érytrosine B E2 : oestradiol E3 : oestriol E310 : propyl gallate EAP : éthoxylates d alkylphénol EDSTAC : Agence de protection de l environnement des USA EE2 : éthinylestradiol EEQ : Equivalent Estradiol EFSA : Autorité européenne de sécurité des aliments EGF : epidermal growth factor vi

11 ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay ENP : éthoxylates de nonylphénol EOP : éthoxylates d octylphénol ER α, β et γ : récepteur aux oestrogènes α, β et γ ER-CALUX : Chemical-Activated LUciferase gene expression ceu bioassay system ERE : élément de réponse aux oestrogènes ESI : Ionisation Electrospray EtP : éthyl parabène FI-lA : Flow-injection immunoassay GC : chromatographie en phase gazeuse GFP : green fluorescent protein GR : récepteurs glucocorticoïdes HAP : hydrocarbures polyaromariques her : récepteur humain des estrogène HRE : Hormone Receptor Element HRMS : spectrométrie de masse haute résolution IC : chromatographie ionique IGF-1 : insulin-like growth factor ITP : Inositol triphosphate IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry LBD : Ligand Binding Domain LC : chromatographie en phase liquide LH : hormone lutéinisante LOD : limite de détection LOQ : limite de quantification LYES : Lyticase assisted Yeast Estrogen Screen MAP kinase : Mitogen-activated protein kinase MeP : méthyl parabène MIP : Polymères à Empreinte Moléculaire MPA : medroxyprogesterone acetate MS : spectrométrie de masse MS/MS : spectrométrie de masse en tandem NLS : localisation nucléaire NP : nonylphénol NQE : normes de qualité environnementale OMS : Organisation Mondiale de la Santé OTA : ochratoxine A PAE : Esters de l acide phtalique PBDE : Ethers diphényles polybromés PCB : polychlorobiphényles PCDD : Dibenzo-p dioxines polychlorées PCDF : Dibenzofuranes polychlorés PE : perturbateur endocrinien POP : polluants organiques persistants PPSP : produits pharmaceutiques et de soins personnels PR : récepteurs de la progestérone PrP : propyl parabène REACH : Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals vii

12 RIA : Radioimmunoasay RNs : récepteurs nucléaires stéroïdiens RXR : récepteur X des rétinoïdes SERM : Selective Estrogen Receptor Modulator SPR : Surface plasmon résonance STEP : Station d'épuration des eaux usées T : testostérone TBBA :Tetrabromobisphénol A TBT : tributylétain ThR : récepteur de l'hormone de la thyroïde TIRF : Total internal reflection fluorescence microscope UV : ultra-violet Vg : vitellogénine XRE : éléments de réponse aux xénobiotiques YES : Yeast Estrogen Screen viii

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14 Introduction Depuis plusieurs années, les préoccupations concernant les effets de la pollution, générée par les activités anthropiques, sur la santé humaine et animale s immiscent de plus en plus au cœur des débats politiques et scientifiques. En particulier, la prise de conscience des autorités sanitaires, des gouvernements et du grand public, concernant la présence de substances environnementales susceptibles de perturber le système endocrinien n a cessé de progresser depuis le début des années D origine naturelle ou synthétique, les perturbateurs endocriniens (PE) peuvent altérer le fonctionnement du système hormonal des animaux et des Hommes. Ces substances pourraient donc induire des effets néfastes sur la santé d un organisme, de sa descendance, ou d une population, et constituer un danger sanitaire qui est encore aujourd hui mal évalué. Même si les effets néfastes des PE sur la santé ne sont que soupçonnés, des programmes de recherche et des groupes de travail ont été mis en place afin d évaluer l étendue des problèmes relatifs aux PE, en vue de développer des stratégies de prévention et d intervention. Ainsi, l OMS (Organisation Mondiale de la Santé) a chargé l IPCS (International Programm on Chemical Safety) de préparer un rapport décrivant l évaluation globale de la littérature scientifique sur les PE. L US-EPA (Agence de Protection Américaine de l Environnement) et l OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) ont également établi des programmes ayant comme objectifs : (i) d accroître l échange d informations et la coordination des activités de recherche relatifs aux PE; (ii) d élaborer et de réviser les lignes directrices pour les essais visant à détecter les PE; (iii) de développer des tests de criblage robustes, reproductibles et pertinents, capables de détecter les composés ayant une activité œstrogénique, anti-œstrogénique, androgénique ou antiandrogénique; (iv) et d harmoniser les méthodes de caractérisation des dangers et des risques. De ces travaux sont issues les premières recommandations ("Guidelines") 407 de l OCDE datant de 1995 qui portent sur l étude des effets des diverses substances chimiques sur un modèle animal (rongeur). Cependant, ces tests ne sont toujours pas homologués pour détecter les effets des PE du fait de leur complexité d actions (courbes dose-réponse spécifiques, impact des mélanges). De ce fait, surveiller les risques liés aux substances chimiques, en particulier les polluants qui provoquent des perturbations endocriniennes, est un des enjeux importants de la 1

15 mise en œuvre des réglementations. En témoigne le récent rapport de l'office parlementaire du sénat qui affirme que «Dans tous les cas, l'adoption de tests reconnus est un point fondamental. Il permettra de faire évoluer la législation européenne en la matière et de prendre pleinement en compte l'enjeu des perturbateurs endocriniens pour la santé et l'environnement par les agences compétentes.» (http://www.senat.fr/rap/r10-765/r html). Il est également recommandé de poursuivre la démarche d investigation sur les effets des xéno-hormones à moyen et long terme. Aujourd'hui, le sujet des perturbateurs endocriniens reste largement focalisé sur les problèmes de reproduction, notamment chez certaines espèces de poissons, et les problèmes liés à certains cancers chez l homme. Classiquement, un perturbateur endocrinien est «une substance exogène qui interfère avec la synthèse, la sécrétion, la libération, le transport, le métabolisme, la fixation, l action ou l élimination des hormones naturelles du corps responsables de l homéostasie, de la reproduction et du développement». Ces substances chimiques d'origine naturelle ou artificielle étrangères à l'organisme, pouvant interférer avec l organisme, sont dits xéno-hormones. Parmi ces dernières, se retrouvent les xéno-estrogènes qui miment l effet de l oestradiol et qui peuvent se lier aux récepteurs cellulaires de la même façon que les oestrogènes. Ces xéno-estrogènes, de nature très variée, peuvent être d origine naturelle (phyto-oestrogène, myco-estrogène) et d origine anthropique (pesticides, produits d origine industrielle, produits pharmaceutiques et de soin corporels, ). Ces substances ont des effets oestrogéniques démontrés via des tests in vitro et in vivo. Les tests in vitro sont basés sur des cellules de mammifères, des levures génétiquement transformées répondant spécifiquement à une perturbation oestrogénique. Les tests in vitro les plus utilisés sont l E-screen (cellule MCF7 exprimant le récepteur alpha aux oestrogénes) et le Yeast Estrogen Screen (levure Saccharomyces cerevisiae transfectée avec le gène codant pour le récepteur humain aux œstrogènes). Cependant, un problème majeur, dans l'utilisation de ces tests in vitro pour analyser les échantillons environnementaux, est la présence de composés inhibiteurs/cytotoxiques. Ces échantillons sont, en effet, souvent contaminés par des substances autres que les xéno-estrogènes qui peuvent interférer avec la croissance et la viabilité des cellules animales. En revanche cette cytotoxicité est moindre pour les levures, ce qui leur confère une meilleure fiabilité pour le dosage de l activité oestrogéno-mimétique des échantillons environnementaux (eaux usées, eaux de surface). 2

16 Concernant le dosage de l activité oestrogénique par des tests in vivo, les modèles vivants utilisés sont principalement des rongeurs (poids des organes génitaux) et des poissons (taux de production de la protéine vitellogénine, biomarqueur de l activité oestrogénique). Les essais in vivo présentent l avantage de mesurer l impact réel de la perturbation (effet additif, synergique, inhibiteur etc..) sur des organismes vivants. Ils permettent d intégrer le métabolisme et donc d étudier la dégradation d un produit actif ou la transformation d un produit inactif en produit actif. Deux types de tests in vivo existent pour mesurer une activité oestrogénique ou androgénique : le test utérotrophique chez la souris ou la rate et le test de Hershberger chez le rat. Concernant la préservation de la qualité des milieux aquatiques, la DCE (2000) a fixé un certain nombre de polluants (substances prioritaires) à surveiller en précisant des normes de qualité environnementales en fonction des masses d eau. Cependant, la DCE ne prend pas en compte la mesure des effets potentiels des substances (notamment l effet oestrogénique) même si ces substances sont classées CMR (Cancérogènes, Mutagènes et toxiques pour la Reproduction) et PBT (Persistantes, Bio-accumulables et Toxiques). La détection de ces substances prioritaires s effectue classiquement par des méthodes d analyse physico-chimique de laboratoire qui répondent aux exigences des seuils de qualité environnementale mais ne sont pas compatibles avec des systèmes de gestion et d alerte sur site. Par contre, dans une optique d anticipation de pollutions accidentelles ou de dégradation du milieu aquatique, des systèmes tels que les biocapteurs sont tout à fait pertinents et peuvent apporter des informations complémentaires aux mesures réalisées en laboratoire. Ces dernières années, les recherches portent sur le développement de biocapteurs pour l analyse de polluants dans des matrices environnementales (triazines, isoproturon, DDT et ses dérivés, bisphénol A, nonylphénol, ). Ces biocapteurs associent un biorécepteur, espèce biologique permettant la reconnaissance sélective de la molécule cible, et un transducteur permettant de détecter et/ou de quantifier les substances dans les eaux (eaux potables, eaux de surface notamment). Dans ce contexte, ce travail de thèse aborde plusieurs approches permettant d évaluer la perturbation oestrogénique (observation in vivo et mesure in vitro avec le YES) et de détecter des xéno-estrogènes spécifiquement (biorécepteur affine). Cette thèse s articule autour de 3 volets d étude : 3

17 1 Un premier volet porte sur l investigation des effets des xéno-hormones sur les écosystèmes en identifiant, tout d abord, l impact des perturbateurs oestrogéniques sur les malformations squelettiques observées chez une espèce de poisson autochtone (aphanius faciatus) du Golfe de Gabes (Tunisie). Parallèlement, les principaux polluants chimiques (métaux, HAP) liés potentiellement à cette perturbation ont été recherchés afin de corréler leur présence aux activités anthropiques (urbaines, agricoles et industrielles) présentes sur le site étudié. 2 Un deuxième volet se focalise sur la quantification par HPLC de parabènes, xénooestrogènes connus, soupçonnés de provoquer certains cancers, et sur l évaluation de leurs effets en utilisant le Yeast Estrogen Screen (YES). Le YES permet d évaluer l activité oestrogénique des matrices complexes comme les effluents de station d épuration. La distribution des parabènes entre différents compartiments/fractions (eau, boues, MES) et l activité oestrogénique au niveau de stations d'épuration tunisiennes ont été analysées en combinant des évaluations chimiques et biologiques. Dans l optique de mettre en évidence les effets oestrogéniques de substances d origines industrielles, d autres composés (colorants textiles et alimentaires) ont été testés en utilisant le YES. En effet, ces colorants sont susceptibles d être présents dans des effluents industriels et peuvent impacter le milieu récepteur, notamment pour les pays où l industrie textile est fortement développée (Pays du Maghreb, Inde, ). 3 Enfin, la dernière partie du manuscrit est consacrée à la mise au point d un outil bio-analytique de substance spécifique. Cette partie est novatrice car elle porte sur le développement d un bio-récepteur de nature peptidique pour détecter des myco-oestrogènes, comme l ochratoxine A. Cette mycotoxine étant difficilement immunogène, il n existe que de rare anticorps spécifiquement dirigés contre cette molécule. Les (bio)récepteurs alternatifs développés jusqu à présent sont des aptamères ADN et des MIP (polymère à empreinte moléculaire) qui ont une affinité pour la mycotoxine. Ce manuscrit est classiquement structuré et comprend : - Un premier chapitre présentant une synthèse bibliographique qui décrit les mécanismes de la perturbation endocrinienne, les perturbateurs endocriniens (xéno-hormones d origine naturelle et anthropique), l état de l art sur les altérations des écosystèmes dues aux 4

18 PE et les différentes méthodes de détection des effets et des xéno-hormones (effets oestrogéniques, biocapteurs). Un focus sur les parabènes, les mycotoxines et les colorants permet d établir un constat sur leur présence dans les eaux. - Un second chapitre basé sur 5 publications ouvre sur une discussion à partir des principaux résultats concernant la mesure des effets oestrogéniques in vivo et in vitro et le développement d un biorécepteur affine pour l ochratoxine A. Par conséquent, la partie «matériel et méthodes» est incluse dans chacun des articles. - Une conclusion met en valeur les résultats majeurs et aborde les perspectives de ce travail de thèse. 5

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20 Chapitre I : Synthèse bibliographique 2

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22 I. Contrôle de la qualité de l eau et des rejets : micropolluants à activité endocrinienne et législation européenne. Il est généralement admis qu un polluant est «un altéragène (c'est-à-dire un composé étranger aux cycles vitaux des organismes ou xénobiotiques) biologique, physique ou chimique, qui au-delà d'un certain seuil, et parfois dans certaines conditions (potentialisation), développe des impacts négatifs sur tout ou partie d'un écosystème ou de l'environnement en général» (AFNOR). On parlera de micropolluants lorsque ces substances sont retrouvées à des concentrations de l ordre du microgramme par litre, pouvant diffuser au sein de différents compartiments des écosystèmes et impacter les organismes vivants même à de faibles teneurs. Les polluants chimiques peuvent se diviser en 2 groupes : - Les polluants organiques comme les pesticides (organochlorés tel que le DDT), les polychlorobiphényles (PCB), les hydrocarbures polyaromatiques (HAP), les dioxines et furannes, les chlorofluocarbones (CFC) et les phtalates. - Les polluants inorganiques comme les métaux. Les plus fréquemment rencontrés dans l environnement sont le cadmium, l arsenic, le cuivre, le plomb etc Les micropolluants présents dans l eau correspondent à une multitude de composés dont les effets sur les organismes vivants peuvent être toxiques à de très faibles concentrations (inférieures ou de l ordre du microgramme par litre). La contamination des eaux de surface par ces polluants est due essentiellement à des rejets directs (égouts non raccordés à un système d épuration, par exemple), à un dysfonctionnement des stations d épuration, à des rejets industriels ou au ruissellement de l eau sur des surfaces contaminées. Les eaux souterraines sont, quant à elles, potentiellement contaminées suite à l infiltration des micropolluants dans le sol et le sous-sol. On distingue les apports ponctuels où les sources de pollution sont clairement identifiées (rejets industriels, pollution accidentelle, rejets des eaux usées domestiques), des sources diffuses liées principalement aux activités agricoles, touristiques et aux retombées atmosphériques. Les effets des micropolluants sur les écosystèmes aquatiques sont très variables, car ils ne dépendent pas uniquement du niveau de concentration dans l eau, mais également d autres caractéristiques, comme par exemple, le mode de pénétration dans les organismes, leurs actions sur des systèmes physiologiques etc 6

