Le comité d'organisation de l'édition 2006 des Journées de la Mesure et de la Métrologie à l'inra vous souhaite la bienvenue à Balaruc-les-Bains.

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2 Le comité d'organisation de l'édition 2006 des Journées de la Mesure et de la Métrologie à l'inra vous souhaite la bienvenue à Balaruc-les-Bains. Cette édition, par son contenu et sa forme, marque la transition en douceur entre les Journées de la Mesure (dont c'est la IXième édition) et les J2M. Nous espérons que ces Journées permettront aux participants de fructueux échanges, car c'est bien là leur fonction première : tisser des liens entre des agents souvent "thématiquement isolés" au sein de leur Unité. Comité d'organisation : Sandra ARRAULT, Christophe GARIN, Patrick GROSS, Patricia MANZANO, Jacques MARATRAY, Olivier MARLOIE, Dalila MOHRATH, Christophe MONTAURIER, Robert PUJOL Logistique : Robert PUJOL (UMR IATE Montpellier) et Martine DUPUPET (MQ Paris)

3 Programme Lundi 9 Octobre L accueil par le personnel du centre Lo Solehau sera ouvert à partir de 17h, néanmoins, le groupe d'organisation des J2M2006 pourra vous accueillir dès le début d'après-midi. Dîner à partir de 19h15 Mardi 10 Octobre 8h00 Petit déjeuner 9h00 Eric MIGNARD (Equipe Communication) Présentation du Centre de Montpellier (15 min) 9h15 Marie-Andrée PIEDALLU (Mission Qualité) / Robert PUJOL (organisation J2M2006) Introduction des J2M 2006 (15 min) Présidente de séance : Marie-Andrée PIEDALLU 9h30 Roland FUSER Vérification des humidités et pesées issues de récolte microparcelles (20 min) 9h55 Sandrine NEGRO Traçabilité des données hydrologiques mesurées sur le bassin versant expérimental de Roujan (15 min) 10h15 Rémi GARDET Système de vérification automatique des sondes de pilotage des sondes de pilotage température et hygrométrie de serres de recherche (20 min) 10h40 Pause Président de séance : Patrick GROSS 11h00 Frédéric PEYRIN - Méthode de mesure de la longueur des sarcomères de la viande par acquisition d image et Transformée de Fourier (20 min) 11h25 François DUPIRE - Validation d une analyse en spectrométrie de masse, application au dosage des PCDD et PCDF (20 min) 11h50 Claire LUC - Méthode de mesure de l anisotropie de fluorescence des tissus animaux structurés : Application à la viande (25 min)

4 12h20 Déjeuner Président de séance : Eric PIETRI 14h00 Intervenants externes : Michel GOHIN (Sté. Johne et Reilhofer S.A.) et Malek ABDI (Sté. DPS Mesures) Capteurs sans fil - Télémesure (1h00) 15h00 Etienne FARRE - Détection automatique de bois de tension sur rondelle de hêtre (15 min) 15h20 Patrick GROSS - PEA FLUO : passeur d'échantillons automatisé pour la mesure de la fluorescence de la chlorophylle à température contrôlée (15 min) 15h40 Jacques MARATRAY - Bé. A. la bouche artificielle (15 min) 16h00 Pause - démonstration de matériel dans le cadre de l'exposé "Capteurs sans fil - Télémesure" 16h30 Courtes présentations des posters par leurs auteurs (5 min par poster) en séance plénière suivie de la séance posters INRA 20h00 Dîner Mercredi 11 Octobre Président de séance : Jean-Marc BONNEFOND 9h00 Anne JAULIN - Evaluation par une méthode in vitro de la bio-disponibilité du plomb chez l'homme par ingestion de terre (20 min) 9h25 Régis BURLETT - Mesure rapide (10Hz) des isotopomères du CO2 atmosphérique par diode laser modulable (TDL) (15 min) 9h45 Christophe MONTAURIER Dérives des analyseurs d'o2 et de CO2 dues aux variations de la pression atmosphérique : conséquences et corrections pour la détermination des dépenses énergétiques de l'homme (15 min) 10h05 Mélynda HASSOUNA - Mesure des émissions gazeuses des bâtiments d'élevage (20 min) 10h30 Pause Président de séance : Robert FALCIMAGNE 11h00 Laurent CHAUNIER - Evaluation par Rapid Visco-Analyzer de l'effet du procédé de transformation sur des préparations à base de maïs (15 min)

