Contrôle et modulation de la réponse immunitaire par Brucella abortus

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1 AIX-MARSEILLE UNIVERSITE Faculté des sciences de Luminy Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Santé THESE DE DOCTORAT Biologie - Spécialité : Immunologie En vue d'obtenir le titre de DOCTEUR DE L UNIVERSITÉ D AIX MARSEILLE Présentée et soutenue publiquement par: Clara DEGOS 27 Novembre 2014 Contrôle et modulation de la réponse immunitaire par Brucella abortus Directeur de thèse : Dr Jean-Pierre Gorvel Thèse soutenue devant le jury composé de: Prof Franck GALLAND Président Dr David O CALLAGHAN Rapporteur Prof Jean-Jacques LETESSON Rapporteur Dr Jean-Pierre GORVEL Directeur de thèse Prof Jean-Louis MEGE Examinateur Le travail réalisé dans cette thèse a été effectué au Centre d Immunologie de Marseille- Luminy, UM 2 Aix Marseille Université, UMR_S 1104 CNRS, UMR 7280 Inserm

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5 SOMMAIRE REMERCIEMENTS 5 ABBREVIATIONS 7 TABLE DES FIGURES ET TABLEAUX 10 I. INTRODUCTION 12 I. A. LA BRUCELLOSE 13 I. A. 1. ORIGINE : BRUCELLA 13 I. A. 2. REPARTITION SUR LE GLOBE 13 I. A. 3. CONTAMINATION ET SYMPTOMES 13 I. A. 4. CONSEQUENCES ET PROBLEMES VACCINAUX 14 I. B. LES FACTEURS DE VIRULENCE 16 I. B. 1. LE LIPOPOLYSACCHARIDE (LPS) 16 I. B. 2. LE GLUCANE CYCLIQUE Β 1,2 (CΒG) 17 I. B. 3. LE SYSTEME DE SECRETION DE TYPE IV : VIRB 18 I. B. 4. LES PROTEINES DE MEMBRANE EXTERNE (OMP) 19 I. C. LA VIE INTRACELLULAIRE 21 I. C. 1. ENTREE DANS LES CELLULES 21 I. C. 2. TRAFIC INTRACELLULAIRE : LA BCV SUR LES TRACES DES ENDOSOMES 22 I. C. 3. LE RETICULUM ENDOPLASMIQUE, UN HAVRE DE PAIX 23 I. D. BRUCELLA ET LE SYSTEME IMMUNITAIRE 25 I. D. 1. UNE STRATEGIE D EVITEMENT : REPONSES AUX TLR 25 I. D. 2. LA RESISTANCE AUX DEFENSES INNEES 27 I. D. 3. BRUCELLA ET LES DC 31 I. D. 4. L IMMUNITE ADAPTATIVE CONTRE BRUCELLA 33 I. E. CD150, UN RECEPTEUR A LA SURFACE DES CELLULES IMMUNITAIRES 37 I. E. 1. CD150, UNE MOLECULE HOMOPHYLIQUE DE CO-STIMULATION 37 2

6 I. E. 2. LES PROPRIETES IMMUNOMODULATRICES DE CD I. E. 3. CD150 ET LES INFECTIONS 40 I. E. 4. CD150, UN RECEPTEUR BACTERIEN? 42 II. RESULTATS 43 II. A. RESUME DES ACTIVITES 44 II. B. OMP25 SE LIE A CD150 POUR CONTROLER L ACTIVATION DES DC DURANT L INFECTION PAR BRUCELLA 45 II. B. 1. INTRODUCTION 45 II. B. 2. RESULTATS ARTICLE EN PREPARATION 46 II. C. LE CΒG DE BRUCELLA ACTIVE LES DC ET CONTROLE LE RECRUTEMENT DES NEUTROPHILES 67 II. C. 1. INTRODUCTION 67 II. C. 2. MANUSCRIT SOUMIS 68 II. D. BTPB, UNE PROTEINE CAPABLE DE MODULER L ACTIVATION DES DC 92 II. D. 1. INTRODUCTION 92 II. D. 2. ARTICLE 93 III. DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE 107 IV. MATERIEL ET METHODES 113 IV. A. MATERIEL VIVANT 114 IV. B. REACTIFS 115 IV. C. BACTÉRIOLOGIE 119 IV. D. BIOLOGIE CELLULAIRE 122 IV. E. BIOLOGIE MOLECULAIRE 123 IV. F. BIOCHIMIE 127 3