23 Pour protéger les ressources (eau de surface ou eau souterraine), des actions ont été engagées au travers de la loi sur l eau du 3 Janvier 1992 (LOI n 92-3 du 3 janvier 1992 sur l'eau, JORF n 3 du 4 janvier 1992 page 187 puis plus récemment, la Directive Cadre sur l eau (DCE) a été élargie à l échelle européenne un cadre réglementaire pour assurer la préservation des écosystèmes aquatiques et le maintien de la qualité des eaux (2000/60/CE du 23 octobre 2000). Ces différentes actions ciblant au départ une réduction des flux de polluants organiques ont été étendues à la réduction des rejets de substances toxiques et à la limitation d émission des micropolluants comme les pesticides ou des macropolluants tels que le phosphore ou l azote jusqu à aboutir à la DCE établissant un cadre pour atteindre un bon état des eaux en Ce cadre vise également une réduction progressive des rejets et des émissions de substances prioritaires jusqu à une suppression de ces substances d ici Cette directive établit des normes de qualité environnementale (NQE) et limite la concentration de trente-trois substances et de huit autres polluants dans les eaux de surface (tableau 1). Cette liste comprend onze substances dangereuses prioritaires, qui sont toxiques, persistantes et qui s accumulent dans les tissus animaux et végétaux. Ces substances présentent un risque à long terme, il s agit plus particulièrement des métaux lourds, des pesticides et des hydrocarbures. Cependant, la DCE ne prend pas encore en compte l effet de ces substances prioritaires sur les écosystèmes et les humains notamment la perturbation endocrinienne. En effet, la perturbation endocrinienne correspond à l altération de la fonction endocrine par un agent exogène qui interfère avec la production, le métabolisme, le transport, la libération, la liaison, l action ou l élimination des ligands naturels responsables du maintien de l homéostasie et de la régulation du développement de l organisme. Or, comme présenté tableau 1, certaines substances prioritaires, déjà soumises à des interdictions ou prises en compte dans des réglementations européennes via la législation sur les pesticides, via la Directive Cadre et via la législation REACH (en référence à leur caractère CMR : Cancerigène, Mutagène, Reprotoxique), ont potentiellement des effets sur le système endocrinien. De ce fait, dans le cadre de la «Stratégie communautaire concernant les perturbateurs endocriniens», la Commission Européenne a constitué une liste de 60 substances prioritaires parmi plus de 550 suspectées de perturber le système endocrinien. De la même façon, 21 substances sur les 33 notifiées par la DCE ont été identifiées comme perturbateurs endocriniens potentiels (tableau 1). Mais la question de l évaluation de l impact des polluants ayant des effets perturbateurs endocriniens dans l environnement est soulevée 7

24 dans le cadre des réglementations récentes. En effet, lors de la Conférence environnementale de 2012, le gouvernement français s est engagé à élaborer une stratégie nationale sur les perturbateurs endocriniens et le Parlement Européen «envisage la mise en œuvre d une nouvelle législation au plus tard en Juin 2015 afin de réexaminer de manière approfondie les règles actuelles relatives aux perturbateurs endocriniens» (Résolution du Parlement européen du 14 mars 2013 sur la protection de la santé publique contre les perturbateurs endocriniens (2012/2066(INI)), ). Des études complémentaires sont actuellement en cours pour permettre à la Commission d étudier la prise en compte de ces composés dans les futures règlementations. 8

25 Tableau 1 : Substances prioritaires de la DCE et leurs effets endocrinniens. N UE (1) N UE DCE (2) Nom de la substance N CAS (Chermical Abstracts Service) Effet perturbateur endocrinien 1 Alachlore Liaison compétitive aux récepteurs d'oestrogènes et de la progestérone. Interactions avec le récepteur cellulaire pregnane X, interférant avec la production des enzymes responsables du métabolisme des hormones stéroïdes Référence Mikamo et al., 2003 Cocco et al., Anthracène Liaison avec le récepteur des oestrogènes Schneider et al., 1976 Pasqualini et al., Atrazine L'inhibition des androgènes avec un faible effet oestrogénique. Perturbation du contrôle hypothalamique au niveau d'hormones et de la prolactine. Induction de l'activité de l'aromatase Dommages au niveau des glandes surrénales dommages et réduction du métabolisme des stéroïdes. 7 4 Benzène Cocco et al., 2002 Cooper et al., 2000 Hayes et al., Pentabromodiphényéther Altérations du fonctionnement du système thyroïdien Petrović et al., Cadmium et ses composés 7 C chloroalcanes Le cadmium est un puissant oestrogène et androgène in vivo et in vitro, il interagit directement avec les récepteurs des oestrogènes et des androgènes Takiguchi et al., Chlorfenviraphos Faible effet oestrogénique Vinggaard et al., Chlorpyrifos Activité antagoniste aux androgènes. Kang et al., ,2-dichluroéthane Dichlorométhane _ Di(2-éthylhexyl)phtalate I Induction des niveaux sériques de la testostérone Ge et al., 2007 (DEHP). 13 Diuron Activité inhibitrice des androgènes Thibaut et al., Endosulfan Liaison compétitive aux récepteurs d'androgènes, activité oestrogénique, stimulation de la production du récepteur des oestrogènes, inhibition de l'activité de l'aromatase Andersen et al., 2002 Lemaire et al., Fluoranthène Agoniste du récepteur des oestrogènes Plíšková et al., 2005 Vondráček et al., Hexachlorobenzène Altération du récepteur des oestrogènes et du Src/HER1 Peña et al., Hexachlorobutadiene Néphrotoxique Green et al., Hexachlorocyclohexane Réduction du cycle œstral et des concentrations de progestérone. Augmentation des concentrations sériques d'insuline et d'oestradiol, diminution des concentrations de thyroxine. Liaison compétitive aux récepteurs aux androgènes, oestrogènes et progestérone. Rawlings et al., 1998 Beard et al.,

26 N UE (1) N UE Nom de la substance N CAS Effet perturbateur endocrinien Référence DCE (2) (Chermical Abstracts Service) 19 Isoproturon Activation du récepteur cellulaire Pregnane X Lemaire et al., Plomb et ses composés ,-1 Iavicoli et al., Mercure et ses composés Interfère avec la spermatogenèse et influence les niveaux des hormones reproductives physiologiques Iavicoli et al., Naphthalène Nickel et ses composés Erα agoniste Darbre, Nonylphénols Activation du récepteur cellulaire Pregnane X Masuyama et al., Octylphénol Xéno-oestrogène Oehlmann et al., Pentachlorobenzène Inhibe la production des hormones thyroïdes Cocco et al., Pentachlorophénol Faible activité estrogénique et anti-androgénique Cocco et al., 2002 Benzo(a)pyrène S Changements dans l'expression des gènes stéroïdogènes des testicules chez les rats à divers stades de développement Liang et al., 2012 Benzo(b)fluoranthène AhR agoniste Kummer et al., 2001 Benzo(g,h,i)pérylène Indéno(1,2,3-cd)pyrène Simazine Induction de l'activité de l'aromatase et augmentation de la production des oestrogènes Sanderson et al., 2000 Composés du M-73-3 Inhibe de façon compétitive la conversion des androgènes en oestrogènes. Inhibe la production de certains Thibaut et al., tributylétain androgènes 117 Trichlorobenzènes (tous les isomeres) Trichlorométhane Trifluraline Interagit avec le récepteur cellulaire de pregnane X, interférant avec la production d'enzymes responsables du métabolisme des hormones stéroïdes. DDT total Sans objet Imite l'action des oestrogènes, antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en p-p -DDT inhibant la transcription génétique qu'ils induisent. Favorise la prolifération des cellules sensibles aux androgènes. Imite les actions des oestrogènes indirectement en stimulant la production de leurs récepteurs Eriko et al., 2003 McKinlay et al., Aldrine Antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en inhibant la transcription génétique qu'ils induisent Dieldrine Antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en inhibant la transcription génétique qu'ils induisent Imite les actions des oestrogènes indirectement en stimulant la production de leurs récepteurs Endrine Antagonise l'action des androgènes par liaison compétitive à leurs récepteurs et en inhibant la transcription génétique qu'ils induisent Isodrine Lemaire et al., 2004 Lemaire et al., 2004 Lemaire et al.,

27 N UE (1) N UE DCE (2) Nom de la substance N CAS (Chermical Abstracts Service) Effet perturbateur endocrinien 13 6 Tétrachlorure de carbone Perturbateur endocrinien non listé INERIS Tétrachloroéthylène Trichloréthylène (1) N UE : nombre mentionné correspondant au classement par ordre alphabétique issu de la communication de la Commission européenne au Conseil du 22 juin (2) N UE DCE : nombre mentionné corresponantd au classement issu de l'annexe X de la DCE Référence 11

28 Pour mieux comprendre les enjeux qui résident dans l établissement de critères scientifiques permettant d identifier les substances dites «perturbateur endocrinien» en vue de leur éventuelle interdiction, il convient d expliquer succinctement le fonctionnement du système hormonal. II. Mécanismes de la perturbation endocrinienne A. Fonctionnement du système hormonal Les animaux pluricellulaires possèdent deux mécanismes de coordination des activités des tissus et des organes : la communication nerveuse et la communication hormonale. La première sert à coordonner les mouvements grâce à la propagation de signaux électriques entre cellules nerveuses, la seconde, par un transfert de signaux chimiques, permet de réguler l'activité d'un ou plusieurs organes ou organismes en modifiant le comportement et les interactions. Figure 1 : Système endocrinien chez l homme Ces substances chimiques «médiatrices» dites hormones sont sécrétées par les glandes endocrines et sont transportées par le système de circulation générale (le sang) pour exercer une action spécifique sur des cellules cibles. Les glandes endocrines (figure 1), telles que la thyroïde, les gonades, l hypophyse, les surrénales, le pancréas endocrine, sécrètent des hormones comme la thyroxine, l oestrogène et la testostérone, l adrénaline, l insuline. Ces substances sont des messagers chimiques qui, en se liant à des récepteurs avec une grande affinité, vont induire des réactions spécifiques et réguler la croissance, le métabolisme, le 12

29 comportement et le développement, incluant le développement sexuel et la reproduction. Le tableau 2 présente les différentes fonctions nécessitant des hormones pour développer des actions vitales pour l'organisme. Tableau 2 : Relation entre les hormones endocrines et les réponses correspondantes (Ministère de l Ecologie et du Développement Durable, Décembre 2003) Fonctions Hormones Réponses Reproduction Croissance et développement Maintien de l'environnement interne Disponibilité énergétique Androgènes, oestrogènes, progestérone, hormones hypophysaires (LH, FSH, prolactine). Hormones de croissance, hormones thyroïdiennes, insuline, glucocorticoïde, androgènes, oestrogènes, progestérone. Vasopressine aldostérone, hormone parathyroïdienne progestérone. Insuline, glucagon, hormones thyroïdiennes. Production de gamètes, facteurs de croissance, lactation, gestation. Instauration des caractéristiques secondaires et du comportement sexuel. Large action sur la croissance. Contrôle du volume et de la pression. Contrôle de la balance des électrolytes. Contrôle des os, des muscles et de la graisse. Régulation du métabolisme. Les organes effecteurs, organes cibles de l activité hormonale, possèdent, au niveau de leur cellule, des molécules fixant l hormone (récepteurs spécifiques de l hormone). Les cellules possèdent différents récepteurs et peuvent donc reconnaître plusieurs types d hormone. Ces récepteurs peuvent être présents sur la membrane d'une cellule (récepteurs membranaires). C'est le cas des récepteurs d'hormones peptidiques qui sont souvent des protéines transmembranaires de type récepteurs couplés aux protéines G, récepteurs sensoriels ou récepteurs ionotropes. Ces récepteurs peuvent produire trois types de réponse cellulaire : a- une réponse électrophysiologique correspondant aux récepteurs canaux-ioniques, b- une réponse métabolique responsable de modifications post-traductionnelles des protéines, c- une réponse transcriptionnelle activant ou inhibant l'expression de certains gènes. 13

30 Généralement ces types de réponse se traduisent par la production d'un ou plusieurs intermédiaires intracellulaires dits messagers secondaires comme l adénosine monophosphate cyclique ou AMP cyclique (AMPc) ou par l intermédiaire de cascades de phosphorylations. Les récepteurs peuvent être des récepteurs nucléaires intervenant dans la modulation de la transcription des gènes impliqués dans la prolifération, la différenciation cellulaire, le développement, l homéostasie et le métabolisme (Gronemeyer et al 2004). Ce sont des protéines solubles activées par la liaison de la molécule informative. Ils sont normalement localisés dans le noyau. Mais il existe des exceptions comme pour les récepteurs stéroïdiens (récepteurs des glucocorticoïdes, des oestrogènes ou des androgènes) qui sont situés dans le cytosol en absence de ligand et la liaison de ce dernier induit la translocation du récepteur dans le noyau. B. Récepteurs stéroïdiens sexuels 1) Organisation structurelle Les stéroïdes participent au développement des vertébrés et à l accomplissement de plusieurs fonctions physiologiques. Les récepteurs des hormones stéroïdiennes sont des récepteurs nucléaires et sont constitués de trois sections formant les principales régions du récepteur thyroïdien comme illustré figure 2 (Bain et al., 2007) : - La région N-terminal (A-B) comprend 20 acides aminés pour le récepteur de la vitamine D et 600 acides aminés pour celui des minéralo-corticoïdes. Cette région contient un activateur de la transcription AF1 (Activation Function) agissant de façon constitutive indépendamment du ligand. - La région C, domaine de liaison à l ADN, dit le DBD (DNA Binding Domain), comprend 8 cystéines en position stable qui permettent la formation de deux structures en «doigts de zinc». Ce domaine est essentiel à l'activation de la transcription. La fixation du ligand entraîne un changement dans la configuration du récepteur permettant la liaison à une séquence HRE (Hormone Receptor Element) sur le gène cible. La spécificité de liaison du récepteur à son HRE est déterminée par le premier domaine protéique en «doigt de zinc». Le second domaine en «doigt de zinc» permet la dimérisation du récepteur. - La région D, située entre le domaine de liaison à l ADN et la région E, correspond au domaine de fixation de l'hormone, et permet le contrôle du transit du récepteur à partir du 14

31 cytoplasme où il est synthétisé, vers le noyau. Cette région est également un site de rotation permettant des modifications spatiales. - La région E/F, domaine de liaison à l'hormone, le LBD (Ligand Binding Domain) est située à l'extrémité carbonylée du récepteur. Cette région permet, outre la liaison à l'hormone, la dimérisation des récepteurs et l'activation de la transcription par une zone fonctionnelle appelée AF2. C'est aussi l'endroit de liaison aux protéines chaperonnes. Contrairement à AF1, l'activité de l AF2 dépend totalement de la fixation de l'hormone au récepteur (Drummond 2006). Figure 2 : Organisation structurelle des récepteurs stéroïdiens Les récepteurs stéroïdiens sont divisés en trois groupes (tableau 3) en fonction des hormones qui se lient comme les oestrogènes, la progestérone, la testostérone, les glucocorticoïdes et les minéralo-corticoïdes. Tableau 3 : Récepteurs des hormones stéroïdes Sous Famille : Récepteur des hormones stéroïdes Groupe A : Récepteur des oestrogènes 1- Récepteur des oestrogènes-α (ERα; NR3A1) (hormone sexuelle : oestrogènes) Groupe B : récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes 2- Récepteur des oestrogènes-β (ERβ; NR3A2) 1- Récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes-α (ERRα; NR3B1) 2- Récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes-β (ERRβ; NR3B2) 3- Récepteur liés aux récepteurs des oestrogènes-γ (ERRγ; NR3B3) Groupe C : Récepteurs des 3-ketostéroïdes 1- Récepteur des glucocorticoïdes (GR; NR3C1) (Cortisol) 2- Récepteur des minéralocorticoïdes (MR; NR3C2) (Aldostérone) 3- Récepteur de la progestérone (PR; NR3C3) (hormone sexuelle : Progestérone) 4- Récepteur des androgènes (AR; NR3C4) (hormone sexuelle : Testostérone 15

32 2) Récepteur aux oestrogènes : ER Le récepteur aux oestrogènes (ER) est un membre de la famille des récepteurs nucléaires dont la fonction, médiée par l oestradiol, est l activation de la transcription de gènes impliqués notamment dans la croissance, la différenciation cellulaire et les fonctions reproductrices. Il existe trois formes de récepteur aux oestrogènes : ERα, ERβ et ERγ (ou ERβa). Les isotypes α et β sont retrouvés chez toutes les espèces alors que l isotype γ n a été identifié que chez certaines espèces de poissons (Hawkins et al., 2000; Ma et al., 2000; Menuet et al., 2002). Afin d assurer sa fonction de facteur de transcription, le récepteur aux oestrogènes, une fois traduit dans le cytoplasme, doit se diriger vers le noyau. Celui-ci met en jeu les importines (transporteurs) présentes au sein des pores nucléaires qui reconnaissent les signaux de localisation nucléaire (NLS : Nuclear Localization Signal) portés par le récepteur. Jusqu au début des années 1980, le modèle classique d action des récepteurs aux hormones stéroïdiennes proposait que les récepteurs étaient exclusivement cytoplasmiques en l absence de ligand et n étaient dirigés vers le noyau qu en présence de celui-ci (Jensen et al., 1968). Il est clair aujourd hui que l isotype α du récepteur aux oestrogènes est nucléaire et cette localisation est indépendante de la présence de l hormone (Stenoien et al., 2000 a et b). 3) Mécanismes d action du récepteur aux oestrogènes Les récepteurs aux oestrogènes peuvent agir selon deux mécanismes différents. Le premier permet de réguler la transcription des gènes cibles par le biais de la fixation du récepteur intracellulaire à son élément de réponse aux oestrogènes (ERE) au sein du promoteur de gènes cibles ou par des interactions protéine-protéine; ce mécanisme est communément appelé mécanisme génomique. Il existe 3 voies de signalisation génomique (figure 3) : 1- La voie classique ou ERE-dépendant (voie1), 2- La voie ERE-indépendante (voies 2 et 3), 3- La voie ligand-indépendante (voie 4). Comme présenté figure 3, pour la signalisation classique (voie 1), le récepteur ER liganté à l oestradiol (E2) se lie sous forme dimérique à une séquence spécifique dite ERE. Dès lors, des coactivateurs sont recrutés ainsi que la machinerie transcriptionnelle et le tout aboutit alors à l activation de la transcription du gène cible. Concernant les voies ERE- 16