5 11h20 Intervenant externe : Eric NATIVEL (Université de Montpellier II - UMR5507) Nanotechnologies (55 min) 12h15 Déjeuner Présidente de séance : Dalila MOHRATH 14h00 Intervenant externe : Jean-Paul THYS (Sté. Visucolor) La mesure des couleurs et le système Visucolor (45 min) 14h45 Intervenant externe : Rémy BELLENGER (CNRS - DRH/BSI) - Microcontrôleurs (45 min) 15h30 Pascal NEVEU Gestion des données de mesure et XML (20 min) suivi d'une démonstration réalisée par Marc PEREZ et Christian PICOU 15h50 Pause 16h30 Séance posters et démonstrations de matériel 20h00 Apéritif musical avec Nuits Ocres, dîner Jeudi 12 Octobre Président de séance : Jacques MARATRAY 9h30 Michel VERGER - Vers un système d'acquisition de données et de métadonnées pour des plantes ou des ensembles de plantes repérés spatialement (20 min) 9h55 Jean-François ASSIER (LNE Paris) Métrologie 10h30 Pause Session de clôture Animation de séance : Sandra ARRAULT, Christophe GARIN, Robert PUJOL 11h00 Discussion sur les propositions de formules pour les futures Journées de la Mesure et de la Métrologie avec les participants, des représentants de la Formation Permanente Nationale, de la Mission Qualité et le groupe de réflexion sur les J2M 12h15 Déjeuner Fin des J2M 2006

6 EVALUATION PAR UNE METHODE IN VITRO DE LA BIO-DISPONIBILITE DU PLOMB CHEZ L'HOMME PAR INGESTION DE TERRE Anne Jaulin et Philippe Cambier INRA, Unité de Physico-chimie et Ecotoxicologie des SolS d Agrosystèmes Contaminés (PESSAC, UR251), Versailles. 1 INTRODUCTION 1.1 Motivations et questions scientifiques La présence de plomb dans l'environnement représente un danger pour l'homme car ce métal toxique peut entraîner notamment des dysfonctionnements rénaux et des troubles du système nerveux central (Ewers & Schlipköter, 1991). Les effets neurotoxiques du plomb touchent particulièrement les enfants soumis à une exposition chronique. Pour les enfants encore plus que pour les adultes, la voie d'exposition principale est la voie orale, qu'il s'agisse d'ingestion de peinture, de poussière, de terre ou de nourriture contaminées. Dans les produits végétaux, une partie du Pb présent provient de dépôts d'origine atmosphérique ou terrestre, une autre partie est réellement assimilée par la plante. L'importance relative de ces 2 contributions varie avec les espèces et les situations (Dalenberg et al, 1990; Davies, 1995; Kabata-Pendias et al, 1993; Streit & Stumm, 1993), mais au total, l'ingestion de formes essentiellement minérales, venant directement du sol contaminé, du crassier ou de la cheminée d'une industrie, est primordiale dans l'exposition des enfants. Cependant, ces formes ingérées ne sont pas entièrement assimilées par l'organisme. Une fraction de Pb peut traverser le tube digestif sans effet, et ceci dépend de la forme chimique du métal toxique et de sa matrice. Cette question de la biodisponibilité du plomb contenu dans différents substrats a fait l'objet de plusieurs travaux scientifiques, associant des tests biologiques et des analyses chimiques. Ruby et al (1996) notamment ont étudié l'influence de différents facteurs et ont par ailleurs développé une méthode d'évaluation de cette biodisponibilité "orale". Plus précisément, Ruby et al (1999) distinguent la fraction biodisponible du métal ingéré (celle qui passe dans le sang) et la fraction "bioaccessible" qui correspond au Pb dissous dans le tube digestif. La méthode d'évaluation qu'ils ont développée consiste à reproduire in vitro les attaques biochimiques qui ont lieu dans le tube digestif et à suivre le Pb extrait du solide analysé (terre, poussière, etc). Ruby et al (1996) et Medlin (cité par Ruby et al, 1999) ont assez bien validé cette approche par des essais sur animaux. Oliver et al (1997) ont aussi tenté une validation de la méthode par une étude épidémiologique sur des enfants vivant dans des zones contaminées par le plomb. Les essais in vivo présentent un avantage certain sur les méthodes biochimiques, mais aussi des limites liées au fait de travailler sur des humains ou des animaux. Il est donc nécessaire de pouvoir les compléter par une approche chimique. 1.2 Objectif du présent travail et approche. L objectif de ce travail est l'évaluation par la méthode de Ruby et al (1996) de la biodisponibilité du plomb contenu dans un sol pollué proche d'une usine utilisant ce métal et dans une poudre utilisée pour la fabrication d'accumulateurs. Pour compléter cette comparaison, nous appliquerons la même méthode à un sol témoin non pollué et à un échantillon de ce sol témoin contaminé au laboratoire avec la poudre industrielle. C-55