7 V. REFERENCES 129 VI. ANNEXE 141 VI. A. ARTICLE : LIPOPOLYSACCHARIDES WITH ACYLATION DEFECTS POTENTIATE TLR4 SIGNALING AND SHAPE T CELL RESPONSES

8 Remerciements La meilleure partie d une thèse selon une autre doctorante Je tenais donc à remercier tout d abord mon directeur de thèse, Jean-Pierre, pour m avoir permis de réaliser ma thèse dans le laboratoire. Aussi merci pour m avoir laissée une certaine liberté que je n aurais pas eu dans d autres laboratoires. Il était aussi très rassurant qu à chaque fois que j entrais dans le bureau, dépitée par une énième expérience ratée, vous me disiez : «Non mais je suis sûr que tu vas réussir!», et au final j ai réussi à le faire ce blot (et à reproduire 3 fois mes manips! I did it!) Et merci de m avoir aidée pour la suite, j apprécie énormément. Un grand merci à Stéphane pour m avoir tout appris ou presque en biochimie et biologie moléculaire. J ai bien compris que tu aimais ça, j ai un peu plus de mal, cela dit je vois que ça peut quand même être super cool un blot réussi. Et tu sais que je n aurais sans doute pas réussi les clonages, et prouver que slam interagit avec Omp25 sans toi! Merci aussi pour toutes les discussions sur tout et rien qu on a eu, ça faisait toujours du bien. Suzana, tu sais à quel point je t adore, et je dois te dire un grand merci pour tant de choses. Merci pour m avoir prise en M2, m avoir fait découvrir Brucella (ou BruBru de son petit nom), m avoir initiée à la recherche et m avoir transmis ta vision de la science. Merci aussi pour un tas d autres choses (le confocal le 31 décembre, les post it dans le labo, les coups de fil/mails qui remontent le moral, et plein de choses). Tu es ma chercheuse préférée en tout point tu sais :) Merci l Equipe JPG (comme dirait Alexia) pour l ambiance, les croissants du vendredi, les pots en tout genre (merci à Chantal et son fantastique gâteau au citron (le meilleur de la planète)), c était vraiment cool. Et puis on a quand même le bureau le plus cool du CIML : Papa Hugues/Huggy/Oggy, Johnny (vive la nourriture gratuite et non on n aime pas les gens), Clément, Aurélie, Raja et Alexia. Merci à tout plein de personnes aux CIML : à Olivier mon parrain de thèse, Sylvain, Marc et Atika de la cytométrie parce que vous avez toujours souri à mes blagues, et rien que pour ça, merci (et bravo. Je connais le niveau quand même). Merci à Lionel pour sa bonne humeur. Merci à Lydia (toujours vivante?!), Toufik pour les blagues (je m en suis toujours pas remise, meilleure blague du monde tu sais), Djélani pour m avoir chouchouté niveau ordi et écran, même si tu aimes Internet Explorer, je sais qu un jour tu abandonneras IE, j ai foi en toi. Merci à Carole, Franck et Fred, pour notre semaine de cours qui chaque année me permettait de respirer un peu. Merci aux autres thésards pour les discussions pas scientifiques mais tellement mieux : Yannick, Clément C, Clément G, Yaya (you speak french too well you know). Merci à Mohammed mon copain du samedi/dimanche (au choix), à Voa et tous les gens du midi. 5