33 indépendantes (voies 2 et 3, figure 3), le complexe ER-E2 peut induire la transcription des gènes cibles en se liant directement à des protéines spécifiques Sp1 ou AP-1 (formé des protéines c-fos et c-jun) liées respectivement à des domaines nucléotidiques riches en glutamine ou TRE (TPA (12-Otetradecanoylphorbol 13-acetate) Response Element) (Krishnan et al., 2010). La troisième voie de signalisation génomique est ligand-indépendant (voie 4, figure 3). Cette activation est produite principalement par des facteurs de croissance comme l EGF (Epidermal Growth Factor) et l IGF-1 (Insulin-like Growth Factor). Ceux-ci phosphorylent le récepteur des oestrogènes au résidu de sérine 118 par l intermédiaire de la MAP kinase. Le récepteur interagit avec le coactivateur p68 RNA hélicase et active la transcription du gène en interagissant avec l ERE (Flint et al., 2002; Moore et Faller 2013; Koterba et Rowan 2006; Kallen et al., 2004). Le second mécanisme est non-génomique. Les stéroïdes, agissant par l intermédiaire de récepteurs membranaires, entraînent une cascade de réactions dont des phosphorylations et modulent des fonctions physiologiques rapides telles que la régulation du flux calcique. 4 Figure 3: Différentes voies de signalisation cellulaire du récepteur ER et de l oestradiol. Il existe trois voies de signalisation génomique: Voie 1 : La voie classique ou ERE-dépendant, Voies 2 et 3 : voies ERE-indépendante, Voie 4 : voie ligand-indépendante. Il y a une voie de signalisation non-génomique (Le Grand, thèse de doctorat 2009). 17

34 III. Définition des perturbateurs endocriniens : un débat d actualité Ce terme est apparu dans la littérature scientifique depuis 1993 (Colborn et al., 1993). Pourtant la définition des «perturbateurs endocriniens» ou PE n est toujours pas arrêtée et fait encore débat (Sénat français, juillet 2011). Une première définition a été proposée par Kavlock et al., (Kavlock et al., 1996 ) : «Un perturbateur endocrinien est une substance exogène qui interfère avec la synthèse, la sécrétion, la libération, le transport, le métabolisme, la fixation, l action ou l élimination des hormones naturelles du corps responsables de l homéostasie, de la reproduction et du développement». Un perturbateur endocrinien (PE) est défini en 1998 par l Agence de protection de l environnement des USA (EDSTAC, 1998) comme un agent exogène (substance chimique d origine naturelle ou artificielle) ou un mélange de substances exogènes qui agissent sur le système endocrinien et qui ont des effets néfastes au niveau d un organisme intact, de sa progéniture et/ou des (sous)-populations. Au cours du congrès européen sur les perturbateurs endocriniens (European Commission, 1997), une autre définition a été proposée : «un perturbateur endocrinien est une substance exogène qui provoque des effets néfastes sur un organisme sain ou sa progéniture dus à une modification des fonctions endocrines». Quoi qu il en soit, identifier un perturbateur endocrinien revient donc à identifier une molécule pouvant être reliée à une activité hormonale; si elle se lie au récepteur ou si elle modifie l action de certaines hormones, elle peut être considérée comme un perturbateur endocrinien. Mais pour certaines substances, ayant une activité plus ou moins importante sur le système endocrinien, l EFSA (Autorité européenne de sécurité des aliments) a proposé de distinguer deux groupes de molécules : celles qui produisent des effets délétères et celles qui suscitent une réponse de l organisme non problématique ou encore qui produisent des effets adaptatifs (Sénat français, 12 juillet 2011). Cette définition revient à adopter celle établie par l OMS (Organisation Mondiale de la Santé) en 2002 qui définit les perturbateurs endocriniens comme étant des «substances chimiques d'origine naturelle ou artificielle étrangères à l'organisme qui peuvent interférer avec le fonctionnement du système endocrinien et induire ainsi des effets délétères sur cet organisme ou sur ses descendants» (Sénat français, 12 juillet 2011). De ce fait, une xéno-hormone (ou speudo-hormone) n est pas une hormone véritable, mais est une substance naturelle ou synthétique qui se comporte comme une hormone. Les 18

35 xéno-estrogènes sont des substances qui «miment» l oestradiol, hormone naturelle, et qui peuvent se lier aux récepteurs cellulaires de la même façon que les oestrogènes. A. Mécanismes de la perturbation endocrinienne De nombreuses molécules de l environnement ont la capacité de modifier le fonctionnement du système endocrinien. Étant donnée la diversité des fonctions physiologiques impliquant le système endocrinien, les mécanismes par lesquels ces substances peuvent perturber le système endocrinien sont complexes. En effet, les perturbateurs endocriniens (PE) peuvent agir sur le système endocrinien en interférant à plusieurs niveaux : synthèse, stockage et libération des hormones, transport, métabolisme, ou encore liaison avec les récepteurs nucléaires constituant les cibles naturelles des hormones. Les perturbateurs endocriniens peuvent interférer avec le fonctionnement du système hormonal de différentes façons (figure 4) : a. Ils peuvent imiter l action d une hormone naturelle. Ils se fixent alors sur le récepteur cellulaire et entraînent une réponse normale : effet agoniste. b. Ils peuvent se lier au récepteur hormonal et empêcher l émission d un signal. Ils entravent alors l action des hormones : effet antagoniste. Le plus souvent, ces mécanismes d action des PE résultent d une combinaison des deux mécanismes agoniste et antagoniste. Les autres modes d'action des PE peuvent être de perturber la synthèse, le transport, le métabolisme et la sécrétion des hormones, altérant ainsi les concentrations des hormones naturelles dans l'organisme. 19

36 Figure 4 : Modes d action des perturbateurs endocriniens ; Pol II pour ARN Polymérase II En conséquence, la classification des perturbateurs endocriniens a été effectuée en fonction de leur activité connue ou soupçonnée par rapport aux récepteurs hormonaux, et des mécanismes de perturbation car leurs cibles sont multiples comme l indique le tableau 4. Il est, en effet, difficile voire impossible de classer les PE en fonction de leur structure chimique. Tableau 4 : Cibles des perturbateurs endocriniens (sénat francais, rapport 12 Juillet 2011) 20

37 B. Xéno-hormones et récepteur aux oestrogènes a. Interaction directe avec les récepteurs hormonaux nucléaires : Action génomique des perturbateurs endocriniens Le mécanisme d action génomique le plus connu est la liaison du perturbateur endocrinien aux récepteurs nucléaires stéroïdiens (RNs) tel un imposteur (xéno-hormone), modifiant l expression des gènes comme facteurs de transcription. Après fixation des xéno-hormones, les RNs exercent leurs activités génomiques en tant que facteurs de transcription qui reconnaissent des séquences ADN spécifiques, au niveau de promoteurs de leurs gènes cibles, en activant (effet agoniste) ou en inhibant (effet antagoniste) illégitimement l expression des gènes. Parmi ces récepteurs stéroïdiens la majeure partie des PE décrits sont les molécules ayant des effets oestrogéniques et sont capables de mimer l effet biologique du 17 β œstradiol et de cibler les récepteurs aux oestrogènes (ER) (Wilson et al., 2007; Le et al., 2003). Les xéno-oestrogènes peuvent aussi illégitimement activer le récepteur nucléaire des oestrogènes. Ils agissent comme l oestradiol, par une voie classique qui suppose la dimérisation du récepteur alpha (ERα) ou du récepteur béta (ERβ), les deux isoformes du récepteur aux oestrogènes. Ce dimère reconnait les éléments de réponse localisés sur les promoteurs de gènes cibles (figure 5) et induit leur transcription. Figure 5 : Activation illégitime du récepteur des oestrogènes (d après Massaad et Barouki, 1999) (RE : récepteur des oestrogènes; ERE : Elément de réponse aux oestrogènes) 21

38 Les xéno-hormones peuvent être agonistes, antagonistes ou agoniste/antagoniste. En réalité, leur mécanisme d action est mieux compris s il est comparé à celui d agents pharmacologiques appelés SERM (Selective Estrogen Receptor Modulator) comme le 4- hydroxythamoxifène ou encore l éthinyloestradiol présentés tableau 5. D autres molécules sont des antagonistes pures comme L ICI et l ICI (Wakeling et al., 1991; Zhu et al., 2008), ou présentent les deux modes d action pour le récepteur aux oestrogènes comme le 4-hydroxythamoxifène. Tableau 5 : Structures des trois catégories de ligands du récepteur aux oestrogènes humains. naturels Agonistes purs synthétiques 17β-Estradiol Ethynylestradiol Diethylstilbestrol Agonistes/Antagonistes mixtes Hydroxytamoxiféne 4- Antagonistes purs Raloxiféne ICI ICI

39 La grande majorité des xéno-oestrogènes sont des molécules agonistes et ils ont une meilleure affinité pour le récepteur alpha comme le nonyphénol et ses différents isomères (Arukwe et al., 2002; Gabriel et al., 2008), le cadmium (Nesatyy et al., 2006) et certains colorants alimentaires (Axon et al., 2012). Certaines molécules ont une meilleure affinité pour le récepteur béta (ERβ). C est le cas de phyto-oestrogènes comme la génistéine (chez les mammifères), la biochanine A ou la daidzéine, et la benzophénone. Dans une majorité des cas, les xéno-estrogènes ont une affinité pour les deux récepteurs alpha et béta comme le bisphénol A (Kuiper et al., 1998), les parabènes, les écrans UV (Gomez et al., 2005), le diéthylstilbestrol (DES) (exerçant une fonction agoniste et ayant une affinité importante vis-à-vis des deux isotypes du récepteur aux oestrogènes) ou le glyphosate (Thongprakaisang et al., 2013). Enfin, certaines molécules ont une activité agoniste sur le récepteur alpha (ERα) et antagoniste sur le récepteur béta (ERβ). C est le cas de pesticides comme le méthoxychlore ou le chlordécone (Le Maire et al., 2010). Ceci illustre le fait que de nombreuses molécules potentiellement retrouvées dans l environnement peuvent avoir des effets complexes sur le système hormonal. Mais les mécanismes des perturbateurs endocriniens ne se limitent pas à celui-ci. Ils peuvent également cibler le récepteur de l'hormone de la thyroïde (ThR) (Jagnytsch et al., 2006), des récepteurs glucocorticoïdes (GR) (Neel et al., 2013), des récepteurs de la progestérone (PR) (Scippo et al., 2004), le récepteur de la dioxine et des hydrocarbures aromatiques (AhR) (Jeuken et al., 2003). Ces molécules peuvent aussi cibler le récepteur des androgènes (AR) (récepteur des hormones sexuelles mâles comme la testostérone et son métabolite, la dihydrotestostérone). Ce récepteur est principalement exprimé dans le testicule, il est présent dans la prostate, les glandes surrénales, les reins, le cerveau et l hypophyse. Le rôle du récepteur AR dans les organes mâles est très similaire à celui des récepteurs ER dans les organes femelles. Les plus puissants agonistes connus sont la testostérone et son métabolite, le DHT (dihydrotestostérone) qui se lient plus fortement aux récepteurs aux androgènes et l acétate de médroxyprogestérone (MPA) (Okamoto et al., 2012; Bianco- Miotto 2014). b. Action non génomique des perturbateurs endocriniens Au-delà de la voie de signalisation classique passant par l activité nucléaire du récepteur, les perturbateurs endocriniens provoquent des effets moins classiques, par l intermédiaire de certaines voies de signalisation membranaires (notamment calcium 23

40 dépendant) suite à l activation d un récepteur membranaire. Plusieurs travaux ont permis d identifier notamment des récepteurs aux stéroïdes localisés dans la membrane cytoplasmique qui sont identiques aux récepteurs nucléaires car ils sont reconnus par les mêmes anticorps (Powell et al., 2001). Les travaux décrits dans la littérature ont montré que, les stéroïdes ou des xéno-hormones, sont capables d induire une action non génomique via un second messager après leur fixation sur les récepteurs membranaires ou sur leurs isoformes (Falkenstein et al., 2000). En effet, de nombreuses études ont été réalisées sur l activité non génomique des xéno-oestrogènes notamment pour expliquer leur rôle dans des disfonctionnements physiologiques, métaboliques et dans des déficits fonctionnels à court terme et à long terme au niveau de la cellule et des tissus (tératogenèse et cancer) (Watson et al., 2007; Watson et al., 2013, Hisamoto et al., 2001 ). Il a été montré, par exemple, que l œstradiol (E2) peut se lier au récepteur ERα membranaire (identique au récepteur ERα nucléaire) et induire une cascade de protéines kinase qui aboutit à la division cellulaire (Falkenstein et al., 2000; Bulayeva et al 2004; Watson et al., 2005). Il est aussi impliqué dans l activation de la production d AMPc et d IP3 (inositol triphosphate) dans certains tissus (Grove et Korach, 1987; Ignar-Trowbridge et al., 1991; Aronica et al., 1994; McEwen et Alves, 1999). Certains xéno-estrogènes comme le diéthylstilbestrol, le coumestrol, le bisphénol A, ou le nonylphénol, induisent des réponses non génomiques par des voies très diverses qui peuvent, par exemple, conduire à l activation des voies des MAP kinases (Watson et al., 2007; Watson et al 2010). Un schéma simplifié des voies de signalisation contrôlées par le récepteur des oestrogènes membranaire et cytoplasmique est présenté figure 6. Ces activités non génomiques sont extrêmement rapides, elles se déroulent dans les minutes qui suivent l activation du récepteur membranaire et ne sont pas affectées par les inhibiteurs de la transcription ou de la synthèse protéique tels que l actinomycine D ou le cycloheximide (Jagla, 2007). Cependant ces activités restent ligands dépendantes, étant donné que l administration d un ligand antagoniste permet leur inhibition. De telles activités ont été, entre autres, décrites pour le AR (Baron et al., 2004) et le PR (Boonyaratanakornkit et al., 2001 ). Ces effets peuvent d'ailleurs avoir des conséquences sur la régulation de gènes. 24

41 Figure 6 : Voies de signalisation des oestrogènes médiées par les récepteurs membranaires et nucléaires. Les voies classiques (I et II) dépendent de l interaction directe de l oestrogène avec ER. Les voies non-classiques (III et IV) dépendent l interaction avec un récepteur non-stéroïdien (III) ou avec un ER (IV) membranaire (Lorenzo et al., 2003) De la même manière, l interférence des xéno-hormones dans le métabolisme des hormones peut avoir des effets qui s additionnent à ceux engendrés par leur activité agoniste ou antagoniste. L activité de presque toutes les enzymes impliquées dans la stéroïdogenèse peut être modifiée par les xéno-hormones (Whitehead et Rice., 2006). Ce qui altère la concentration des hormones naturelles dans l organisme et induit un dysfonctionnement du système hormonal. C. Cas particulier : les xéno-estrogènes et le récepteur à la dioxine Le récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) est un facteur de transcription activé par la fixation de ligands. Le récepteur AhR semble intervenir dans le développement des invertébrés. Par exemple, chez Drosophila melanogaster, l homologue du récepteur AhR intervient dans le développement des segments et des antennes (Emmons et al., 1999) et son ADN complémentaire, connu depuis 1992, révèle des domaines de forte homologie avec les protéines Per (Period) et Sim (Single-Minded) de Drosophila melanogaster. Il fait partie de la famille dite bhlh-pas (basic Helix-Loop-Helix/Per-AhR-Sim) (Hankinson 1995; Swanson et Bradfield, 1993), distincte des récepteurs nucléaires à laquelle appartient le récepteur aux 25