7 2 MATERIEL ET METHODES 2.1 Echantillons Deux échantillons de sols, représentatifs des horizons de surface (0-20 cm) de 2 pelouses ont été prélevés en juin 2003, dans une zone urbaine qui fait l'objet d'une évaluation détaillée des risques du fait de la contamination par le plomb. Cette contamination provient majoritairement d'une activité industrielle autour de la fabrication d'accumulateurs. Deux autres échantillons ont été prélevés dans des terres agricoles situées à quelques km de manière à obtenir un matériau de propriétés semblables mais non pollué. Une fois séchés à l air, tamisés à 2 mm et homogénéisés, ces échantillons ont été rapidement analysés pour certaines caractéristiques (ph, teneurs en matière organique et en certains éléments). Ces données préliminaires sont détaillées dans l annexe 1. Nous avons alors sélectionné l'échantillon le plus pollué en plomb, noté ensuite PE, et la terre "témoin" la plus semblable (hormis pour la teneur en Pb). Les analyses ont alors été complétées pour ces 2 échantillons, PE et T1. Les autres échantillons soumis aux expériences sont : une poudre d'origine industrielle contenant plus de 95% de Pb; une terre contaminée au laboratoire, préparée à partir de cette poudre et de l échantillon T1 ; la préparation, détaillée par Bataillard et al (2002 ; 2003), consiste en un mélange à sec avec un robot adapté, un pétrissage avec 10% d'eau et une "incubation" durant 1 mois de ce mélange humide mais non saturé (donc aérobie), visant à atteindre un équilibre chimique à cette échelle de temps. 2.2 Dispositif pour la digestion des échantillons et le prélèvement d extraits. La réaction a lieu dans une cellule d'électrochimie, en verre traité spécialement pour une bonne inertie chimique, avec un couvercle permettant le maintien d'électrodes (rodages), les prélèvements et les ajouts, le tout étant étanche ou sous un flux de gaz parfaitement contrôlable. Les électrodes utilisées sont de type combiné (verre-référence Ag/AgCl) avec sonde de température (Metrohm ). Le ph et la température sont donc mesurés en continu (Methrom Ionomètre 692). Un flux d'argon de 700 ml/min assure une atmosphère sans oxygène durant toute l'expérience, les brèves ouvertures nécessaires au niveau du couvercle ne devant pas permettre à l'air de pénétrer dans cette atmosphère plus dense. Les prélèvements pour analyse et les ajouts sont assurés au travers de tuyaux en Tygon et à l'aide de seringues entièrement en polypropylène. L'ensemble (2 cellules en série) est placé dans une enceinte thermostatée à 37 C. Les solutions servant à l'extraction y sont aussi stockées pour respecter cette température. Le flux d'argon est saturé de vapeur d'eau et réchauffé en passant dans un Erlen d'eau pure qui est aussi placé dans l'enceinte, puis arrive dans la 1 ère cellule et repart vers la 2 e pour s'échapper ensuite. La solution gastrique est composée ainsi (produits Sigma, sauf indication contraire) : 1,25 g de pepsine de paroi stomacale de porc (activité 542 U/mg), 0,5 g de tri-sodium citrate (Normapur Prolabo), 0,5 g de di-sodium DL-malate, 420 µl d'acide lactique, 500 µl d'acide acétique (Normapur Prolabo), qsp 1 L amené à ph 2,5 par ajout d'hcl 0,1M. Environ 1 g d'échantillon (50 mg pour la poudre de plomb), pesé au mg près, est introduit dans la cellule. A t=0, 100 ml de la solution gastrique sont ajoutés et la cellule est fermée. A t=10 min, le flux d'argon et un barreau aimanté commencent à agiter le mélange, et le ph est éventuellement ajusté à l'aide d'une seringue pré-installée contenant HCl 0,1M. Le ph est maintenu à 2,5 durant le reste de l étape gastrique. C-56