9 Merci à mes copines du P3/bureau/team BruBru (yes!) : Alexia et Aurélie (dans l ordre alphabétique, je ne veux froisser personne hein!). Vous allez vraiment trop me manquer les filles. Bon je suis quand même heureuse de partir, maintenant je pourrais chanter quand/comme je veux et Alexia ne me menacera pas de couper la radio (super virulente (comme BruBru) la fille), et Aurélie ne fera pas de blagues plus que douteuses sur une phrase tout à fait innocente. Merci pour les fous rires, pour les coups de mains dans les manips, pour les pauses café, les quizz, danses, et autre choses bizarres (hein Aurélie) au P3 pour passer le temps. Merci à Aurélie pour ses dessins qui ornent à peu près tout (de l agrafeuse aux post-it oui oui), pour avoir un petit côté nerveux (je me sens vachement moins seule du coup) et pour être aussi petite que moi, ouf! Merci à Alexia d avoir su me rassurer/consoler quand j en avais besoin (et d être tellement plus calme et maligne que moi sur plein de choses). Je vous aime. Merci à ceux qui sont partis trop tôt (je ne veux pas dire morts voyons! juste partis vers d autres labos!) : Sandra tu m as manquée, Philippe (aka le Plombier), Irène, tes blagues (volontaires ou pas), ton rire, Aude-Agnès (heureusement que tu es revenue via Ciphe), Samira, Caroline, et tous les gens qui vont soutenir juste avant moi et ne seront pas présents (merci les gars du soutien!). Merci à Amélie d être la fille la plus coool du monde, de ne pas m en vouloir quand j oublie de te répondre, d avoir posé un jour exprès pour ma thèse, d être toujours prête pour un thé/tisane, et d être mon amie et ce depuis un bon nombre d années (ça nous rajeunit pas cette histoire!). Et puis merci de m avoir sauvé pour la bio mol. Merci à ma famille de penser que je suis hyper douée et super brillante, parce que je connais plein de mots bizarres terminant par -cytes, ça fait toujours du bien à l égo. Bon et surtout merci du soutien. Et le meilleur à la fin (et forcément dans cet ordre-là ) : Rémi, merci, merci, merci et merci, pour tout. Merci de m avoir accompagné certaines fois le week end au labo, ou m avoir ramené parce, oups, j ai oublié d éteindre/ranger/blabla quelque chose. Merci de m avoir rassurée et calmée quand j en avais besoin. Et merci parce que sans toi je serais devenue plus folle que je ne le suis déjà, parce que ça fait toujours du bien de te retrouver le soir, et parce que je t aime (bien plus que BruBru!). Pour résumer ma thèse Il n y a pas de réussite facile ni d échecs définitifs. Marcel Proust (merci les papillotes et Johnny!) 6

10 ABBREVIATIONS AP-1 : Activator protein 1 B. abortus : Brucella abortus B. melitensis : Brucella melitensis B. suis : Brucella suis BAL : Lavages bronchoalvérolaires BCR : B cell receptor BCV : Brucella containing-vacuole BLS : Brucella lumazine synthase Brucella wt OM : Extraits de membrane de Brucella sauvage Brucella omp25 OM : Extraits de membrane de Brucella mutant pour Omp25 Bsp : Brucella secreted protein Btp : Brucella tir protein CβG : Glucane cyclique β 1,2 CDC : Center of disease control CLR : Receptors lectines de type C CMH : Complexe majeur d histocompatibilité COX : Cyclooxygénase CPA : Cellule présentatrice d antigène CTL : LT cytotoxiques DC : Cellules dendritiques E. coli : Escherichia coli EAT2 : EWS-Fli1-activated transcript-2 ERES : RE exit sites HSC : Hematopoïetic stem cell Ig : Immunoglobuline IFN-γ : Interferon-γ IL-1β : Interleukine-1β IL-2 : Interleukine-2 IL-4 : Interleukine-4 IL-6 : Interleukine-6 IL-8 : Interleukine-8 7

11 IL-10 : Interleukine-10 IL-12 : Interleukine-12 IRAK : Interleukin-1 receptor-associated kinase IRF : Interferon regulatory factor IRF-1 : Interferon regulatory factor 1 IRF-8 : Interferon regulatory factor 8 ITAM : Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs ITSM : Immunoreceptor tyrosine-based switch motifs LAMP-1 : Lysosomal-associated membrane protein 1 LB : Lymphocytes B LBP : LPS binding proteins LPS : Lipopolysaccharide LT : Lymphocytes T mabs : Anticorps monoclonaux ME : Membrane externe MI : Membrane interne MMP : Métallo-matrix protéases NF-AT : Nuclear factor of activated T-cells NF-κB : Nuclear factor-kappa B NK : Natural Killer NLR : Nod-like receptors NO : Oxyde nitrique NOS : Synthase de l oxyde nitrique NOX2 : NADPH Oxydase 2 OMV : Outer membrane vesicles PAMP : Pathogen associated molecule pattern PrpA : Proline racemase protein A PRR : Pattern recognition receptor PtdIns(3)P : Phosphatidylinositol-3-phosphate RE : Réticulum endoplasmique ROS : Réactifs oxygénés SAP : SLAM-associated protein Sbi : Ig -binding protéine A staphylococcale SHP-2 : SH2 domain-containing protein 8