42 oestrogènes. Ce motif «PAS» (PER-AhR-SIM), caractérise les membres d une nouvelle super-famille de protéines incluant Arnt (AhR nuclear translocator), partenaire d hétérodimérisation de AhR. Parmi les ligands qui se fixent sur l AhR, citons les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) comme le benzopyrène, les polychlorobiphényles (PCB) et les dioxines. Un certain nombre de phyto-oestrogènes sont des antagonistes du récepteur AhR tels que la génistéine ou le resvératrol. Ce récepteur reconnaît plus de 250 ligands dont 75 dioxines, mais le ligand naturel reste inconnu malgré quelques molécules candidates (Denison et Nagy, 2003). Le rôle du récepteur à la dioxine est particulier car il peut interagir avec le récepteur ER et peut soit l activer ou soit l inhiber, ce qui explique la confusion du statut anti ou pro- oestrogénique de la dioxine. Le récepteur AhR se caractérise par un domaine N-terminal complexe appelé «bhlh- PAS» (basic Helix-Loop-Helix/Per-AhR-Sim), responsable de la liaison à l ADN, de l hétérodimérisation et de la liaison du ligand (figure 7A). Ce domaine définit une famille de transactivateurs qui comprend, outre le récepteur AhR, son partenaire d hétérodimérisation nucléaire ARNT (Aryl hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator) (Rowlands et Gustafsson, 1997). L hétérodimère AhR-Arnt identifie des séquences «XRE» (Xenobiotic Responsive Element). La partie C-terminale du récepteur AhR contient des régions trans-activatrices et une fonction de répression de la transcription. AhR présente une rare aptitude aux interactions avec d autres protéines telles que les chaperonnes (HSP90), A B Figure 7: Structure et mécanismes moléculaires du récepteur nucléaire AhR. (A) : illustration de l architecture de domaine et des ligands apparentés pour ces récepteurs. bhlh : hélice-boucle-hélice de base; PAS : Per-ARNT -Sim domaine; AD : domaine d'activation; AF : fonction d'activation. (B) mécanismes de régulation des gènes médiés par AhR. ERE, un élément de réponse aux oestrogènes (inspiré de Ohtake et al., 2009). 26

43 Le fonctionnement de l AhR est semblable à celui de certains récepteurs stéroïdiens (figure 7B) (Ohtake et al., 2007, 2008). Il se localise dans le cytoplasme et une fois lié à un ligand, le complexe recrute une protéine de translocation appelée translocateur nucléaire du récepteur des hydrocarbures aromatiques (ARNT). Le complexe ligand-ahr-arnt agit comme facteur de transcription sur l'élément de réponse aux xénobiotiques (XRE : xenobiotic response element) sur le promoteur du gène concerné, comme c'est le cas pour le gène codant pour le CYP1Al. Cette fixation au XRE va permettre de recruter l'arn polymérase favorisant la transcription des gènes cibles, dont beaucoup codent pour des enzymes de détoxication, en ARNm. Ainsi le taux de transcription est favorisé par la fixation de facteurs de transcription. Parmi les gènes dits AhR-dépendants figurent ceux codant pour un grand nombre d'enzymes de biotransformation (évitant toute accumulation de métabolites intermédiares potentiellement toxiques pour la cellule) incluant: - des enzymes de phase I telles que le CYP 1 A 1, CYP 1 A2, CYP 1 B 1 et CYP2s 1, - des enzymes de phase II telles que la NAD(P)H-Nqo 1 (nicotinamide adénine dinucléotide phosphate-quinone oxidoréductase), la GSTA 1 (glutathion-stransferase A 1) et l'ugt1 A6 (UDP-glucuronosyltransférase) (Rivera et al., 2002) (figure 8). La fixation de ligands comme les dioxines provoque également l activation de gènes de la prolifération, de la régulation du cycle cellulaire et de l inflammation. Figure 8 : Intéraction de la signalisation du récepteur AhR avec A, la modulation de la synthèse d enzyme de biotransformation et du métabolisme (enzyme de phase I et de phase II) et avec B, l élimination du récepteur ER par le protéasome (inspiré de Matthews et Gustafsson, 2006) 27

44 Outre les effets géniques du récepteur AhR, plusieurs travaux ont montré que ce récepteur pouvait exercer ses effets en activant des cascades de signalisation différentes. Ainsi, plusieurs kinases semblent être la cible de ce récepteur, comme la p38 kinase et la JNK (c-juhn N-terminal Kinase) (Weiss et al., 2005; Diry et al., 2006). Il existe un mode d activation non conventionnel du récepteur AhR qui, en absence d hormone, induit tout de même des gènes oestrogéno dépendants. Les mécanismes d action qui induisent cet effet, ont été, notamment, démontrés par Ohtake et al., Ce dernier peut former un hétérodimère avec le récepteur ERα et ainsi agir comme co-régulateur pour stimuler la transcription contrôlée normalement par le récepteur ERα (figure 9). Figure 9:Activation illégitime de la voie de signalisation du ER (récepteur des oestrogènes) par le récepteur de la dioxine activé AhR. En l absence d oestrogène, la voie de signalisation du ER peut être activée par des interactions entre le récepteur ER et le récepteur de la dioxine activé (d après Massaad et Barouki, 1999) En effet, plusieurs études in vivo et in vitro ont confirmé un lien entre l activité du récepteur ERα et celle du récepteur AhR. Par exemple, en transférant le gène codant pour le récepteur ERα à des cellules ne pouvant pas exprimer ce récepteur et ne pouvant pas répondre à la dioxine, Thomson et al., ont montré que ces cellules étaient de nouveau capables de répondre à la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine en déclenchant une réponse oestrogénique. De même, des agonistes du récepteur AhR peuvent l être également pour le récepteur ERα, on parle alors de xéno-oestrogènes bivalents. De même, il est désormais admis que le récepteur à la dioxine AhR possède des voies de signalisation et d activation qui se croisent avec celles 28

45 du récepteur aux oestrogènes ERα et également avec celles du récepteur aux androgènes (AR) (figure 10). Figure 10: Interaction de la signalisation des dioxines avec les oestrogénes. Interaction des voies signalisation du récepteur AhR et du récepteur ERα via une association directe entre AhR et ERα. Les ligands du récepteur AhR induisent une association de AhR avec Erα. Ce nouveau complexe agit comme une unité fonctionnelle pour réguler la transcription (inspiré de Matthews et Gustafsson, 2006). Il a été également montré que le récepteur AhR exerce à l égard du récepteur ER une activité «ubiquitine E3 ligase» et oriente le récepteur ER vers le protéasome favorisant ainsi sa dégradation (Ohtake et al., 2007; Matthews et Gustafsson, 2006). Il résulte de ces derniers travaux que les dioxines perturbent considérablement les régulations hormonales oestrogéniques : en présence d hormone, ces polluants exercent un rôle antagoniste, alors qu en absence d hormone, ils sont capables d induire transitoirement des gènes hormonodépendants (figure 10). D. Action à faible dose et en mélange de perturbateurs endocriniens Compte tenu de la particularité des PE à produire leurs effets via des mécanismes de signalisation physiologique, leurs cibles sont difficiles à évaluer et la perturbation du système endocrinien peut, dans certains cas, apparaître à des concentrations bien plus faibles que celles qui alarment habituellement les toxicologues. Tout comme les hormones naturelles, les PE 29

46 présentent des relations non linéaires entre la concentration de la molécule et le nombre de récepteurs liés, ainsi qu'entre le nombre de récepteurs liés et l'effet biologique maximal (Vandenberg et al., 2012). Les effets de faibles concentrations ont été très souvent pris en compte notamment pour le bisphénol A (vom Saal et al., 2007). De nombreuses études ont démontré que comme les hormones, les PE peuvent avoir des effets à de faibles doses (dose physiologique) et ces effets ne sont plus présents ou différents à des doses élevées (pouvant être considérées comme toxiques) (Wetherill et al., 2007; Piccart et al., 2003). Si on commence à mieux appréhender les effets de ces composés lorsqu'un organisme est exposé à une seule de ces molécules, on connait beaucoup moins bien l'effet de ces composés lorsqu'ils sont présents en mélange. Or, les contaminations par les PE étant pratiquement toujours multiples, il apparaît pertinent de pouvoir évaluer les effets des mélanges. La compréhension de ces effets est rendue complexe car un même PE peut avoir plusieurs mécanismes d action tels que des effets oestrogéniques dans certains systèmes et anti-androgéniques dans d autres (Viñas, et al., 2013). De plus, différentes études ont déjà montré que même si chacun des composés est présent à une concentration inférieure à celle où il induit un effet, le mélange de ces composés à ces mêmes concentrations peut néanmoins causer un effet (Silva et al., 2002; Rajapakse et al., 2002). Des études ont donc évalué les effets d addition (Bazin et al., 2010), de synergie (Laetz et al., 2009) ou d antagonisme (Tanida et al., 2009) entre molécules. Ces effets sont d autant plus importants pour les perturbateurs endocriniens que certains induisent des effets agonistes (éthinyloestradiol, nonylphénol), antagoniste (tamoxifène) et peuvent avoir des mécanismes d action différents (liaison aux récepteurs, modification du métabolisme) (voir partie II A Mécanismes de la perturbation endocrinienne) (Monosson et al., 2005; Cizmas et al., 2004). De même, il a été démontré que des mélanges multi-composants d'oestradiol et d'autres xéno-oestrogènes induisent la synthèse d une protéine spécifique, la vitellogénine chez le poisson. Cette protéine est un biomarqueur de la perturbation endocrinienne. En comparant le taux d induction par les contaminants pris isolément et deux à deux, on peut prédire l effet dû au mélange (Brian et al., 2005). Ce système de prédiction basé sur des effets cocktails, utilisant des bioessais in vitro, a permis d évaluer les effets de mélange de nombreux perturbateurs endocriniens (Bazin et al 2010). La prévisibilité des effets de la combinaison de plusieurs molécules a été démontrée avec des systèmes encore plus complexes que celui de l induction de la vitellogénine chez les poissons. Dans un modèle de toxicité pour le développement du rat, il a été montré que les 30

47 combinaisons d'antagonistes des récepteurs aux androgènes vont agir de manière additive et ainsi induire des changements physiologiques chez l animal lors de sa vie fœtale, caractéristiques de la perturbation de l'action des androgènes (Hass et al., 2007). Des observations similaires ont été faites avec des combinaisons d anti-androgènes qui agissent par le biais de mécanismes différents (Christiansen et al., 2009; Rider 2008). Des études avec des perturbateurs thyroïdiens ont également montré des effets additifs à faibles doses (Crofton et al., 2005). Compte tenu des propriétés des PE, par rapport aux divers scenarii d exposition des populations, la recherche se focalise actuellement sur les mélanges de substances à doses environnementales (de l ordre du microgramme ou du nanogramme par littre). IV. Perturbateurs endocriniens : substances d origines multiples Les différentes activités humaines génèrent une diversité de substances et des quantités toujours croissantes d agents physiques, chimiques ou biologiques ayant un pouvoir contaminant et des risques potentiels sur la santé humaine, animale et/ou végétale. Parmi les effets négatifs pouvant être développés par ces contaminants, la perturbation endocrinienne est, à l heure actuelle, un des impacts sur l écosystème qui est de plus en plus étudié. Cependant, il faut noter que les substances, ayant des effets potentiellement perturbateurs sur le système endocrinien, peuvent avoir deux origines : naturelle et anthropique (tableau 6). 31

48 Tableau 6 : Classes de perturbateurs endocriniens. Archives des maladies professionnelles et de l environnement 2008, L. Multigner, P. Kadhel Différentes classes de substances à action endocrine Hormones stéroïdes naturelles Produits pharmaceutiques Produits dentaires Produits vétérinaires Oestrone, 17α-oestradiol, oestriol (hormones sexuelles) DES (Distilbène), 17 α-éthynil-oestradiol (contraceptif), kétokonazole (traitement du pityriasis, pommade), tamoxifène (traitement de certains cancers du sein). Bisphénol A DES, trenbolones (augmentent la masse musculaire) Produits de combustion Produits à usage industriel ou domestique Dioxines, furanes, HAP (hydrocarbure aromatique polycyclique) Phtalates, bisphénol A, styrène (polystyrène), Polybromodiphényl éthers (PBDE), polychlorobiphényls, organoétains Alkylphénols, parabènes (conservateurs dans les produits de beauté), Arsenic, cadmium Produits phytosanitaires Organochlorés (DDT, chlordécone ), vinchlozoline (retirée en avril 2007), linuron (herbicide), atrazine, simazine, linuron Phytooestrogènes Isoflavones (soja, trèfle) Mycotoxines Zéaralénone, ochratoxine A A. Hormones 1) Hormones naturelles Les hormones stéroïdes représentent une large classe de molécules lipophiles. Elles agissent principalement sur des sites variables pour la régulation de nombreuses fonctions physiologiques. C est pour cela quelles sont essentielles pour une physiologie normale. Il existe deux principales classes d hormones : les androgènes comme le déhydroépiandrostérone (DHEA), la dihydrotestostérone (DHT) ou la testostérone (T) et les oestrogènes comme l œstrone (E1), l œstradiol (E2) et l oestriol (E3). Ces hormones sont importantes dans la différentiation sexuelle, la reproduction ainsi que pour le maintien d une santé optimale chez l adulte. L activation ou l inhibition inappropriée des récepteurs stéroïdes par ces hormones est l un des modèles les plus utilisés pour l étude de la perturbation, plus particulièrement, l interférence avec la signalisation des récepteurs des oestrogènes. Plusieurs études ont rapporté la prévalence des oestrogènes naturels dans les effluents de station d épuration (Pillon et al., 2005, Johnson et al., 2005, Khanal et al., 2006, Limpiyakorn et al., 2011). Ces auteurs ont mis en évidence le rôle néfaste de ces substances, comme étant une 32

49 source de composés pouvant entrainer, du fait de leur présence «anormale» dans l environnement, des perturbations endocriniennes sur les écosystèmes naturels. 2) Hormones synthétiques Les oestrogènes synthétiques sont utilisés comme contraceptifs (éthinyloestradiol (EE2), mestranol), dans le traitement des pathologies reproductives (clomifen) ou le cancer (tamoxifen, raloxifen). Ces produits pharmaceutiques agissent par compétition avec les hormones endogènes, par blocage ou en activant certaines voies métaboliques, ou encore en remplacement des oestrogènes endogènes. B. Xéno-hormones d origine naturelle 1) Phyto-oestrogènes Les phyto-oestrogènes, composés dérivant des plantes, possèdent des structures chimiques similaires aux oestrogènes. Ce sont des perturbateurs endocriniens non stéroïdes et sont retrouvés dans de nombreux aliments comme le soja. Dans la littérature, l aptitude de ces composés à se lier aux récepteurs des oestrogènes est de plus en plus rapportée. En effet, ces composés induisent des réponses oestrogéniques dans les essais in vitro (Stopper et al., 2005), chez certains mammifères (Hopert et al., 1998; Burton et Wells, 2002) ainsi que des effets délétères sur la faune naturelle (Colborn et al., 1993; Dusza et al., 2006; Jefferson et al, 2007; Rochester et Millam, 2009). D autres phyto-composés comme les coumestranes (principalement le coumestrol), et des isflavonones présentent une activité anti-oestrogénique dans les cellules MCF-7 (Han et al., 2002). 2) Myco-oestrogènes Certaines mycotoxines produites par les champignons, en particulier fusarium (Kuiper-Goodman, 1987) telles que la zéaralénone, la déoxynivalénol (DON), ou encore la toxine T-2, sont des substances pouvant avoir une activité endocrinienne (Ndossi et al., 2012) et qui sont retrouvées à de fortes concentrations dans les produits alimentaires comme les céréales (maïs, orge) et l huile végétale. Elles sont capables de se lier, avec une bonne affinité, aux récepteurs des oestrogènes (ERα et ERβ) (Balaguer et al., 2001). De récentes études ont également montré l impact de l ochratoxine A sur le système endocrinien (Frizzell 2013a et b). Jusqu alors, cette mycotoxine produite par les genres Aspargillus et Penicillium était connue pour avoir des effets sur la reproduction (Gharbi et al., 1993), sur la spermatogenèse 33