8 A t = 20, t = 40 et t = 60 min, 5 ml de suspension sont prélevés et ce volume est re-injecté à l'aide d'une autre seringue pré-installée contenant de la solution gastrique, afin de travailler à volume constant durant au moins cette première étape. Chaque prélèvement est immédiatement filtré à 0,2 µm sur cartouche Millex GS (Millipore) et le filtrat stocké pour analyses. Ces prélèvements sont notés ensuite G20, G40 et G60 min. Après le 3 e prélèvement, le ph est neutralisé en introduisant par un rodage un mince boudin à dialyse contenant 0,5 g de NaHCO 3 dissous dans 5 ml d'eau. D'après le suivi du ph, et d'après des essais préalables, le boudin est retiré avant ph 7 pour atteindre cette valeur sans la dépasser. Cette neutralisation dure environ 30 min. On ajoute alors 1,75 g de sel biliaire et 50 mg de pancréatine de porc (Sigma). C'est le temps 0 de l étape intestinale. Des prélèvements de suspension ont lieu 1, 2 et 3 h après son démarrage et traités comme pour l étape gastrique. Les volumes correspondants, toujours de 5 ml, ne sont cette fois pas compensés. Ces prélèvements sont notés I1h, I2h et I3h. L'expérience a été conduite en disposant à chaque fois dans les 2 cellules un échantillon et un blanc (réactifs sans terre), ou bien 2 échantillons. En tout et en dehors d essais préliminaires, l échantillon pollué PE a été traité 4 fois, les autres échantillons 3 fois, et 9 blancs ont été réalisés. Les blancs ont bien sûr subi les mêmes manipulations que les échantillons, et les mêmes analyses pour 7 d'entre eux, 2 blancs n'étant analysés que pour le premier prélèvement (G20min). Les cellules ont été utilisées sans distinction (pas de cellule consacrée aux blancs ou aux témoins...). 2.3 Analyses chimiques des extraits et des minéralisats. Les concentrations en éléments dissous ont été mesurées par spectrophotométrie d'absorption atomique en flamme (Varian SpectrAA 220). Les effets de matrice ont été contrôlés par la technique des ajouts dosés. L'analyse de Ca et Mg a été faite dans des échantillons dilués acidifiés additionnés de lanthane pour éviter les interférences chimiques. Tous les échantillons et étalons étaient acidifiés avec 1% (v/v) d'acide nitrique concentré pour analyses. 2.4 Traitement et présentation des résultats d extraction. En tenant compte des dilutions éventuelles, la concentration mesurée pour un élément dissous dans la cellule au moment du prélèvement est multipliée par le volume (0,1L jusqu'à I1h, puis 0,095 et 0,090 L), et rapportée à la masse d'échantillon sec. La teneur obtenue est appelée extraite ou "bioaccessible", et sera exprimée en mg/kg sol sec (voir figure n 1), ou en % par rapport à la teneur totale en élément de l échantillon traité. Pour chaque échantillon et à chaque moment de l extraction, la moyenne et l écart-type seront calculés à partir des 3 ou 4 répétitions réalisées. 3 RESULTATS ET DISCUSSION 3.1 Résultats des extractions biochimiques. Les résultats les plus délicats à valider sont ceux concernant l échantillon T1, dont les extraits, même non dilués, donnent des concentrations de Pb inférieures à la limite de quantification par la SAA en flamme. Cependant, les extraits durant l étape gastrique donnent des valeurs significativement supérieures aux blancs de la méthode. Nous avons donc considéré que les concentrations en Pb étaient supérieures à la limite de détection (LD) et les teneurs extraites ont été calculées, de manière au moins indicative, en soustrayant les blancs aux concentrations des solutions G20, G40 et G60 min et en prenant en compte le volume de la suspension et la masse de terre. Les valeurs pour I1h, I2h, I3h sont par contre non différentes des blancs et ont été notées <LD. Pour les 3 autres échantillons, les concentrations de Pb sont nettement plus élevées. Nous avons encore soustrait les blancs aux concentrations obtenues avec les échantillons afin de calculer les teneurs en Pb extrait, bien que ces blancs, représentant de l ordre du % des concentrations des échantillons, soient inférieurs à la limite de quantification. C-57

9 Pb extrait au cours de la digestion (in vitro) Pb (mg/kg) Etape Gastrique Etape Intestinale PE TC T1 PP Temps (min) 0 Figure 1 : Evaluation du Pb "bioaccessible" (Pb dissous) au cours de la digestion in vitro de différents solides (PE pelouse polluée, T1 terre témoin, TC terre polluée au laboratoire, PP poudre industrielle) ; l échelle des ordonnées à droite concerne la poudre PP Les répétitions sont généralement très bonnes, les coefficients de variation pour Pb extrait durant l étape gastrique étant inférieurs à 10% (sauf pour l échantillon non contaminé T1). Ces mêmes coefficients sont <23% durant l étape intestinale plus délicate à contrôler (sauf idem). Pour les autres éléments, les coefficients de variation sont inférieurs à 22% dans 55 cas sur 72, les cas moins satisfaisants correspondant à des extractions faibles (de Mg ou Fe notamment). Les tableaux 1 à 4 ci-dessous présentent en fonction de l échantillon et du moment de l extraction les éléments extraits en % des teneurs totales dans les différents échantillons. La figure 1 reprend les données sur Pb uniquement, exprimées en teneur rapportée à la masse de chaque échantillon traité. On voit que l extraction de Pb de PE en particulier (Tableau 1) est de 40% au bout de 20 min et atteint 49-50% après 40 min. Peut-être atteint-elle un plateau, mais le passage à l étape intestinale avec la neutralisation du ph diminue brutalement le Pb dissous, comme cela a été observé par Ruby et al (1996). Les éléments sensibles à la réduction (Mn, Fe) ne suivent pas du tout la même évolution, augmentant durant l étape gastrique, et ne chutant pas au changement de conditions. L élément Ca qui provient sans doute du complexe d échange et des carbonates est dissous immédiatement à ph 2,5 (G 20 min) et diminue légèrement durant l étape intestinale. Mg dissous provient certainement des mêmes constituants et des feuillets des argiles ; il paraît être en partie refixé lors de la deuxième étape mais la dispersion des mesures est importante pour cet élément avec cet échantillon. Les seules données du tableau 2 ne permettent donc pas de relier l extraction de Pb et d un élément minéral tel que Mn, Fe, Ca ou Mg. Le plomb extrait pourrait provenir de phases plombifères uniquement, ou de plusieurs constituants qui relarguent ce métal avec des cinétiques différentes. Cette mobilisation est attribuable à plusieurs facteurs, notamment au ph acide durant l étape gastrique, à l action de complexants en solution, et à la réduction d oxydes de Mn et Fe (Charlatchka et al, 2000). La re-fixation, durant l étape intestinale, de Pb, et d autres éléments dans une moindre mesure, peut être due à la précipitation de carbonates, phosphates, hydroxydes etc., et à l adsorption sur des sites à charge variable. C-58