12 SLAM : Signaling lymphocyte activation molecule SPA : Protéine staphylococale A SR-A : Scavenger receptor A S19 : Souche 19 TCR : T cell receptor Th : LT helper TIR : Toll/IL-1 receptor TLR : Toll-like receptor TNF-α : Tumor necrosis factor alpha Treg : LT régulateurs T4SS : Système de sécrétion de type IV UPR : Unfolded protein response 9

13 TABLE DES FIGURES ET TABLEAUX p.13 / Fig. 1 : Phylogénie des différentes espèces de Brucella et leurs hôtes naturels. p.14 / Fig. 2 : Répartition mondiale des cas de brucellose en l an p.15 / Fig. 3 : Modes de contamination humain et animal. p.16 / Fig. 4 : Structure du LPS de Brucella. p.18 / Fig. 5 : Structure schématique d un système de sécrétion de type IV. p.19 / Fig. 6 : Structure de la membrane de Brucella. p.22 / Fig. 7 : Schématisation du site d entrée de Brucella et des protéines pouvant y participer. p.23 / Fig. 8 : Trafic intracellulaire de la BCV et les protéines eucaryotes ou bactériennes requises. p.25 / Fig. 9 : Les récepteurs TLR et leurs ligands. p.26 / Fig. 10 : Voies de signalisation en aval des TLR. p.27 / Fig. 11 : Différents mécanismes de détection de Brucella et les voies de signalisation en aval des récepteurs. p.31 / Fig. 12 : Différentes étapes de maturation des DC. p.33 / Fig. 13 : Différentes populations de LT CD4 + et leurs réponses face aux infections. p.37 / Fig. 14 : Récepteurs murins de la famille SLAMF. p.48 / Fig. 15 : CD150 expression onto BMDC following stimulation with Brucella membrane extracts. p.48 / Fig. 16 : CD25 expression onto T CD4 + cells stimulated by differently activated BMDC. p.49 / Fig. 17 : Proliferation of T CD4 + cells stimulated by differently activated BMDC. p.50 / Fig. 18 : Brucella omp25 replicates as the wt strain within the ER in BMDC. p.51 / Fig. 19 : Co-stimulatory molecules and MHC-II expression onto BMDC after Brucella infection. p.52 / Fig. 20 : NF-κB translocation within infected BMDC. p.53 / Fig. 21 : mrna expression of different pro-inflammatory genes in infected BMDC. p.54 / Fig. 22 : Pro-inflammatory cytokines secretion upon BMDC infection. p.55 / Fig. 23 : Brucella replication and intracellular localization in BMDC after CD150 blockade. p.56 / Fig. 24 : NF-κB translocation within infected BMDC after CD150 blockade 10

14 p.57 / Fig. 25 : Pro-inflammatory cytokines secretion upon BMDC infection after CD150 blockade. p.58 / Fig. 26 : NF-κB translocation within infected CD150 KO BMDC. p.59 / Fig. 27 : Bacterial growth and weight organs in wt and omp25 infected mice at 5 days post-infection. p.60 / Fig. 28 : Competitive index proliferation between Brucella wt and omp25 mutant strains. p.60 / Fig. 29 : Bacterial growth and weight organs in wt and omp25 infected mice at 60 days post-infection. p.61 / Fig. 30 : Survival curve of IFN-γ KO mice infected with Brucella wt or omp25. p.61 / Fig. 31 : Bacterial growth and weight organs in wt and omp25 infected CD150 KO mice at 8 days post-infection. p.62 / Fig. 32 : Competitive index in CD150 KO mice. p.62 / Fig. 33 : Brucella Omp25 binds CD150. p.110 / Fig. 34 : Réplication de Brucella dans les souris CCR2 KO. p.115 / Tableau 1 : Réactifs utilisés p.116 / Tableau 2 : Anticorps p.118 / Tableau 3 : Plasmides p.119 / Tableau 4 : Souches bactériennes utilisées p.124 / Tableau 5 : Amorces 11

15 I. Introduction 12

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18 Figure 1 : Phylogénie des différentes espèces de Brucella et leurs hôtes naturels. Le phylum de Brucella compte dix espèces différentes : abortus, canis, ceti, inopinata, melintensis, microti, neotomae, ovis, pinnipidialis, suis. Différents isolats peuvent avoir différents hôtes et tropismes. Ainsi certaines souches de B. ceti infectent les mammifères marins tandis qu une autre est propre à l homme. Adapté de [3].