50 (Biro et al., 2003), sur le système immunitaire et également des effets cancérogènes (classée groupe 2B par le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC)). De ce fait, le Comité scientifique de l'alimentation humaine de la Commission européenne a estimé, dans son avis du 17 septembre 1998, qu'il serait prudent de réduire autant que possible l'exposition à l'ochratoxine A. Ainsi, la concentration doit se situer près de la valeur inférieure des doses journalières tolérables comprises entre 1,2 à 14 ng/kg p.c./jour (poids corporel/jour). La teneur maximale de cette mycotoxine dans les vins pour une commercialisation en Europe est de 2 µg/l. Le Canada et les Etats Unis refusent l'importation des vins présentant plus de 1 μg/l d'ochratoxine A. Cette mycotoxine peut également avoir un impact sur la sécrétion des certaines hormones comme la testostérone (Shashi, et al., 2011), et sur l hormone lutéinisante (LH) (Hassan et al., 2010). L ochratoxine A semble avoir une action sur le système endocrinien via les voies non génomiques (Frizzell et al., 2013a et b). C. Xéno-hormones d origine anthropique Outre les phyto-oestrogènes et les myco-oestrogènes, les xéno-hormones font référence à des milliers de produits et appartiennent à diverses familles de produits chimiques : les organochlorés, les dioxines; les alkylphénols. On les retrouve dans les formulations, les solvants, les produits issus du pétrole etc Ils regroupent des produits de l industrie chimique (phtalates, bisphénol A, métaux lourds, etc.), des produits phytosanitaires utilisés en agriculture (herbicides, fongicides, insecticides, etc.) et des produits de consommation courante (cosmétiques, conservateurs, produits alimentaires etc ). 1) Xéno-hormones d origines industrielles a) Produits chimiques Les substances synthétiques sont conçues pour une utilisation industrielle en tant que solvants, surfactants ou lubrifiants (ex. nonylphénol ou polychlorobiphényle/pcb), et sont retrouvés dans les plastiques (ex. bisphénol A). D autres sont utilisées comme pesticides (ex. méthoxychlore, dichlorodiphényltrichloroéthane/ddt, lindane), fongicides (ex. vinclozoline, bénomyl), substances médicamenteuses (ex. flutamide), et produits de consommation courante (ex., cosmétiques, produits d entretien). Les composés organochlorés sont utilisés comme solvants, pesticides dont les insecticides et les fongicides ou encore comme réfrigérants ou molécules intermédiaires de synthèse en chimie et pharmacie. Les plus connus sont les pesticides (DDT, aldrine, chlordécone, dieldrine, chlordane, heptachlore, endrine, 34

51 mirex, chlorobiphényle (BPC), toxaphène, lindane, etc.), les polychlorobiphényles (PCB) et les dioxines qui pour certains ne sont plus utilisés à ce jour (Convention de Stockholm) et d autres sont interdits en France et en Europe. Quelques structures de ces xéno-hormones sont illustrées (figure 11). En raison de leur caractère lipophile, les organochlorés sont réputés persistants et se concentrent dans les tissus adipeux. Certains d entre eux perturbent ainsi le système endocrinien. Ces composés font partie des composés organiques persistants (POPs) qui possèdent des temps de demi-vies pouvant atteindre plusieurs décades. Figure 11 : Quelques exemples de xéno-hormonesd après le site Internet de la National Library of Medicine 2007 Le mode d action, de ces molécules, comme perturbateur endocrinien est très varié. Par exemple, les effets oestrogéniques des PCB peuvent se produire suite aux interactions directes avec le récepteur aux oestrogènes (ER) (Fielden et al., 1997; Ma et al., 2000). Le DDT, insecticide longtemps utilisé, est un des perturbateurs endocriniens les plus étudiés (Yang et al., 2006). Son métabolite le 4,4'-Dichlorodiphényldichloroéthane (4,4 -DDE) est un composé anti-androgénique reconnu (Kelce et al 1995). Les hydrocarbures aromatiques polycycliques regroupent plusieurs composés, le plus connu étant le Benzo(a)pyrène (BaP). Leur principal mécanisme de toxicité est induit via l activation du récepteur à la dioxine (récepteur AhR) pouvant indirectement produire des effets endocriniens (Ma et al., 2000). 35

52 Les détergents du type éthoxylates d alkylphénol (EAP) et éthoxylates d octylphénol (EOP) sont utilisés par l industrie métallurgique pour dégraisser les surfaces métalliques. Les éthoxylates de nonylphénol (ENP) se retrouvent, quant à eux, dans des produits d entretien domestique. Après leur utilisation, ces composés biodégradés en station d épuration engendrent la formation de produits bio-réfractaires comme le nonylphénol (NP) qui est persistant et toxique. Il a été démontré que le nonylphénol et ses dérivés sont des composés induisant une activité oestrogénique en se fixant notamment sur le récepteur ERα (Guenther et al., 2002; Preuss et al., 2006; Bechi et al., 2006; Gabriel et al., 2008). Le NP et ses dérivés sont connus pour s accumuler dans les espèces aquatiques et entraîner la féminisation des poissons bien qu il soit fois moins oestrogénique de l oestradiol (Jobling et Sumpter 1995). Les constituants du plastique comme le bisphénol A et les phtalates peuvent engendrer respectivement des effets oestrogéniques et anti-androgéniques par la liaison au récepteur des oestrogènes et au récepteur des androgènes (vom Saal et al., 2005). Le bisphénol A peut également fixer le récepteur AhR (Bonefeld-Jorgensen et al., 2007, ), et le récepteur des hormones thyroïdiennes (ThR) (Zoeller et al., 2005). Les phatlates interfèrent également avec les voies des androgènes et des oestrogènes. La perturbation des activités androgéniques a été montrée par le développement sexuel anormal des rats exposés aux contaminants et son impact sur la fertilité des hommes (Dalsenter et al., 2006; Latini et al., 2006). De plus, des expériences in vitro ont montré le potentiel anti-androgénique de ces xéno-hormones (Lee et al., 2007). Certains métaux comme le plomb, le cadmium, l arsenic, le mercure, le zinc ou le nickel, peuvent induire des perturbations endocriniennes chez l animal (Iavicoli et al., 2009; Bogdan et al., 2011). A des concentrations non cytotoxiques (comprises entre 2 et 225 µg/l) l arsenic inhibe l effet de l oestradiol dans les cellules MCF7. De même, le mercure encore employé en technique dentaire peut avoir une action de perturbation qui induirait un dérèglement de plusieurs glandes, des ovaires et des testicules provoquant des troubles de l immunité, des troubles de la reproduction et un accroissement des cancers du sein (Tan et al., 2009; Wirth et al., 2010). A des concentrations de l ordre du nanogramme par millilitre, le cadmium interfère avec la synthèse des oestrogènes, des androgènes et de la progestérone (Massanyiet al., 2000; Takiguchi et Yoshihara, 2006). 36

53 b) Colorants Les colorants sont impliqués dans un grand éventail de domaines : industrie textile, imprimerie, industrie pharmaceutique, cosmétique et agro-alimentaire. L industrie des colorants constitue aujourd hui un secteur important de la chimie : la production mondiale est estimée à plus de tonnes par an dont tonnes s échappent dans les effluents au cours des différentes étapes d application et de confection (Cooper, 1995; Zollinger, 1987). Parmi les nombreuses familles de colorants synthétiques, les colorants azoïques sont les plus largement utilisés (60 à 70 %). Ces colorants possèdent une ou plusieurs liaisons azoïques (R1-N=-R2) en association avec un ou plusieurs groupements aromatiques, ce qui les rend très stables et relativement peu biodégradables. De nombreuses études ont montré, d autre part, des effets toxiques et/ou carcinogènes des colorants azoïques (Mathur et Bhatnagar 2007; Schneider et al., 2004). Dans le cas des colorants azoïques, l'augmentation de l'incidence du cancer de la vessie, observée chez les travailleurs de l'industrie textile, a été liée à une exposition prolongée à ces colorants. Un rapport d'experts du «Comité Cosmetic Ingredient Review» a confirmé que certains colorants d'anthraquinone, comme le Disperse Blue 7, utilisé dans l'industrie cosmétique comme colorant pour cheveux et dans l industrie textile, induisent de la génotoxicité chez les bactéries (Final report on the safety assessment of disperse blue 7, 2007). De même il a été montré que des rejets d industrie de peinture avaient une activité dioxine like (AhR) et cette activité a été corrélée à la présence de colorants spécifiques (Chouet al., 2007). D un point de vue environnemental, les activités oestrogéniques n ont pas été décrites pour les colorants textiles. Les impacts sur le système endocrinien, que pourraient avoir ces composés, ont été observés pour le résorcinol, un antiseptique utilisé pour produire des colorants comme le bleu de résorcine, le vert de résorcine, utilisés pour le tannage ou le textile (Lam et al., 2013). En revanche, des études ont décrit des effets oestrogéniques dues à la présence de colorants alimentaires. La tartazine (E102) ou l érythrosine (E127) affectent la réponse du récepteur aux oestrogènes (ER) en se fixant sur l élément de reconnaissance oestrogénique (ERE) dans les cellules HTB 133 (cellules hepitéliales de glande mammaire). Ces résultats sont confirmés par le bioessais E- screen (Roychoudhury et Giri 1989; Lundin-Schiller 2008). 2) Produits de consommation courante et d hygiène corporelle, les parabènes Parmi les produits de soin corporel et d hygiène (PPSP pour produits pharmaceutiques et de soins personnels), on retrouve des produits pharmaceutiques, des antibiotiques et des produits de soins personnels (comme les parfums synthétiques à base de musc) mais aussi 37

54 certains conservateurs comme les parabènes. Les médicaments excrétés par les humains et les stéroïdes déjectés par les animaux d élevage représentent d autres sources de perturbateurs endocriniens retrouvés dans l eau. Des études récentes ont montré que le paracétamol et les anti inflammatoires perturbent le système endocrinien (Vanderford et al., 2003 et 2006, Westerhoff et al., 2005; Albert et al., 2013). Certains analgésiques ont des effets antiandrogéniques chez le fœtus du rat et chez l homme (Mazaud-Guittot et al., 2013; Kristensen et al., 2011). Les parabènes sont des esters de l acide parahydroxybenzoïque ou encore des parahydroxybenzoate d'alkyles dont le groupement alkyle, peut être un radical méthyl, éthyl, propyl, butyl, isobutyl ou benzyl. En général, les parabènes sont des composées stables qui résistent à l hydrolyse en solution acide (Soni et al., 2005; Eriksson et al., 2009). La concentration en parabène admise dans les cosmétiques peut atteindre 1 % (Tavares et al., 2009). Cependant la Directive Européenne 76/768/EC autorise une concentration maximale dans les produits cosmétiques de 0,4 % pour un seul ester et 0,8 % (en masse) pour un mélange d esters. En raison de leurs propriétés antibactérienne et antifongique, les parabènes sont employés comme conservateurs, en particulier dans les produits cosmétiques et certaines spécialités pharmaceutiques (Jonkers et al., 2009; Elder, 1984). Une enquête, récente, réalisée en Espagne sur 215 produits cosmétiques a montré que les parabènes sont utilisés dans 99 % des crèmes et des lotions, et 77 % des démaquillants (Tavares et al., 2009). Ils peuvent également être présents dans les dentifrices (Benijts et al., 2004). Dès 1998, des études in vitro, s intéressant aux mécanismes d action de ces composés, ont mis en évidence la capacité des parabènes à se lier au récepteur oestrogénique. Cette activité oestrogénique serait fonction de la longueur des chaînes alkyles (méthyl, éthyl, propyl, butyl) (Routledge et al., 1998; Bazin et al., 2010). Des essais réalisés sur des cellules MCF 7 (lignée de cellules tumorales mammaires), ont démontré l effet oestrogénique additif entre les parabènes et le 17βoestradiol (Van Meeuwen et al., 2008). Une activité anti-androgénique a également été observée in vitro avec les méthyl, propyl et butyl parabènes. En effet, à partir d une concentration de 10 μm, ils sont capables d inhiber l activité transcriptionnelle induite par la testostérone respectivement de 40 %, 33 %, et 19 % (Chen et al., 2007). Enfin, les parabènes pourraient exercer une activité «indirecte» de perturbation sur le système endocrinien par 38

55 l inhibition des sulfotransférases, enzymes nécessaires à la régulation de l action des oestrogènes in vivo. V. Evaluation des altérations des écosystèmes en lien avec la présence des perturbateurs endocriniens Les évidences sont nombreuses en matière d écotoxicologie et d impact sur la faune principalement aquatique. En effet, de nombreuses études ont montré un lien entre la présence de polluants, induisant des effets du système endocrinien (notamment des effets sur la régulation des hormones stéroïdiennes), et des anomalies survenues sur la reproduction et le développement de certaines populations comme observé chez les alligators, les gastéropodes ou certains poissons (Toppari et al., 1996). A. Effet sur les invertébrés La recherche sur les systèmes endocriniens invertébrés a été principalement axée sur la reproduction des mollusques aquatiques, les insectes et les crustacés. La modification du sexratio et la production de vitellogénine, précurseur protéique des réserves énergétiques de l'oeuf chez de nombreuses espèces animales en réponse à des oestrogènes endogènes, peuvent être induits chez les crustacés et les mollusques placés dans les exutoires d eaux usées (Gagné, et al., 2001; 2003; Pampaninet al., 2005; Matozzo et Marin, 2008; 2007) transformant ainsi la dynamique de la population. Une autre perturbation endocrinienne, très connue, est le pseudo-hermaphrodisme ou imposex. Celui-ci se traduit par le développement de caractères sexuels mâles chez les femelles tel que le développement d'organes génitaux mâles (pénis et canal déférent par exemple). Ce phénomène apparait surtout chez les populations de gastéropodes marins. Ce phénomène a été largement observé en Asie du sud-est (Ellis et Pattisina, 1990), en Alaska (Short et al., 1989), au Royaume Uni (Bryan et al., 1986) et aux Etats-Unis (Smith, 1981). La cause majeure du pseudo-hermaphrodisme est l exposition à des organo-étains, en particulier le tributylétain (TBT) (biocide organométallique massivement utilisé des années 1960 à 2000 comme antifouling pour les bateaux). Ces substances sont connues pour être très toxiques pour les mollusques, même à des teneurs extrêmement faibles et sont rencontrées dans les eaux côtières. Les premiers travaux ont montré que cette anomalie était due à l inhibition de l aromatase conduisant à des concentrations plasmatiques accrues en testostérone (Heidrich et al., 2001). De récents travaux ont déduit que ce phénomène était 39

56 sans doute dû à l induction de la voie des récepteur X de rétinoïdes (RXR) (Lima et al., 2011), ce qui implique que les effets sur la différentiation sexuelle sont donc indirects. B. Poissons/Amphibiens Les travaux pionniers de Sumpter (Purdom et al., 1994; Jobling, et Sumpter 1995), sur la truite arc en ciel (Oncorhynchus mykiss), démontrant les effets des perturbateurs endocriniens sur la féminisation des poissons, ont été un élément déclencheur pour montrer l urgence et l intérêt d étudier l impact de ces composés sur les écosystèmes aquatiques. Les amphibiens et les poissons (truite arc-en-ciel notamment) sont utilisés comme indicateurs de facteurs de stress environnementaux du fait de leur développement larvaire (en phase aqueuse) qui expose en permanence l'embryon aux composés potentiellement présents dans l'eau de surface. En effet, les œufs n ont pas de coquille de protection (Henry et al., 2000). La sensibilité des amphibiens aux perturbateurs endocriniens peut être déterminée à l aide d organismes modèles tel que le xénope (Xenopus laevis). L effet de ces perturbateurs sur la biologie de la reproduction, le système thyroïdien et le développement neural (Urbatzkaa et al., 2007; Cevasco et al., 2008) a été observé chez cet organisme. Les oestrogènes conduisent à la féminisation, les anti-oestrogènes neutralisent la différenciation sexuelle, les androgènes provoquent une masculinisation, tandis que les anti-androgènes ont des effets féminisants. (Kloas et Lutz, 2006). Les effets des perturbateurs endocriniens sur les paramètres de la reproduction chez les poissons sont bien documentés à la fois sur le terrain et au laboratoire. Le premier exemple documenté d une perturbation sexuelle généralisée dans une population de poissons remonte à 1998 (Jobling et al., 1998). Un des indicateurs le plus analysé est la féminisation des poissons. Une forte incidence d'intersexualité et une augmentation significative des concentrations de vitellogénine (Vg) dans le plasma ont alors été observées chez des gardons (Rutilus rutilus) mâles capturés en aval de huit stations d épuration au Royaume-Uni. Plus tard, des analyses chimiques ont révélé la présence d oestrogènes naturels et synthétiques ainsi que des alkylphénols et du bisphénol A dans ces effluents (Jobling et al., 2004). Ces chercheurs ont lié la présence de gonades intersexuées chez Rutilus rutilus avec des modifications dans la maturation sexuelle et une diminution de la production de gamètes et de la fertilité (Jobling et al 2002 a; 2002 b). Les travaux similaires de Munkittrick et al. (Munkittrick et al., 1991) ont montré que l exposition des poissons «white sucker» (Castostomis commersoni) du Lac Supérieur (Etats-Unis) à des effluents d usines de pâtes à papier réduisait la taille des gonades 40