10 Tableau 1 : Résultats d extraction de Pb, Mn, Fe, Mg et Ca par la digestion in vitro de l échantillon PE (pelouse polluée en Pb) (G = étape gastrique ; I = étape intestinale) étape élément plomb manganèse fer magnésium calcium Teneur totale (mg/kg) Extrait (en % du total) (moyenne ± écart-type ; n=4) G 20 min 40,1% ± 3,9 17,5% ± 2,1 0,50% ± 0,30 5,2% ± 1,1 70,9% ± 3,7 G 40 min 48,7% ± 3,0 31,0% ± 4,3 0,80% ± 0,50 5,0% ± 2,0 71,8% ± 2,1 G 60 min 49,9% ± 2,5 36,0% ± 4,4 0,98% ± 0,60 3,3% ± 2,0 68,6% ± 2,6 I 1h 18,4% ± 2,1 32,1% ± 6,4 1,58% ± 1,01 4,6% ± 1,4 57,0% ± 2,1 I 2h 16,1% ± 3,6 28,0% ± 5,3 1,56% ± 1,00 2,6% ± 3,4 52,6% ± 1,1 I 3h 12,6% ± 1,1 26,1% ± 4,2 1,36% ± 0,86 3,1% ± 1,6 47,0% ± 5,7 Le tableau 2 montre que le Pb du sol témoin T1 est moins "bioaccessible" que celui du sol pollué PE. Les quantités extraites sont bien sûr très inférieures (Figure 1) mais le pourcentage de Pb extrait est aussi inférieur dans l échantillon T1 par rapport à PE (Tableaux 1 et 2). Il atteint seulement 15% environ au bout de la 1 ère étape, puis devient inférieur à la limite de détection. Les autres éléments analysés ont un comportement assez voisin des mêmes éléments dans PE : Mn progressivement dissous jusqu à 39% diminue ensuite modérément. Fe suit comme dans PE une courbe lentement croissante puis décroissante, avec un maximum plus faible que dans PE (0,9% au lieu de 1,6%). On peut faire les mêmes commentaires pour Mg et Ca. La meilleure reproductibilité obtenue avec T1 pour Mg permet cette fois d affirmer que cet élément, dissous à hauteur de 3% environ en 1 ère étape, diminue de moitié durant l étape intestinale. Tableau 2 : Résultats d extraction de Pb, Mn, Fe, Mg et Ca par la digestion in vitro de l échantillon T1 (terre agricole non polluée) élément plomb manganèse fer magnésium calcium étape Teneur totale (mg/kg) 37, Extrait (en % du total) (moyenne ± écart-type ; n=3) G 20 min 10,7% ± 2,1 26,8% ± 2,4 0,40% ± 0,02 2,96% ± 0,28 78,9% ± 1,0 G 40 min 13,5% ± 4,2 36,2% ± 2,2 0,55% ± 0,03 3,14% ± 0,14 76,4% ± 0,7 G 60' min 15,4% ± 4,3 39,3% ± 1,7 0,63% ± 0,04 3,19% ± 0,08 73,0% ± 0,4 I 1h < LD 29,9% ± 2,5 0,89% ± 0,08 1,87% ± 0,08 61,0% ± 3,2 I 2h < LD 27,2% ± 2,9 0,76% ± 0,08 1,43% ± 0,22 56,3% ± 1,2 I 3h < LD 26,4% ± 2,5 0,69% ± 0,07 1,48% ± 0,33 53,3% ± 1,6 C-59