19 I. A. LA BRUCELLOSE I. A. 1. Origine : Brucella La brucellose ou «Fièvre de Malte» est une zoonose, maladie transmissible de l animal à l homme. David Bruce a identifié en 1887 le pathogène responsable de cette infection, Brucella. Cette bactérie semble être un pathogène très ancien et la brucellose pourrait sévir depuis des millions d années [1, 2]. Brucella est une bactérie pathogène à gram négatif appartenant au groupe α-2 des protéobactéries. Ces bactéries sont décrites comme étant des bactéries intracellulaires facultatives. De nombreuses espèces appartiennent au genre Brucella et ont un tropisme particulier. A ce jour, nous comptons près de 10 espèces différentes (Fig. 1) [3]. Parmi ces espèces Brucella melitensis (B. melitensis), Brucella abortus (B. abortus) et Brucella suis (B. suis) sont celles qui sont les plus pathogéniques pour l homme [4]. I. A. 2. Répartition sur le globe Avec plus de nouveaux cas d infection humaine par an, Brucella est l un des agents zoonotiques parmi les plus virulents et dont la répartition est très représentée au niveau du globe terrestre. La brucellose est endémique dans de nombreux pays, en particulier dans les pays du bassin Méditerranéen, de l Amérique Latine et du Moyen Orient (Fig. 2) [4, 5]. De nouveaux foyers apparaissent ou ré-émergent chaque année comme par exemple dans le nord de la Chine ou la Mongolie. En France, les Alpes du Sud restent une zone où B. melitensis est endémique chez les animaux sauvages comme les bouquetins [6, 7]. Récemment, Brucella a été classée par l OMS dans le top 7 des zoonoses négligées, responsables à la fois d un problème de santé humain et économiques à cause de l impact négatif que la maladie cause aux animaux d élevage [8]. I. A. 3. Contamination et symptômes Les principaux hôtes naturels de Brucella sont les bovins, ovins, caprins ou encore les mammifères marins. L homme est un hôte secondaire. La contamination se fait par 13

20 Figure 2 : Répartition mondiale des cas de brucellose en l an Répartition des cas déclarés de brucellose humaine en l an Les pays les plus touchés sont la Mongolie et les pays du Moyen-Orient, et des Balkans. Certains pays d Amérique Centrale et du Sud ainsi que les pays du bassin Méditerranéen comptent aussi de nombreux cas de brucellose humaine. Adapté de [4].

21 consommation de produits laitiers contaminés, par inhalation de poussières ou d aérosols contaminés, ou encore par contact direct avec des animaux infectés (Fig. 3) [9]. Du fait de la contamination possible par aérosol, Brucella est considérée et listée par le Center of Disease Control (CDC) comme un agent du bioterrorisme de la liste B, les agents de seconde priorité. B. suis fut même la première arme biologique développée par les Etats-Unis dans les années avant que le programme ne soit abandonné en Brucella pénètre l organisme par les voies aériennes et la voie orale, elle peut aussi pénétrer par les lésions cutanées et les muqueuses. Chez les animaux, la bactérie va cibler le tractus génital et provoquer des avortements chez les femelles et des infertilités chez les mâles [10]. L infection chez l homme conduit au bout de deux à quatre semaines à une infection aigüe caractérisée par une fièvre ondulante et une asthénie générale. La bactérie se dissémine et peut toucher différents organes. Chez 30 % des patients, cette phase évolue en maladie chronique. Les foyers infectieux sont les os et articulations, le foie, et parfois le cœur ainsi que le système nerveux, ces deux derniers cas provoquent des endocardites et neuro-brucelloses qui peuvent être létales [11]. La transmission d homme à homme étant très rare [12], les contaminations humaines sont très étroitement liées à la présence d un réservoir animal infecté. Le contrôle de la présence de la bactérie dans ces réservoirs est donc critique pour la lutte contre la dissémination de la maladie. I. A. 4. Conséquences et problèmes vaccinaux Les conséquences des infections à Brucella sont premièrement d ordre économique. Des campagnes de vaccinations concernant les animaux domestiques et d élevage ont été déployées pour éradiquer la bactérie dans plusieurs pays comme la France, grâce auxquelles les contaminations humaines sont passées de 405 cas en 1983 à 44 cas en l an 2000 [4]. Parmi les souches utilisées comme vaccins vivants, nous citerons la souche 19 (S19) de B. abortus. Cette souche est éliminée plus rapidement que les souches virulentes chez les bovins vaccinés [13]. De plus, elle induit une immunité protectrice. La souche avec un LPS naturellement rugueux RB51 est aussi utilisée comme vaccin vivant chez les bovins. La 14

22 Figure 3 : Modes de contamination humain et animal. La contamination des hôtes naturels se produit pendant des avortements, par l allaitement, ou encore par contact génital pendant la reproduction. Les contaminations humaines sont dues à la consommation de produits contaminés (lait, fromage), au contact direct avec des animaux infectés, ou l inhalation de poussière. La plupart des cas concernent des fermiers, vétérinaires, ou des personnes travaillant en laboratoire. Adapté de [9].