57 et la capacité de reproduction. De même, une étude de Hashimoto et al. (2000) montre qu au Japon, 15 % des flets sauvages (Pleuronectes yokohamae) mâles capturés dans la baie de Tokyo, recevant une grande quantité d effluents industriels et domestiques, avaient des ovocytes dans leurs testicules (Hashimoto et al., 2000). Des études menées en laboratoire montrent que l'éthinyloestradiol peut être utilisé pour améliorer la production d'œufs chez les poissons femelles, et induit une démasculinisation des mâles. Les oestrogènes naturels, oestradiol et oestrone ont des effets similaires, l'oestradiol étant le plus puissant (Arcand-Hoy et Benson, 1998; Gordon et al., 2004). D autres études ont démontré des effets néfastes chez le mosquito fish dus à des composés tels que l éthinyloestradiol, le tamoxifen, ou le méthyldihydrotestostérone. Sur les populations de poissons, on observe une diminution de la masculinisation et du taux de spermatozoïdes (Larsson et Forlin 2002; Toft et Guillette 2005; Cheshenko et al., 2008), l apparition des phénomènes d'intersexualité (Vigano et al., 2001; Van Aerle et al., 2001), et un impact sur la croissance et la différenciation sexuelle chez le poisson chat (Sridevi et al., 2013). Le développement embryonnaire des poissons peut également être altéré par la présence de perturbateurs endocriniens. Les malformations squelettiques sont les plus spectaculaires dans la mesure où le squelette constitue la charpente de l animal. Elles ont été décrites surtout chez les espèces d élevage, mais elles sont également bien connues dans la nature (Dawson, 1964). Elles affectent les différentes parties du squelette, mais les plus répandues sont celles du rachis : lordose et scoliose (Madsen et Dalsgaard, 1999). Ces malformations résultent soit d anomalies du développement et affectent alors la morphologie générale (tératologie) et/ou la croissance, soit de facteurs écophysiologiques variés : carences alimentaires (Rao et Raghuramulu, 1995), perturbations hormonales (Antunes et Da Cunha, 2002; Dulcic, 2003). Ainsi, suite à l exposition, en laboratoire, d œufs de médaka japonais (Oryzias latipes) à des extraits de sédiments contaminés par des polluants organiques, les embryons peuvent présenter une déformation marquée de la colonne vertébrale absente chez les individus témoins (figure 12) (Cachot et al., 2007 ; Kessabi et al., 2012). Des observations similaires ont été mentionnées pour d autres espèces en présence de composés comme la dioxine, les HAP, les PCB (Cachot et al., 2005; 2006; Yamauchi et al., 2006; Gagnon and Rawson, 2009; Kessabi et al., 2012). 41

58 Figure 12 : Déformation de la colonne vertébrale chez des médakas âgés de 10 semaines. A : Médaka japonnais-oryzias latipes; B : individu normal; C : individu présentant une lordose sévère (cachot et al., 2005) C. Effet sur les mammifères Les mammifères marins sont particulièrement vulnérables aux effets des perturbateurs endocriniens persistants. Comme les humains, ils ont une durée de vie longue et occupent des niveaux trophiques supérieurs. En outre, ils ont de grandes réserves de graisse qui agissent comme des puits pour les composés lipophiles qui sont ensuite libérés en quantité pendant la grossesse, l'allaitement et les périodes de famine. Des niveaux élevés de PCB et d'autres POP (polluants organiques persistants) ont souvent été enregistrés, parfois à des niveaux connus pour provoquer des anomalies de la reproduction. Les Pinnipèdes, comme les otaries, ont reçu plus d'attention que les cétacés et en raison de leur taille. Dans les populations sauvages des anomalies de la reproduction ont été signalées dans les zones polluées par ces substances et, dans certains cas, ces anomalies sont en corrélation avec le niveau de contaminants présents dans le corps. C est le cas d une étude faite dans la mer de Wadden (Jensen et al., 1979) qui a recensé une diminution du taux de reproduction des phoques dans cette zone et qui a été corrélée à une pollution par les PCB provenant du Rhin. Les taux élevés de troubles de la reproduction, l augmentation de l'expression de CYP1A1 (due à une activation du récepteur AhR), et de kystes ovariens, indiquant une ovulation anormale, ont été observés dans les populations de cétacés se nourrissant dans les zones contaminées (Fossi et al., 2013; 2006). Concernant les mammifères terrestres, un lien, entre les polluants et la perturbation de la fonction endocrinienne, a été donné comme une explication possible de la diminution de populations et des anomalies de la reproduction de plusieurs espèces en particulier les panthères et les loutres (Roos et al., 2001; Elmeros et al., 2006). En 1995, la population de panthères de Floride ne comptait plus que 30 à 46 individus dont certains présentaient des 42

59 anomalies au niveau des systèmes reproducteur et immunitaire (Facemire et al., 1995). Les anomalies de la reproduction se caractérisaient par des spermatozoïdes anormaux, une faible concentration spermatique et des cas de cryptorchidie. Bien que la consanguinité soit une cause possible de ces anomalies, l'exposition à des xéno-estrogènes peut également induire des effets chez ces panthères. En effet, de fortes doses de mercure, de sélénium et de plusieurs organochlorés ont été détectées dans les tissus d'une panthère morte. De plus, les ratons laveurs, la principale proie de ces panthères, accumulent de fortes quantités de pesticides organochlorés via leur alimentation. Néanmoins, une relation causale entre ces perturbateurs endocriniens et les anomalies de la reproduction n'a pu être établie. D. Observations chez l Homme Chez l homme, les observations ont permis de mettre en évidence qu une exposition fœtale ou périnatale aux perturbateurs endocriniens peut entraîner une différentiation sexuelle et des malformations urogénitales suivies d une diminution des capacités de reproduction à l âge adulte (Anway et al., 2005). Parallèlement plusieurs symptômes, regroupés sous le terme de «Syndrome de Dysgénésie Testiculaire» (Bay et al., 2006), témoignent d une altération des fonctions du système reproducteur chez l homme depuis une vingtaine d années comme des malformations génitales, une baisse de qualité du sperme et une augmentation des cancers des testicules et de la prostate (Sharpe et Skakkebaek, 1993; Storgaard et al., 2006). Chez la femme, des études épidémiologiques mettent en avant une tendance à la puberté précoce, des irrégularités menstruelles, une fertilité altérée (Massart et al., 2003), une augmentation d enfants prématurés, de cancers du sein et des organes génitaux (Coumoul, et Barouki, 2002; Hilakivi-Clarke, 2006). L exemple le plus connu est celui de l utilisation du diéthylstilbestrol chez les femmes enceintes entre les années 1938 et 1971 pour prévenir l arrêt spontané des grossesses. Suite à l exposition in utero, la descendance a été sujette à un nombre anormalement élevé de cancers du vagin et à une légère augmentation des risques du cancer du sein, alors que les garçons ont été sujets à des anomalies dans le développement du système reproducteur et à une augmentation des risques du cancer de la prostate et des testicules (Schrager et Potter, 2004). 43

60 L origine des troubles du système de reproduction n est pas clairement établie à ce jour mais il est possible que ces symptômes soient les conséquences d une exposition multiple et sur le long terme aux perturbateurs endocriniens. VI. Perturbateurs endocriniens dans les effluents et les milieux aquatiques Les effluents de station d épuration représentent la source la plus importante d insertion de PE dans le milieu récepteur. La grande majorité des perturbateurs endocriniens utilisés en milieu urbain ou domestique se retrouve dans les eaux usées. En effet, ces composés sont principalement d origine domestique (hormones naturelles ou de synthèse, lessives, cosmétiques..) et industrielle. Les rejets convergent vers les stations de traitement où certains perturbateurs endocriniens sont très mal éliminés dans les STEP classiques. Ils se déversent donc dans le milieu aquatique via les effluents. Cette voie de rejet est celle des hormones de synthèse et de produits de cosmétique comme les parabènes. Les herbicides, utilisés en agriculture, sont généralement entraînés par lessivage et se déversent directement dans le milieu naturel (sources diffuses) (tableau 7). Les principaux perturbateurs endocriniens déversés de cette façon sont les oestrogènes issus de l élevage, les produits phytosanitaires et les résidus s infiltrant dans le sous-sol des sites contaminés (cas des colorants industriels par exemple). De ce fait, de nombreuses études ont démonté que la perturbation endocrinienne de certains effluents, aussi bien en Europe que dans d autres pays n était pas négligeable (Dagnino et al., 2010). Cette activité biologique exprimée en Equivalent oestradiol (EEQ) est mesurée par différent tests in vivo et in vitro (voir section VII) (Cargouet et al., 2007; Nelson et al., 2007) et montrent que, dans certaines stations d épuration, cette activitée peut varier de 10 ng/l à 130 ng/l EEQ (selon les études et les tests utilisés) au niveau des eaux arrivant dans la STEP (Murk et al., 2002). Cette activité passe en deça la vingtaine de nanograme par litre (activité allant de 16ng/l à 0,03 ng/l EEQ) à la sortie des stations d épuration. Dans les eaux de surface, l activité oestrogénique atteind 1,5 ng/l EEQ (Pillon et al., 2005). 44

61 Tableau 7 : Sources de perturbateurs endocriniens entrant dans les eaux environnementales (Birkett et Lester, 2003) Source Eau réceptrice Substances susceptibles d'être présentes Eaux usées domestiques Eaux usées industrielles Décharge industrielle Peinture pour bateaux Écoulement agricole (récoltes) Écoulement agricole (animaux) Ruissellement urbain Lixiviats de décharge publique Déposition par l'air Eaux naturelles Eau de surface Eau souterraine Eau souterraine (alimentation) Eau de surface, Eau souterraine Eau de surface, Eau souterraine Eau de surface Eau de surface, Eau souterraine Eau de surface, Eau souterraine Eau de surface, Eau souterraine Eau souterraine Eau de surface, Eau souterraine Eau de surface, Eau souterraine Oestrogènes stéroïdes, Agents de surface, PAE, BPA Agents de surface, HAP, PCB, PBDE, pesticides, PAE, BPA Dioxines, PBDE, TBBA, PAE, PCB, HAP, pesticides, BPA TBT Pesticides, AP, APE PBDE, HAP Oestrogènes stéroïdes Pesticides, HAP HAP, PBDE, TBBA, BPA, PAE HAP, PCB, PCDD, PCDF, PBDE, TBBA, pesticides HAP, oestrogènes stéroïdes (phyto-estrogènes) A. Présences des parabènes Bien que les stations d épuration permettent un abattement de ces composés (Lee et al., 2005), le méthyl, l éthyl, le propyl et le butyl parabènes ont été détectés dans des effluents à des concentrations de l ordre du ng/l (Paxeus, 1996; Lee et al., 2005; Canosa et al., 2006). En entrée de station d épuration, le composé majoritaire, largement retrouvé, est le méthylparabène car il est le plus utilisé comme conservateur aussi bien dans les produits cosmétiques que dans l alimentation (Geara-Matta, 2013). Ses concentrations peuvent atteindre le milligramme par litre dans certains pays européens comme le Danemark (Andersen et al., 2007), le Royaume-Uni (Kasprzyk Hordern et al., 2008) ou encore l Espagne (González Mariño I et al., 2009). Les autres parabènes sont également retrouvés et le moins présent est le benzyl parabène du fait de son interdiction (Canosa et al., 2006). En sortie de station d épuration, en raison d un abattement important de ces composés lors du traitement secondaire (Eriksson et al., 2009), ils sont retrouvés à des concentrations plus 45

62 faibles. Certaines études mentionnent des concentrations très faibles de l ordre du nanogramme par litre voir en dessous des limites de détection (Lee et al., 2005; Canosa et al., 2006; Pedrouzo et al., 2009) et d autres montrent, au contraire, une présence plus importante de ces composés. En effet, il a été retrouvé des concentrations pouvant atteindre, par exemple en Suisse, 423 ng/l pour le méthylparabène et 16 ng/l pour le benzyl parabène (Jonkers et al., 2009a et b). De ce fait, ces composés peuvent être présents dans les eaux de surface (Brausch et al., 2010). Ils ont été détectés par exemple en Espagne (González Mariño et al., 2009), en Belgique (Benijts et al., 2004) et aux Etats Unis (Renz et al., 2013). Ces concentrations peuvent atteindre 147 ng/l d éthylparabène dans les rivières indiennes (Ramaswamy et al., 2010). B. Présence des mycotoxines Les mycotoxines sont des métabolites secondaires produits par plusieurs variétés de champignons du genre Fusarium, Aspargillus et Penicilium, qui se développent surtout dans les denrées périssables. Bien que la plupart des études se soient intéressées à leur présence dans l alimentation, quelques-unes les ont identifiées dans l eau. Des études ont montré la présence de mycotoxines dont certaines sont connues pour leur activité oestrogénique comme la zéaralénone ou la déoxynivalénol (DON) (Hartmann et al., 2007). Gromadzka et al., en La zéaralénone est, en effet, présente dans les milieux aquatiques à des concentrations pouvant atteindre 43,7 ng/l dans certaines rivières polonaises (Gromadzka et al., 2009). La présence de mycotoxine est expliquée par le développement de la fusariose (genre Fusarium) dans les cultures. Le drainage par les pluies entraine la toxine dans le milieu naturel (Hartmann et al., 2008). Le genre Fusarium produit également des mycotoxines appartenant à la famille des trichothécènes comme la déoxynivalénol. Les concentrations de ce composé naturel peut atteindre 20 ng/l dans les rivières du canton de Zurich en Allemagne (Bucheli et al., 2008). Des études faites sur trois stations d épuration suisses ont montré que la DON est omniprésente dans les effluents à des concentrations allant de 32 à 118 ng/l (Wettstein et al., 2010). Concernant l ochratoxine A produite par le genre Penicillium, sa présence est prédominante dans les rejets vinicoles (Nogueira et al., 2007) et dans le sol (Mortensen et al., 2003). D autres mycotoxines comme les aflatoxines, sont retrouvées en mélange avec les fumonisines ou trichothécènes dans l environnement (Hoerger et al., 2009). 46

63 C. Autres perturbateurs endocriniens De nombreux autres composés sont retrouvés dans l environnement dont certains agissent sur le système endocrinien. C est le cas des hormones naturelles (oestradiol et ses dérivés). Par exemple, une étude faite sur les eaux résiduaires aux environs de Paris a montré que les concentrations de ces hormones sont très variables. Les concentrations vont de 51 à 0,6 ng/l en entrée de station d épuration pour l oestradiol. Certaines hormones naturelles et synthétiques de type oestrogène telles que l oestrone, le 17-α-oestradiol et le 17-αéthinyloestradiol subsistent encore dans les effluents. En effet, cette même étude montre qu en sortie de station, les concentrations de ces composés varient de 19 à 1,2 ng/l (Cargouet et al., 2001). Or, ces hormones sont actives à faibles concentrations, quelques ng/l, qui sont susceptibles d induire des effets sur l écosystème aquatique. Des alkylphénols, le bisphénol A, des phtalates et HAP ont été retrouvés en sortie de station d épuration et dans les eaux de surface (Céspedes et al., 2008; Voutsa et al., 2006 Sun et al., 2013). Comme ces composés sont largement utilisés dans l industrie, l agriculture et dans les activités domestiques (détergents), ils peuvent être retrouvés dans l environnement à un niveau de concentration supérieur à celui des hormones (μg/l). La figure 13 montre les composés potentiellement retrouvés dans l environnement ainsi que leurs concentrations (Wintgens et Melin, 2001). Figure 13 : Substances à action endocrinienne dans les eaux résiduaires d une station d épuration allemande (Wintgens et Melin, 2001). 47