11 Considérons maintenant le sol contaminé au laboratoire TC (Tableau 3). Par analyse en double d aliquotes représentatives de ce mélange incubé, nous avons trouvé 2709 ± 47 mg/kg de Pb, soit un écart de 5% par rapport à la teneur de PE qui était visée. Il revient donc au même de comparer les extractions de Pb des échantillons PE et TC en mg/kg ou en % des teneurs totales (Tableaux 1 & 3 ou Fig. 1). On voit alors que le plomb est un peu plus bioaccessible dans le sol contaminé TC que dans le sol pollué réel PE en début d extraction gastrique, mais c est l inverse durant l étape intestinale. On ne peut donc conclure à une atténuation du risque du fait de l âge de la pollution. Il faut cependant garder à l esprit les limites apportées à cette comparaison des 2 échantillons. Tableau 3 : Résultats d extraction de Pb, Mn, Fe, Mg et Ca par la digestion in vitro de l échantillon TC (T1 contaminée au laboratoire avec la poudre de Pb, teneur équivalente à PE) élément Plomb manganèse fer magnésium calcium étape Teneur totale (mg/kg) Extrait (en % du total) (moyenne ± écart-type ; n=3) G 20 min 52,3% ± 0,5 16,2% ± 0,3 0,04% ± 0,00 3,9% ± 1,4 64,2% ± 2,9 G 40 min 55,1% ± 0,5 25,3% ± 1,2 0,05% ± 0,00 4,1% ± 1,6 62,1% ± 3,0 G 60' min 56,3% ± 0,6 29,9% ± 1,3 0,06% ± 0,00 4,2% ± 1,6 59,9% ± 3,4 I 1h 15,4% ± 2,8 23,2% ± 1,9 0,07% ± 0,00 4,6% ± 4,0 49,5% ± 2,8 I 2h 9,2% ± 1,2 19,4% ± 3,5 0,06% ± 0,01 4,4% ± 3,8 46,1% ± 2,1 I 3h 8,1% ± 1,9 18,8% ± 3,8 0,06% ± 0,01 4,2% ± 3,7 43,8% ± 2,2 Par ailleurs, l ajout de poudre de plomb à T1 semble avoir diminué la dissolution de Fe et de Ca (Tableaux 2 et 3) ; ceci est peut être attribuable à des effets de compétition entre Pb et ces éléments au niveau des ligands complexants. Concernant la dissolution de Mg, les résultats sont à nouveau dispersés, comme avec PE, ce qui ne permet pas de conclure. Enfin, le tableau 4 montre que Pb de la poudre seule dans les solutions gastrique et intestinale est davantage dissous que lorsque la terre est présente. Ceci est particulièrement significatif pour l étape intestinale : de l ordre de 40% de Pb extrait de la poudre contre 10-15% des sols pollués. Comme en outre, la concentration est en fait beaucoup plus importante avec la poudre, - on en a apporté 50 mg qui contient presque autant de plomb, au lieu de 1 g de terre qui contient moins de 3 mg de Pb -, ces données montrent aussi que ce n est pas la solubilité intrinsèque de Pb qui limite l extraction à 50% (étape gastrique) ou à 15% (étape intestinale) à partir des sols. Ce sont les constituants qui imposent ces limites, soit en fournissant des ions qui forment avec Pb des solides peu solubles (tels que les phosphates), soit en fournissant des sites fixateurs (substances humiques insolubles, oxydes, etc). C-60

12 Tableau 4 : Résultats d extraction de Pb par la digestion in vitro de l échantillon PP (poudre industrielle de plomb) Etape Teneur totale en Pb : mg/kg (estimation) Extrait (en % du total) (moyenne ± écart-type ; n=3) G 20 min 72,8% ± 4,1 G 40 min 71,1% ± 3,5 G 60 min 67,8% ± 3,0 I 1h 46,1% ± 1,1 I 2h 41,0% ± 2,4 I 3h 37,8% ± 2,4 4 DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION L objectif de ce travail est d évaluer la fraction "bioaccessible" du Pb contenu dans différents échantillons, notamment dans un sol pollué (couche 0-20 cm d une pelouse) proche d une usine fabriquant des accumulateurs. La méthode de référence, in vitro, est celle détaillée par Ruby et al (1996). La technique a été suivie, en adaptant certaines indications sur le matériel et les quantités utilisées. Il faut souligner que les rapports ont été conservés, jusque dans les prélèvements qui perturbent un peu le système étudié : Ruby et al introduisaient 0,4 g dans 40 ml avec des prélèvements de 2 ml (compensés en volume durant l étape gastrique) ; nous avons opéré avec 1 g dans 100 ml et des prélèvements de 5 ml. Le travail cité avait la particularité de tester plusieurs niveaux de ph de l étape gastrique, une variable déterminante. Cette question est encore ouverte et ne semble pouvoir être tranchée simplement, puisque le ph à l intérieur de l estomac varie et dépend de ce qu il a absorbé. Nous avons retenu le ph intermédiaire de 2,5, les contrôles étant réalisés en continu dans notre dispositif. Le ph de l étape intestinale doit être neutre, ce qui a été réalisé précisément en début d étape. Le maintien à ph 7 est techniquement délicat, ce qui a été souligné par Oliver et al (1997). Nous avons enregistré des variations de l ordre d une demi-unité ph durant l étape intestinale. Les données acquises sur la fraction de Pb extrait durant cette étape sont cependant reproductibles, avec un coefficient de variation compris entre 8 et 22% pour le sol pollué. Le coefficient est <10% pour l étape gastrique. Nous disposons donc de résultats satisfaisants sur la fraction bioaccessible de Pb dans le sol pollué et dans les autres échantillons chargés en Pb, la poudre industrielle et le sol témoin contaminé au laboratoire. Cette fraction est assez élevée à la fin de l étape gastrique (50% pour le sol pollué), chutant à 18% une heure après le début de l étape intestinale. La comparaison des échantillons entre eux montre que la bioaccessibilité de Pb dans la poudre industrielle est nettement supérieure à celle de sols pollués, du fait des réactions de Pb avec les constituants (adsorption, précipitation?). Ce résultat confirme d autres études. Le sol contaminé au laboratoire au même niveau que le sol pollué réel, incubé un mois afin de ne pas confondre des phénomènes de redistribution et d extraction au cours des 4 h de traitement, a donné du plomb pratiquement aussi bioaccessible que celui du sol pollué (Fig. 1). Ce résultat est plus surprenant. Même si la comparaison souffre de la difficulté d apporter le contaminant sous des formes semblables à celles qui ont contaminé le sol au cours de plusieurs dizaines d années, elle laisse penser que des phénomènes majeurs de mise en équilibre de la poudre avec le sol sont très rapides (< 1mois). C-61