23 protection induite est inférieure à celle induite par S19 [14]. Bien que cette souche soit moins virulente que S19, il semble qu elle provoque des avortements chez les animaux gravides [15]. De plus, cette souche ayant été obtenue après plusieurs passages sur milieu contenant de la rifampicine et de la pénicilline, elle est donc résistance à ces antibiotiques, ce qui pose un problème de traitement. Une des autres souches actuellement utilisée chez les moutons et chèvres est B. melitensis Rev1. Cette souche porte une mutation dans le gène rpsl codant pour la protéine ribosomale S12, qui confère la résistance à la streptomycine. A ce jour Rev1 est la souche la plus efficace contre la brucellose ovine et caprine. Elle confère en effet 80 à 100 % d efficacité [16]. S19 et Rev1 sont des bactéries ayant un phénotype lisse (ou «smooth» en anglais, S). Cette particularité vient de la composition de leur lipopolysaccharide (LPS) (voir partie I. B. 1). Les vaccins utilisés actuellement chez les animaux, comme Rev1, S19 et RB51 ne sont cependant pas efficaces à 100 % et ne protègent pas contre toutes les espèces de Brucella. Ils induisent en outre des effets secondaires (avortements). Une autre conséquence est l obligation d avoir une campagne de santé publique adéquate en cas de situation endémique. La prophylaxie actuelle pour éradiquer la bactérie est, chez l homme, une combinaison de plusieurs antibiotiques : doxycycline et rifampicine ou doxycycline et streptomycine pendant plusieurs semaines [17, 18]. L élaboration de nouveaux vaccins efficaces chez l homme notamment, reste donc toujours un problème majeur dans la lutte contre la brucellose. La pathogénicité de Brucella est liée à sa capacité à exprimer divers facteurs de virulence agissant à la fois sur les étapes de la vie extracellulaire et intracellulaire de la bactérie. Dans un premier temps, nous allons nous intéresser à décrire les principaux facteurs de virulence importants pour la bactérie, puis nous décrirons sa vie intracellulaire. 15

24 Figure 4 : Structure du LPS de Brucella. Ancré dans la membrane externe de la bactérie, le LPS de Brucella est composé d un lipide A relié au core lui-même relié à une chaîne O-polysaccharide (ou O-antigène). Le lipide A est composé de diaminoglucoses reliés à des chaînes de 18 à 28 carbones. Les LPS ne possédant pas de chaîne O-polysaccharide sont dits rugueux. Adapté de [19].

25 I. B. LES FACTEURS DE VIRULENCE I. B. 1. Le lipopolysaccharide (LPS) Composant majeur de la membrane externe des bactéries à gram négatif, le LPS est un motif associé au pathogène ou PAMP (Pathogen Associated Molecule Pattern) reconnu par des récepteurs immunitaires à la surface des cellules immunitaires tels que les Toll-Like Receptor (TLR) et plus particulièrement TLR4 (voir partie I. D. 1). Le LPS est composé du lipide A hydrophobe inséré dans la membrane bactérienne. Le lipide A est relié à un core polysaccharide, lui-même généralement relié à une chaîne oligosaccharide (chaîne O). On parle alors de LPS lisse. Si le core n est pas relié à la chaîne O, le LPS est défini comme étant rugueux (ou «rough» en anglais, R) (Fig. 4) [19]. Certaines espèces de Brucella ont naturellement un LPS rugueux comme B. ovis ou B. canis, les autres possèdent un LPS lisse. Le phénotype rugueux est quant à lui associé à une élimination des bactéries durant l infection chez la plupart des cas pour ces espèces [20]. Le LPS de Brucella est un LPS non canonique en raison de plusieurs changements au niveau de sa structure comparé à des LPS canoniques plus classiques comme celui d Escherichia coli (E. coli). En effet, le lipide A de Brucella contient un squelette de diaminoglucose alors que les LPS canoniques sont composés de glucosamine, et est relié à des groupes acyles plus longs que pour les LPS classiques (18, 19 ou 28 carbones contre 12 ou 14). Les liaisons au core sont aussi différentes. Dans le cas de Brucella, ce sont des liaisons amines exclusivement, ce qui le différencie des autres LPS d entérobactéries qui présentent des liaisons esters. Le LPS de Brucella a un rôle très important dans la pathogénicité en jouant à la fois sur la vie intracellulaire et le trafic de la bactérie. Mais il a aussi un rôle prépondérant dans la réponse du système immunitaire. Nous reviendrons sur cet aspect dans la partie I. D. 16