64 VII. Détection des perturbations endocriniennes et des xéno-hormones. Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées pour détecter la perturbation endocrinienne et pour identifier les molécules responsables de ces effets. Des tests in vivo et in vitro sont disponibles et permettent d évaluer les effets (notamment les effets oestrogéniques et anti oestrogéniques). Cependant, lorsqu il s agit d identifier et de quantifier plus précisément une substance dans une matrice donnée, les analyses physico-chimiques sont plus adaptées. A. Détection de la perturbation endocrinienne de contaminants et d effluents 1) Bioessais pour détecter la perturbation endocrinienne a) Méthodes in vivo Les essais in vivo présentent l avantage de mesurer l impact réel de la perturbation (effet additif, synergique, inhibiteur etc..) sur des organismes vivants (Campbell et al., 2006). Ces tests ont principalement recourt à l utilisation de poissons comme la truite arc-en ciel (dont l induction de la vitellogénine est un biomarqueur très utilisé pour déterminer l activité oestrogénique), de rongeurs, d algues, de plantes (Sumpter et Jobling 1995; Garcia- Reyero et al., 2004). Les méthodes, pour les essais in vivo, sont bien définies et utilisées depuis plusieurs décennies. Elles permettent d intégrer de multiples mécanismes d action et d évaluer les effets sur le système endocrinien globalement. Par exemple chez les rongeurs, c est l expression de gènes endogènes ou des changements de phénotypes qui permettent d indiquer l effet. Deux types de tests réglementaires existent pour mesurer une activité oestrogénique ou androgénique. Le test utérotrophique chez la souris ou le rat consiste à mesurer l augmentation du poids de l utérus après 3-7 jours de traitement par de l oestradiol ou le produit dont l activité oestrogénique est à tester. Le test de Hershberger, chez le rat, consiste à mesurer l augmentation du poids d organes comme le gland pénien, les vésicules séminales ou la prostate ventrale après 10 jours de traitement par un produit dont l activité androgénique est à tester (Vandenberg et al., 2007). D autres tests, pas encore validés par le CEVAM (Centre européen pour la validation de méthodes alternatives) utilisant la technique de gène rapporteur in vivo, ont été développés ces dernières années. Ces tests utilisent des animaux transgéniques (zébrafish, xénope ou 48

65 souris) dont le gène de la luciférase ou de la GFP (Green Fluorescent Protein) est sous le contrôle d un promoteur activable par les oestrogènes ou les androgènes. De tels modèles existent pour les récepteurs ER chez le zébrafish (AromataseB-GFP et ERE-Luciférase) (Legler et al., 2002a; Tong et al., 2009). Comme tous les modèles in vivo, ils présentent l avantage d intégrer le métabolisme et donc d étudier la dégradation d un produit actif ou la transformation d un produit inactif en produit actif. b) Méthodes in vitro La caractérisation du potentiel «perturbateur endocrinien» de diverses substances chimiques et de divers effluents a été réalisée grâce à des tests in vitro. Concernant la perturbation oestrogénique, ces essais peuvent être classés en trois catégories : la mesure de l affinité d un produit chimique à se lier au récepteur humain des oestrogènes (her), la prolifération de cellules «E-Screen-Assay», l expression du gène rapporteur «YES-Assay». b.1. Tests de liaison au récepteur. Les tests de liaison à un récepteur particulier sont utilisés pour détecter des molécules capables d interagir directement avec un récepteur endocrinien, comme les récepteurs α et β des oestrogènes ou le récepteur des androgènes. Ces tests permettent de mesurer l affinité de liaison du récepteur pour les ligands testés. Ils sont basés sur l étude de la compétition entre la molécule testée non radiomarquée et un ligand standard radiomarqué pour le récepteur (Leush et al., 2006; Snyder et al., 2003). Le défaut principal de ces tests est qu ils ne fournissent aucune information sur l activité hormonale du composé testé. Ils ne permettent pas, en effet, de faire la différence entre une activité agoniste ou antagoniste par exemple (Farré et al., 2005). Il est donc impératif d utiliser un autre test fonctionnel in vitro pour la déterminer. b.2 Tests de prolifération cellulaire. Le test E-Screen est l exemple le plus connu pour ce type de tests. Il est basé sur la propriété que les cellules du cancer du sein MCF-7 sont capables de proliférer en présence d une molécule oestrogénique dans le milieu de culture (Soto et al., 1995). Ce test a permis de déterminer l oestrogénicité d effluents de STEP et d eaux de surface. Ce test est l un des plus sensibles pour analyser l oestrogénicité des molécules et permet de distinguer une activité agoniste ou non. Ainsi, une molécule est considérée comme un antagoniste pur lorsque (i) elle n affecte pas le nombre de cellules en absence d oestrogène, (ii) elle bloque les effets prolifératifs de l oestradiol, et (iii) ce blocage est réversible en augmentant la dose 49

66 d oestradiol tout en gardant constante la concentration de l antagoniste (Sonnenschein and Soto, 1998). Ce test est utilisé pour détecter l activité oestrogénique d effluent et sa sensibilité peu atteindre le nanogramme par litre (Bicchi et al., 2010; Kuch et al., 2010.) Néanmoins, du fait de la sensibilité du test aux conditions de culture (sous-clones cellulaires différents, lots de sérum), la variabilité des résultats en laboratoire est relativement importante (Eertmans et al., 2003). Des tests de prolifération cellulaire ont également été développés pour détecter les molécules ayant une activité androgénique ou anti-androgénique. Ces tests «A-Screen» utilisent les cellules de carcinome de la prostate d origine humaine LNCaP-TAC, dont la prolifération est dépendante de la présence d un androgène dans le milieu de culture (Sonnenshein et Soto, 1998). b.3 Dosage de l activité oestrogèno-mimétique; le Yeast Estrogen Screen (YES) et autres tests utilisant le gène rapporteur. Ces tests se basent sur le modèle simple des cellules (cellules de mammifère ou levure), qui expriment un gène sous le contrôle de promoteurs définis, répondant à des substances spécifiques, et qui produisent ainsi un signal facilement quantifiable (Balaguer et al., 1996). Les cellules sont transfectées de façon transitoire ou stable avec un plasmide vecteur portant les séquences ADN d un élément de réponse à une hormone (Hormone Response Element ou HRE) couplées à un gène rapporteur comme celui de la β-galactosidase ou de la luciférase. Par exemple, le «YES-assay», utilisant des cellules de levure (Fawell et al., 2001; Garcia-Reyero et al., 2001; Kirk et al., 2002; Hugget et al., 2003; Aerni et al., 2004; Gibson et al., 2005; Vermeirssen et al., 2006) est souvent utilisé en raison de sa manipulation simple. Ce test est basé sur la souche recombinante de la levure saccharomyces cerevisiae, qui contient, dans son génome, un gène codant pour le récepteur humain aux oestrogènes (her). Elle contient également un plasmide portant l élément de réponse aux oestrogènes (ERE) contrôlant lui-même l expression du gène rapporteur lac-z qui code pour la β-galactosidase (Routledge et Sumpter, 1996) (figure 14). 50

67 Figure 14 : Principe du YES (Yeast Estrogen Screen) Ainsi en présence d oestrogènes, la β-galactosidase est synthétisée. Elle métabolise un substrat spécifique présent dans le milieu de culture comme le CPRG (chlorophénol rougebeta-d-galactopyranoside), conduisant à une coloration rouge due à la libération de chlorophénol ou comme le 4-méthylumbellriferyl-β-D-galactopyranoside (MuGal) conduisant à une florescence à 460 nm (Boever et al., 2001). L intensité de la coloration ou de la fluorescence est un indicateur de l oestrogénicité de la molécule ou de l effluent testé. Des versions modifiées appelées «Lyticase assisted Yeast Estrogen Screen» (LYES) (Schultiset Metzger, 2004) et le «Bioluminescent Yeast Assay» (BLYES) (Sanseverino et al., 2010) ont été également développées. D'autres essais utilisent des cellules humaines du cancer du sein. Elles contiennent déjà le récepteur humain aux oestrogènes, et elles sont transfectées, dans certains cas, avec la luciférase dans le test ER-CALUX (Chemical-Activated LUciferase gene expression ceu bioassay system) (Murk et al., 2002; Van der Linden et al., 2008), dans le test T47D-KBluc ( exprimant les récepteurs alpha et beta aux oestrogènes), (Wilson et al 2004) ou dans le test MELN (Cellule MCF-7 exprimant le récepteur alpha aux oestrogènes) (Cargouët et al., 2004; Pillon et al., 2005; Cargouët et al., 2006). Ces essais montrent un grand intérêt pour la détermination rapide de l'oestrogénicité des composés naturels et artificiels et d effluents. 51

68 Tableau 8 : Comparaison des limites de détection, des valeurs de EC 50 et des durées des essais pour les différents tests in vitro. Test in vitro Cellule Limite de détection ng/l EC 50 (ng E2/l) Durée de l essai (jours) Reference ER-CALUX T47D 0,1 1,6 3 Murk et al., 2002 ;Vethaak et al., 2002 YES Levure 2, Murk et al., 2002 <1 4 Hugget et al., Kirk et al., Arijs et al., 2002; Folmar et al., Folmar et al., Beresford et al., 2000 E-Screen MCF-7 0,27 1,3-2,2 0,3-2, Körner et al., 1998, 1999, 2000 Körner et al., 2001 Gutendorf et Westendorf, 2001 Parmi les deux tests les plus utilisés, le test YES a montré une sensibilité environ dix fois plus faible que l ER-CALUX, et selon les tests utilisés les sensibilités peuvent variées (tableau 8) (Leusch et al., Murk et al 2002). La limite de détection du test l ER-CALUX est de 0,1 ng/l. Pour mieux appréhender l effet des effluents où les substances se retrouvent en mélange, les équipes de recherche proposent donc un ensemble de tests où plusieurs effets hormonaux sont analysés, par exemple l activité oestrogénique et l activité androgénique (Grover et al., 2011). 2) Immunoessais pour détecter la perturbation endocrinienne Ces bioessais, appelés immunoessais, se basent sur les propriétés de liaison entre anticorps (Abs) et antigènes (Ags). Les technologies immunochimiques les plus représentatives pour les analyses environnementales regroupent différents systèmes : 52

69 «enzyme-linked immunosorbent assay» (ELISA), «Radioimmunoasay» (RIA) (Snyder et al., 2003), «Flow-injection immunoassay» (FIlA), «Immunoaffinity column» (Farré et al., 2005). Le test ELISA offre plusieurs avantages par rapport aux autres immunoessais. Il est, en effet, basé sur une technique immuno-enzymatique de détection permettant de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée, le plus souvent, produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps. De plus, il est robuste, fournissant des mesures rapides, et demande peu de qualification pour son utilisation (Auriol M., Thèse de doctorat 2007). Ainsi, cette méthode est très répandue pour les analyses environnementales (Gascon et al., 1997; Goda et al., 2000; Valentini et al., 2002; Schneider et al., 2004). Les principales enzymes utilisées sont la peroxydase de raifort (HRP), la phosphatase alcaline (AP) et la β-galactosidase. Les désavantages de cette méthode concernent les effets de matrice et les réactions croisées (Farré et al., 2005). Le principe de la mesure repose sur la reconnaissance structurelle de la molécule cible. Le système immuno-enzymatique est décliné en différents principes (figure 15) : Dosages avec réactif limitant : méthodes par compétition ou méthodes indirectes (figure 15 A) : l'antigène à doser entre en compétition avec l'antigène marqué pour la liaison à l'anticorps; la totalité des sites anticorps disponibles est liée. On mesure la fraction liée qui diminue exponentiellement avec la concentration en Ag à doser. On peut procéder en phase liquide homogène ou en phase solide hétérogène; dans ce dernier cas, la séparation des fractions libre et liée est facilitée. Cette méthode s'applique à tous les antigènes quelle que soit leur taille, y compris les haptènes. Dosage d'un antigène par méthode sandwich (ELISA sandwich) (figure 15 B) : l'antigène doit posséder deux épitopes différents; il est pris en "sandwich" entre deux anticorps. Il est ensuite révélé par un anticorps marqué. On mesure la fraction liée qui augmente avec la concentration en antigène à doser (linéairement pour de faibles concentrations). 53

70 Figure 15 : Schéma présentant les 3 principes utilisés pour la technique ELISA : (A) méthodes par compétition, (B) Dosage d'un antigène par méthode sandwich (Lafont, 2005) Les premières méthodes ELISA proposées pour détecter la perturbation endocrinienne ont été développées pour la vitellogénine, biomarqueur de la perturbation oestrogénique exprimée chez le poisson (indiquant une exposition à des oestrogènes mimétiques). Pour cela, un anticorps monoclonal a été développé afin de mettre au point le test ELISA (Tyler et al., 2002). Dans ce test, la xéno-hormone n est pas directement mesurée mais c est l effet engendré par le/les perturbateurs qui est détecté (Nilsen et al., 2004; Meucci et al., 2005; Eidem et al., 2006; Verderame et al., 2011.) De même, ces tests ELISA développés, pour détecter de très faibles concentrations de vitellogénine (6 µg/l) chez certains poissons comme le Cyprinus carpio, permettent de déterminer l effet «perturbateur endocrinien» notamment oestrogénique et anti-oestrogéniques de composés chimiques pour lesquels ces effets n avaient pas encore été déterminés (Ebrahimi et al., 2007; 2005). Les méthodes de «screening» des perturbateurs endocriniens incluent des tests réalisés in vivo et in vitro. In vivo, les perturbateurs endocriniens sont capables d interférer à différents niveaux des mécanismes complexes de régulation du système endocrinien. Ces tests permettent ainsi d observer les effets engendrés par une molécule testée en prenant en compte l ensemble de ces interactions. Mais ils ne permettent pas d identifier et de quantifier les xéno-hormones à des concentrations de l ordre du nanogramme par litre. 54

71 B. Détection des xéno-hormones avérées 1) Méthodes physico-chimiques Parmi toutes les techniques analytiques, la chromatographie en phase gazeuse (GC) et la chromatographie en phase liquide (LC) couplées à la spectrométrie de masse (MS) ou en tandem (MS/MS) sont aujourd hui les moyens les plus adaptés pour l analyse des perturbateurs endocriniens (Stanczyk et Clark, 2010). Les limites de détection relevées tableau 9 en témoignent. Tableau 9 : Techniques d'analyse utilisées pour la quantification des différentes classes de perturbateurs endocriniens dans l'environnement aquatique Classe de polluants Hormones stéroïdes Type d'échantillon Séparation Détection LD (ng/l) Référence Entrée station/ LC MS/MS de 0,1 à Stavrakakis et al., 2003 Sortie station 0,3 Sortie station GC IC-MS 112 Xiao et al., 2001 Sortie station LC DAD MS (ESI) De Alda et Barcelo, 2001 Entrée station/sortie LC MS/MS 0,08-0,9 Baronti et al., 2000 station (ESI) Sortie station LC MS/MS 5-10 Lagana et al, 2004 Sortie station GC MS/MS 1 Kelly, 2000 Entrée station/ LC MS/MS 0,2-0,5 Johnson et al., 2000 Sortie station Entre station/sortie LC MS/MS de 0,5 à 10 Stavrakakis et al., 2008 station Alkylphénols Sortie station LC APCI-MS 500 Castillo et al Sortie station LC APCI/ESI Petrovic et al., 2003 Phtalates Sortie station LC UV APCI/ESI MS Entrée station/ LC APCI-MS Sortie station Entre station/sortie station Entrée station/ Sortie station Entre station/ Sortie station LC GC GC LC GC ,06-0,1 UV 500 MS-APCI 11 0,06-0,1 MS MS/MS n. p. 11 Ahel et al, 2000 Petrovic et al., 2003 Castllo et al, Ahel et al, 2000 Stavrakakis et al., 2008 Castllo et al, Lee et Peart, 2000 Stavrakakis et al., 2008 Bisphénol A Entre station/ Sortie station LC MS/MS n. p. Lee et Peart, 2000 LD = Limite de détection 55