13 Sur le fond du problème qui est le risque de plombémie pour des enfants fréquentant un site pollué, on peut d abord situer les quantités mises en jeu. La dose hebdomadaire maximale admissible selon l OMS est de 25 µg Pb/kg corporel, soit 250 µg/j pour un adulte (Conseil Supérieur d Hygiène Publique de France, 1996). Notre dispositif adapté de celui de Ruby et al porte sur 1 g de terre. L ingestion possible de terre par des enfants serait plutôt de l ordre de 150 mg/jour, soit 1 g/semaine. Mais il ne serait pas chimiquement équivalent d introduire 1 g dans le réacteur en 7 fois ou de le faire comme il a été pratiqué ici en 1 fois dans 100 ml de solution gastrique. Cet aspect repose des problèmes techniques de quantités et de volume à manipuler et analyser. Autrement, le sol pollué se situe bien à un niveau critique, puisque 100 mg de ce sol contient 285 µg de Pb. L évaluation du risque de plombémie passe notamment par l estimation de la fraction de ce plomb qui passe dans le sang, donc qui est d abord dissous au sortir de l estomac et dans l intestin. C-62

14 MESURE RAPIDE (10HZ) DES ISOTOPOMERES DU CO 2 ATMOSPHERIQUE PAR DIODE LASER MODULABLE (TDL) Burlett R., J. Ogée, A. Bosc, L. Wingate & D. Loustau Ephyse, Inra, Centre de Bordeaux, 69 route d Arcachon, 33612, Cestas, France Mots-clés : ISOTOPES STABLES DU CO 2, CARBONE 13, OXYGENE 18, DIODE LASER, CYCLE DU CARBONE, PHOTOSYNTHESE, RESPIRATION 1 Introduction La quantification des flux bruts d eau et de CO 2 entre les écosystèmes terrestres et l atmosphère (photosynthèse, respiration, évaporation et transpiration) et l identification de leur origine sont nécessaires pour mieux appréhender et modéliser les bilans hydriques et carbonés et le fonctionnement des écosystèmes. En effet, plusieurs questions restent en suspens concernant notamment le routage de l eau et l allocation du carbone dans les plantes et le sol, les processus de régulation stomatique ou la quantification des bilans d eau et de carbone à différentes échelles spatiales et temporelles. Les différents isotopomères stables de la vapeur d eau ( 1 H 16 O 18 O, 2 H 16 O 2 ) et du CO 2 ( 13 C 16 O 2, 12 C 16 O 18 O) sont des traceurs atmosphériques complémentaires qui intègrent, dans l espace et dans le temps, les processus biologiques et physiques et permettent d accéder aux flux bruts impliqués dans les cycles biogéochimiques, ainsi qu à leur origine. Ainsi, la méthodologie isotopique, qui consiste à effectuer des bilans de masse pour chacun de ces traceurs, a déjà largement contribué à l amélioration des connaissances sur le fonctionnement des écosystèmes (Yakir & Sternberg 2000 ; Dawson et al. 2002). Classiquement, les analyses isotopiques sont effectuées à l aide de spectromètres de masse. Le développement de protocoles expérimentaux semi-automatiques permet aujourd hui d analyser un nombre croissant d échantillons solides, liquides ou gazeux tout en conservant une bonne précision sur la mesure. Parallèlement, de nouvelles techniques reposant sur des principes de spectroscopie optique rendent possible la mesure rapide (10 Hz) des différents isotopomères de la vapeur d eau et du CO 2 atmosphérique (Bowling et al. 2003, 2005 ; Griffis et al ; Zhang et al ; Lee et al. 2005) et des flux turbulents associés (isoflux). Cette étude vise à décrire les spécificités de cette nouvelle technique isotopique. Nous présenterons plus particulièrement le principe d étalonnage de la mesure absolue de la composition isotopique de l'échantillon étudié par rapport aux standards internationaux. 2 Description du système Le spectromètre optique utilisé pour cette étude est un système commercialisé par Campbell Sci. ( Ce spectromètre est quasiment identique à celui utilisé pour la mesure de gaz traces type méthane, N 2 O et ammoniaque (Edwards et al. 1994). Quelques modifications ont dû être apportées pour la mesure des isotopomères du CO 2 (pour une description plus détaillée, voir Bowling et al. 2003). 2.1 Principe de mesure Les différents isotopomères stables du CO 2 (principalement 12 C 16 O 2, 13 C 16 O 2 et 12 C 16 O 18 O) possèdent des raies d'absorption spécifiques, correspondant à des niveaux d énergie propres à chaque molécule (Fig. 1). L'analyseur de gaz trace TDL exploite ces différences en mesurant, à l'intérieur d'une cellule échantillon, l'absorption d'un faisceau laser infrarouge pour certaines C-63