26 I. B. 2. Le glucane cyclique β 1,2 (CβG) Les glucanes cycliques sont des composés de l enveloppe de bactéries à gram négatif. Ils ont des rôles divers selon les organismes : par exemple, la stabilité de la membrane des bactéries, la motilité, la synthèse des exopolysaccharides. Composé de 17 à 25 glucoses reliés par des liaisons en β (1,2), le CβG de Brucella est trouvé en forte concentration (1 à 10 mm) dans le périplasme et constitue 1 à 5 % du poids sec de la bactérie. Il a aussi été montré comme crucial pour la survie intracellulaire des bactéries en contrôlant la maturation de la vacuole dans laquelle elle se trouve pour éviter qu elle ne fusionne avec les lysosomes. De plus, en interagissant avec les radeaux lipides et le cholestérol, le CβG a un rôle dans les premières étapes de la vie intracellulaire de la bactérie dans les cellules infectées [21]. Récemment, une étude menée au laboratoire a montré que ce composé avait des propriétés activatrices des cellules dendritiques (DC) murines et humaines. En effet, après stimulation avec le CβG, les DC acquièrent un phénotype mature, caractérisé par une surexpression des molécules de co-stimulation et des molécules du complexe majeur d histocompatibilité de classe II (CMH-II) à la membrane, par une production de cytokines pro-inflammatoire et une capacité à activer les lymphocytes T (LT). Cette activation est un mécanisme dépendant de TLR-4, mais ne dépend pas de CD14, molécule co-réceptrice de TLR-4 [22]. Contrairement aux macrophages, un mutant pour le CβG (cgs-) n a pas de défaut de réplication dans les DC [21, 23]. De plus, cette molécule est non toxique et non immunogénique, ce qui lui vaut d être considérée comme un nouvel adjuvant potentiel [22]. Ce facteur de virulence est donc crucial à la fois pour établir une infection, une vie intracellulaire au sein des cellules hôtes mais aussi pour déclencher une réponse immunitaire. Les différentes réponses induites, selon les cellules ciblées restent inexpliquées. Aucun récepteur reconnaissant le CβG n a été encore identifié, et le fait que cette molécule soit capable d accéder à la BCV reste encore un mécanisme inconnu. 17

27 Outer e ra e I er e ra e Figure 5 : Structure schématique d un système de sécrétion de type IV. Différentes protéines composent le T4SS. Dans le cas d Agrobacterium, le T4SS est composé de VirB5 et VirB2 dans le cytosol de la cellule, puis les protéines VirB7, VirB9 et VirB10 composent le cœur du T4SS qui transporte les molécules à transloquer. Les protéines VirB4 et VirB11 (des ATPases) permettent à l appareil de sécrétion de fonctionner grâce notamment à l utilisation de l ATP. VirB6 et VirB8 forment le complexe entre le cytosol de la bactérie et sa membrane interne. Adapté de [29].