72 Le couplage chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse (LC/MS) permet d analyser des composés non volatils, ou des composés thermiquement instables qui ne pourraient pas être analysés par GS/MS ou seulement après une première étape de dérivation chimique. De plus, la conception des interfaces d ionisation (ESI Ionisation Electrospray et APCI Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique) ont permis d améliorer les limites analytiques. Concernant les oestrogènes naturels et synthétiques, leur détermination dans les eaux usées est une tâche difficile à cause de la complexité de la matrice et leur analyse en GC-MS et GC-MS/MS est difficile. La LC-MS et la LC-MS/MS sont des technologies applicables à un large éventail de matrices et ne requiert pas de dérivation préalable. 2) Bioessais, méthodes immunochimiques Dans la section VII.A, les méthodes in vitro ont été présentées comme des outils analysant la perturbation du système endocrinien. Cependant, certaines méthodes in vitro peuvent identifier des xéno-hormones. Bien que le dosage immuno-isotopique ou RIA (Radioimmunoessay), méthode en phase liquide utilisant un anticorps secondaire radioactif, soit efficace pour déterminer la présence d oestradiol et de stéroïdes (Xing et al., 1983; Riffle et al., 2013), la technique ELISA est une technique valable pour détecter et doser plusieurs polluants environnementaux connus pour perturber les systèmes endocriniens. Ainsi la technique ELISA a été développée pour détecter de façon spécifique le bisphénol A (Verderame et al., 2011; Lu et al., 2012) avec une limite de détection variant de 0,1 à 0,05 µg/l selon l anticorps utilisé. Plus récemment, des tests ELISA multiplex ont été developpés (Marquette et al., 2012), pour la détection et le dosage simultané de plusieurs produits chimiques, dont certains sont des perturbateurs endocriniens, comme par exemple le 2,4- Dichlorophenoxyacetic (Desmet et al., 2013). Les applications biologiques se sont développées sur des échantillons type plasma, urine, par exemple, et se sont étendues aux applications environnementales, d abord axées sur des échantillons d eau plus ou moins complexes (eaux de surface, eaux souterraines, effluents de station d épuration). Il est désormais possible de trouver de nombreux kits commerciaux pour détecter des substances chimiques pouvant perturber le système endocrinien (comme les PCB) ou des kits plus globaux détectant les oestrogènes. Selon les modèles, il est possible de 56

73 doser soit réellement un des oestrogènes (oestradiol, oestrone, éthynilestradiol), soit des analogues structuraux des oestrogènes. De même des tests ELISA ont été développés pour détecter l oestradiol (Chiu et al., 2011; Handelsman et al., 2013) avec une limite de détection de 1nM (Xin et al., 2009; 2008). Les techniques utilisant la chimiluminescence permettent de détecter l E2 à des concentrations pouvant atteindre 1,48 ng/l (Xin et al., 2010). Le tableau 10 donne une liste non exhaustive de kits actuellement disponibles. Il présente des kit qui diffèrent au niveau des molécules ou familles de molécules ciblées, du type de matrice environnementale et de la gamme de concentrations. Tableau 10 : Exemples de kits commerciaux. Les NQE (définitives ou en proposition, sont données à titre indicatif. Paramètre Méthode Matrice Gamme de calibration NQE Acétochlore et autres Particules magnétiques Eau, sol 0,10 à 2,5 µg/l 0,3 pg/l (alachlor) acétanilides Alachlore Particules magnétiques Sol, eau 0,05 à 5,0 µg/l 0,3 µg/l (alachlor) Aldicarbe Particules magnétiques Eau 0,25 à 100µg/l Alkyphénols éthoxylés Microplaques Eau, effluent 20 à 1000 µg/l 0,3 µg/l Alkylphénols Microplaques Eau, effluent 5 à 500 µg/l (alkylphénols) Alkylphénols Ethoxylates Particules magnétiques Eau 20 à 1000 µg/l Microplaques Eau 20 à 1000 µg/l Atrazine et triazines Particules magnétiques Sol, eau 0,04 à 5,0 µg/l 16 µg/l (atrazine) Microplaques Eau 0,02 à 1,5 µg/l Microplaques Eau, sédiment, 0,03 à 3 µg/l sol, Composés benzéniques Particules magnétiques Eau, sol 0,9 à 30 mg/l 0,01 à 0.07 mg/l Mesure «total BTEX» (sol) 0,02 à 3,0 mg/l (eau) Bisphénol A Particules Effluent 5 à 500 µg/l Particules magnétiques Eau 0,05 à 10,0 µg/l Carbendazime/Bénomyl Particules magnétiques Eau 0,10 à 5,0 µg/l Carbaryl Particules magnétiques Eau 0,25 à 5,00 µg/l Carbofuran Particules magnétiques Eau 0,25 à 5,00 µg/l Chlorpyrifos Particules magnétiques Eau 0,22 à 3,0 µg/l 0,03 µg/l DDT/DDE/DDD Particules magnétiques Eau, sol 1,25 à 75,0 µg/l Diuron et phénylurée Particules magnétiques Eau, sol 0,03 à 3,0 µg/l 0,2 µg/l 2,4-D Particules magnétiques Eau 0,7 à 50 µg/l 0,3 µg/l Sol 0,15 à 7,5 mg/l Oestrogènes totaux Particules/Microplaques Eau 0,1 à 3,0 µg/l Isoproturon Particules/ Eau 0,05 à 0,5 µg/l 0,3 µg/l Microplaques LAS surfactant alkylés Particules magnétiques Eaux, effluent 20 à 1000 µg/l Méthomyl Particules magnétiques Eau 0,45 à 15,0 µg/l 57

74 Paramètre Méthode Matrice Gamme de calibration NQE Métalochlor Particules magnétiques Eau, sol 0,05 à 5,0 µg/l 0,3µg/l (alachlor) PCB Particules magnétiques Sol 20, 50, 100, Eau Sol Eau Sol 500mg/l 10 µg/l mg/l mg/l 0.5 à 10µg/l 0,5 à 10 mg/l HAP Particules magnétiques Eau Sol HAP totaux Eau Sol Equivalent phénanthrène Eau Sol Equivalent benzo[a]pyrène Pentachlorophénol Particules magnétiques Eau Sol 1 à 1000 mg/l 0,93 à 66,5 µg/l 0,2 à 5,0 mg/l 0,04 à 10,0 µg/l 10 à 500 µg/l 5 à 500 µg/l 0,5 à 50 mg/l 0,02 à 2,4 µg/l 0,4 µg/l Eau Sol 0,06 à 10 µg/l 0,1 à 10,0 mg/l 3) Détection de la perturbation oestrogénique dans l environnement et les eaux usées via le Yeast Estrogen Screen (YES) Bien que le test YES s avère moins sensible que les tests utilisant les cellules de mammifère comme l ER-CALUX, dans le cas de cours d eau recevant des flux importants d eaux usées, ce test semble être une solution adaptée pour déterminer la teneur en oestrogènes (Nelson et al., 2007). En effet, un problème majeur, dans l'utilisation de tests in vitro pour analyser les échantillons environnementaux, est la présence de composés inhibiteurs/cytotoxiques. Ces échantillons sont souvent contaminés par des substances autres que les xéno-oestrogènes et peuvent interférer avec la croissance et la viabilité des cellules animales. En revanche, cette cytotoxicité est moindre pour les levures. Finalement le choix du système cellule de mammifère/levure va dépendre de la balance entre la limite de détection à atteindre (c est-à-dire la sensibilité du test) et le rapport coût/facilité de mise en œuvre. De plus, le système «levure» a un certain nombre d'avantages par rapport à d'autres systèmes. En effet, il ne présente pas de récepteurs d'hormones stéroïdiennes endogènes. Par conséquent, ce 58

75 système manque d interactions complexes entre l'er et d'autres récepteurs (Routledge et Sumpter, 1996). En outre, étant donné que l'er est transfecté dans la cellule, il n'y a aucune préoccupation concernant l'effet des récepteurs mutants ou variants, qui sont connus pour être présents dans des lignées de cellules contenant leur récepteur comme les cellules MCF-7 (Pfeffer et al., 1996). Un inconvénient du bioessais à base de levure est la présence d'une paroi cellulaire et des mécanismes de transport actifs qui peuvent être différents de ceux trouvés dans les cellules de mammifères et qui sont susceptibles d'affecter l'activité de certains composés testés (Legler et al., 2002b). Dans les échantillons d'eau, peuvent se retrouver en mélange des substances oestrogéniques de faible puissance (comme les alkylphénols) pouvant être présents en grande quantité et des composés ayant une activité oestrogénique très élevée (comme les oestrogènes synthétiques ou naturels) présents à l état de trace. Le comportement additif de l'activité oestrogénique des substances individuelles dans un mélange a été démontré et constitue la base pour évaluer quantitativement la teneur totale de l'activité oestrogénique dans un échantillon via l'utilisation de dosages in vitro. Ainsi, l oestrogénicité totale d un échantillon est comparée à l amplitude de réponse provoquée par l hormone naturelle E2. De ce fait, pour pouvoir calculer une activité oestrogénique totale en fonction de la réponse des tests, les résultats obtenus sont comparés à la concentration du 17-β oestradiol (hormone naturelle) qui produirait le même effet biologique en utilisant le bioessais. On définit alors un indice exprimé en équivalent 17-ß-oestradiol (EEQ) correspondant au potentiel oestrogénique. Lorsque cet effet est évalué pour un composé ou un mélange de composés, il faut alors définir ce facteur d'équivalence en 17-ß-oestradiol (FFA ou EEF selon les données de la littérature) : où Ci est la concentration de l'espèce i. Les potentiels oestrogéniques de certains composés ont été ainsi déterminés et ils sont spécifiques à chaque bioessai utilisé (Nguyen 2011). L'utilisation de l'essai in vitro YES a démontré une activité oestrogénique des eaux usées et des eaux de surface dans de nombreux pays. En effet, de nombreuses études ont donc été faites avec le YES sur des matrices complexes comme les eaux de station d épuration de façon à déterminer les concentrations en xéno-oestrogènes présents. Ce bioessais a été utilisé 59

76 en entrée et en sortie de stations d épuration (Xm et al., 2008; Tilton et al., 2002). Par exemple, dans une enquête nationale néerlandaise (Vethaak et al., 2002), le test YES a été appliqué pour mesurer l'activité oestrogénique d échantillons d'eaux usées et d eaux de surface. Dans presque la moitié des échantillons d'eau de surface, la réponse de l'essai YES était inférieure à la limite de détection. L'activité oestrogénique des eaux de surface de la Meuse est, en moyenne, de 0,04 ng/l EEQ (moyenne obtenue sur trois saisons échantillonnage). La plupart des effluents des STEP ont également montré une activité oestrogénique en-dessous de la limite de détection. En général, l'activité oestrogénique est intensément réduite (de 88 à 99,9% d'élimination) par un traitement des eaux usées. Cependant, il est apparu que l'activité oestrogénique dans les effluents était plus élevée que dans les eaux réceptrices (Vethaak et al., 2002). Une étude menée, en Belgique, sur des rivières et des effluents des eaux usées de STEP municipales a montré que l activité oestrogénique de l'eau de surface était plus importante par rapport à celle de l'effluent (Witters et al., 2001). Sur 16 échantillons analysés, les activités oestrogéniques varient de 2 à 85 ng/l EEQ et plus de 7 échantillons ont des valeurs dépassant 10 ng/l EEQ (Witters et al., 2001). De même, Thomas et al., (2001) ont utilisé le test YES pour évaluer l activité oestrogénique d eaux usées et de surface (estuaire au Royaume-Uni) et ont trouvé un maximum de 24 ng/l EEQ (Thomas et al., 2001). Des études similaires ont été faites aux Etats-Unis (Huggett et al., 2003), en France, ou encore au Japon (Tashiro et al., 2003). Le tableau 11 résume les données de la littérature concernant l utilisation du YES dans des matrices environnementales. Tableau 11 : Niveaux des EEQ trouvés dans différentes matrices environnementales analysées dans de nombreux pays en utilisant le test in vitro YES. (Onda et al., 2002; Arijs et al., 2002) Matrice EEQ Pays Référence Affluents d'eaux usées Effluents d'eaux usées Eau de surface (ng/l) 0,1 to 150 (pm) < LD (4,46 ng/l) 0,1-15 (ng/l) (ng/l) 4-35 (ng/l) < LD (81,4 ng/l) <24 (ng/l) 10 (ng/l) < LD (23,5 ng/l) < LD : inférieur à la limite de détection Japon Chine Belgique Etats Unis Etats Unis Japon Belgique Angleterre Japon Afrique du sud Onda et al., 2002 Li et al., 2008 Witters et al., 2001 Huggett et al., 2003 Tilton et al., 2002 Onda et al., 2002 Witters et al., 2001 Thomas et al., 2001 Tashiro et al., 2003 Arijs et al.,

77 C. Biocapteurs pour le suivi des PE dans l environnement Dans un contexte de contrôle et de surveillance de la qualité des ressources en eau, la détection de substances cibles, pouvant engendrer des effets sur le système hormonal, nécessite de développer des biocapteurs compatibles avec une mesure sur site et plus spécifiquement intégrés dans un système d alerte en ligne répondant aux préoccupations des gestionnaires et traiteurs d eau. 1) Définition Un biocapteur est un système analytique qui convertit une réponse biologique en un signal physique mesurable (Blum et Coulet, 1991). Il associe un bio-récepteur, espèce biologique permettant la reconnaissance sélective de la molécule cible, et un transducteur permettant de détecter et/ou de quantifier les biomolécules dans les aliments, les matrices environnementales ou dans les liquides biologiques (figure 16). Selon l IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), un biocapteur doit être petit et compact, avoir un signal réversible, donner des concentrations fiables et établir une connexion réelle entre le matériel biologique et le transducteur. Figure 16 : Schéma du principe de fonctionnement d'un biocapteur d après Minh, 1991 Les biocapteurs peuvent être classés suivant différents critères Par type de bio-récepteur : enzymes, anticorps, cellules entières Par mode de transduction : optique, électrochimique, thermique ou massique. Par type d'interaction entre le bio-récepteur et la substance cible : affinité, biocatalyse, hybridation. 61

78 Le choix du bio-récepteur dépend de l analyte recherché. Au fil des années, différents bio-récepteurs ont été développés. Les plus communs sont les enzymes, les anticorps, les acides nucléiques (ADN, ARN) et les récepteurs de molécules biologiquement actives (hormones, toxines, facteurs de croissance). Il est également possible de concevoir des biocapteurs à base de cellules entières (Rodriguez-Mozaz et al., 2004) (figure 17). Figure 17 : Représentation des différents types de bio-récepteurs (Montrose, A. thèse de doctorat 2013) Le type de transducteur est choisi en fonction des modifications biochimiques et/ou physico-chimiques se produisant au niveau du bio-récepteur. Le transducteur convertit ces changements en signaux électriques mesurables qui sont amplifiés et traités par des circuits électroniques. Les plus utilisés reposent sur l optique, la calorimétrie, la piézoélectricité et l électrochimie. L objectif du développement d un biocapteur est d aboutir à un dispositif de taille réduite (portatif) permettant de détecter, d alerter, voire de doser directement un polluant, de façon rapide, de préférence sans nécessiter l ajout d autres réactifs ou de prétraitement de l échantillon (Dejous, 2005). Concernant les PE, deux classes de biocapteurs sont pris en compte : les biocapteurs qui mesurent les effets perturbateurs du système endocrinien, et les biocapteurs qui répondent à la présence d'une substance spécifique (ou groupe de substances) fondés sur la reconnaissance spécifique d'une biomolécule. Les bio-récepteurs les plus utilisés pour développer ces biocapteurs sont des bio-récepteurs d affinité (anticorps, acide nucléique ou récepteur membranaire) ou des bio-récepteurs métaboliques. Le tableau 12 résume les applications possibles des biocapteurs dans l environnement pour détecter les perturbateurs endocriniens. 62

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