28 I. B. 3. Le système de sécrétion de type IV : VirB Les systèmes de sécrétion ont un rôle essentiel dans la pathogénicité des bactéries. A ce jour, il y a 9 types de système de sécrétion connus [24, 25]. Ces composants sont essentiels à la translocation de protéines au sein de cellules hôtes. Brucella possède un système de sécrétion de type IV (T4SS), tout comme Agrobacterium tumefaciens, Helicobacter pylori, Bordetella pertussis, ou encore Legionella pneumophila [26-29]. Etant donné que la structure T4SS de Brucella n est pas encore complètement caractérisée, les études sont souvent basées sur des analogies avec celui d Agrobacterium. La seringue moléculaire qui traverse la double membrane des bactéries permet la translocation de protéines et d ADN. Elle a donc des fonctions dans la conjugaison, la capture d ADN et la translocation de protéines depuis et vers l environnement externe [30]. L opéron virb est composé de plusieurs gènes : le complexe cytoplasmique-membrane interne est composé de VirB6 et VirB8 qui fonctionne avec les ATPases VirB4, VirB11 [31] pour déclencher les processus de sécrétion. Ce sont les protéines VirB7, VirB9 et VirB10 qui interagissent pour former le cœur du complexe, un canal traversant la double membrane bactérienne. Enfin les protéines VirB2 et VirB5 composent le pillus. D autres protéines, VirB3 et VirB12 semblent avoir un rôle dans l assemblage du pillus (Fig. 5). L expression des gènes de cet opéron est étroitement régulée et dépend notamment de l acidité du milieu. Ainsi, lors d une infection, l expression du T4SS serait maximale après 5 heures d infection et serait réprimée dès lors que les bactéries ont rejoint leur niche réplicative [32, 33]. La régulation par le ph de cet opéron corrèle avec le fait que Brucella réside dans une vacuole (appelée BCV pour Brucella Containing-Vacuole) qui va suivre un processus de maturation au cours du temps. VjbR, un régulateur transcriptionnel liée au quorum sensing, régule l expression de l opéron virb [34]. Le T4SS est essentiel à la survie intracellulaire en permettant la maturation de la BCV [27, 35]. Un mutant virb pour cet appareil de sécrétion ne parvient pas à établir des interactions avec le réticulum endoplasmique (RE), la niche réplicative de Brucella. En absence de T4SS, la bactérie n est pas capable de sécréter les effecteurs permettant la maturation de la BCV. 18

29 Figure 6 : Structure de la membrane de Brucella. La double enveloppe de la bactérie est composée d une membrane externe (ME) sur laquelle le LPS est ancré. Des protéines Omp (Outer membrane protein) sont enchâssées dans la ME et régulées par le système à deux composants BvrS/BvrR, situé dans la membrane interne (MI). Le périplasme, situé entre les deux membranes, contient différents composants dont le CβG. Le T4SS VirB traverse les deux membranes pour permettre la sécrétion d effecteurs dans le cytosol de la cellule hôte.

30 Certaines études in vivo montrent que pendant les premiers jours d infection un mutant virb n est pas atténué, mais qu à partir du 5 ème jour sa réplication est deux fois plus faible que celle de la souche sauvage [36]. VirB serait donc requis pour le maintien de la réplication après les premiers temps d infection et la survie de la bactérie. I. B. 4. Les protéines de membrane externe (Omp) Ces protéines/lipoprotéines sont insérées au niveau de la membrane externe bactérienne (Fig. 6). Brucella spp compte 3 groupes d Omp qui sont classées selon leur poids moléculaire : le groupe 1 (43-94 kda), le groupe 2 (36-38 kda and kda) et le groupe 3 (25-27 kda and kda). Les protéines du premier groupe sont des composantes mineures de la membrane externe de la bactérie. Les protéines du groupe 2 quant à elles seraient pour la plupart des porines [37, 38]. Les Omp du groupe 3 sont présentes en grande quantité dans les extraits provenant des membranes externes et leurs fonctions ne sont pas toutes connues [39]. Dans le groupe 3, les deux premières protéines à avoir été identifiées sont Omp31 et Omp25 (ou Omp3a). Toutefois, Omp31 n est pas exprimée par B. abortus [40, 41]. De nombreuses Omp semblent avoir des fonctions dans la réponse immunitaire. Ainsi, la lipoprotéine Omp19 est connue pour diminuer la présentation antigénique et l expression du CMH-II dans les monocytes humains activés avec de l interferon-γ (IFN-γ) [42]. Omp16 est reconnue par les DC via TLR-4 et induit une réponse immunitaire, notamment via la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires telles que le Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) et l interleukine 12 (IL-12) et la surexpression de molécules de co-stimulation comme CD80, CD86 et CD40. Cette réponse des DC va polariser la réponse immunitaire en une réponse de type Th1 [43]. Omp25, dont l expression est contrôlée par le système à deux composants BvrR/BvrS, joue aussi un rôle dans la réponse immunitaire. Une souche mutante pour Omp25 ( omp25) ne présente pas de défaut de réplication dans les cellules épithéliales (HeLa), les macrophages (Raw et THP-1), les DC humaines ou encore les polynucléaires neutrophiles [44, 45]. Il semble que l absence d Omp25 dans des cellules HeLa induise une plus forte association des bactéries avec les cellules [45]. Une autre étude propose que Omp25 et Omp22, une autre 19