15 de ces longueurs d onde spécifiques. Contrairement aux analyseurs classiquement utilisés pour la mesure du CO 2 total (analyseurs dits non dispersifs ou NDIR), le spectre d'absorption du laser est ici bien inférieur à la taille d'une raie (Fig 1a). La concentration est déterminée par un balayage des longueurs d'ondes de sortie du laser autour de cette raie isolée de l'élément. a b NDIR - IRGA Figure 1 : spectres d absorption des différents isotopomères stables du CO 2 dans l infrarouge (d après HITRAN database, DeBievre 1984). 2.2 Contrôle de la source laser Afin de produire ce balayage des longueurs d ondes régulier et centré sur la raie désirée on effectue une régulation simultanément de la température de la source et de l intensité du courant d alimentation. La diode laser (SPECDILAS single mode DFB, lasercomponent, Allemagne) est prévue pour fonctionner entre 80 K (-193 C) et 140 K (-133 C) Pour atteindre cette température, la source est placée dans un calorimètre (vase de Dewar) contenant de l azote liquide. Le volume de ce vase permet un fonctionnement en continu pendant environ 5-7 jours. Figure 2 : courant d alimentation de la source laser et réponse du détecteur optique (d après TGA-100 Trace Gas Analyze User and Reference Manual, Campbell Scientific, Inc., 2004). C-64

16 Chaque diode laser est fabriquée en ajoutant des impuretés, ce qui implique des sauts discrets dans les fréquences d émission. Elles sont ensuite caractérisées selon leur fréquence et intensité d'émission afin de sélectionner uniquement celles qui émettent autour de la fréquence désirée. Dans le cas des isotopes stables du CO 2, le balayage des raies doit se situer entre µm et µm (± µm). Afin de scanner en alternance les raies autour de chacun des isotopomères du CO 2 le logiciel permet de spécifier un offset sur l intensité du courant envoyé à la diode laser (Fig. 2). Le cycle de balayage des 3 raies d absorption spécifiques à chaque isotopomère est très rapide (< 10 ms), ce qui permet de mesurer les différents isotopomères quasi-simultanément. 2.3 Le système de mesure Le faisceau laser émis par la diode laser est séparé en deux faisceaux perpendiculaires à l aide d un miroir semi-réfléchissant. Un des faisceau traverse la cellule de référence et l autre faisceau est envoyé sur la cellule de mesure dans laquelle l échantillon d air est aspiré à très faible pression (Fig. 3). Deux détecteurs permettent alors de mesurer simultanément l'atténuation des deux faisceaux laser. La cellule de référence est purgée avec un gaz de concentration en CO 2 élevée (25%) pour obtenir une très forte absorption du faisceau laser. Ce signal d absorption sera utilisé continuellement pour réguler le courant d alimentation de la source laser afin que les raies d'émission restent continuellement dans la gamme d'absorption du gaz mesuré (régulation fine, type PID). 25% CO2 Figure 3 : schéma du système de mesure TGA-100 (d après TGA-100 Trace Gas Analyze User and Reference Manual, Cmapbell Scientific, Inc., 2004). Les détecteurs mesurent le signal 100 fois par seconde, alternant entre les 3 isotopomères ( 12 C 16 O 2, 13 C 16 O 2, 12 C 16 O 18 O). Le signal est automatiquement moyenné par une technique dites de "jump-scan" (Fried et al. 1993), afin d'obtenir un signal à 10 Hz, proportionnel à la concentration de chaque isotopomère. 2.4 Conditions d'utilisation Séchage de l'échantillon Le spectre d'absorption de la vapeur d'eau partage la même région que celui du CO 2. Par conséquent, si l'air mesuré par la TDL n'est pas sec, les molécules d'eau perturbent le balayage des raies, produisant des erreurs de l'ordre de 1 à 2% sur les mesures de concentration. Pour éviter cela, l'air entrant est préalablement séché à l'aide d'un système «Nafion» (PD50, Permapure, USA ; Ce système permet de dessécher l échantillon C-65

17 gazeux en ligne, c est-à-dire pendant son aspiration, en le mettant en contact à un air sec circulant à contre-courant, à travers une membrane hémiperméable appelée Nafion, qui laisse uniquement passer les composants avec un groupe OH comme la vapeur d'eau. Ce système ne se sature pas comme les absorbeurs chimiques et nécessite donc ni entretien ni régénération. Régulation de la pression Si on diminue la pression dans la cellule, les raies d absorption sont plus étroites, ce qui est nécessaire pour éviter qu elles se chevauchent. Pour les raies d absorption du CO 2 choisies ici, une pression inférieure à environ 8 kpa est nécessaire. Dans la pratique, on fonctionne à une pression d'environ 2.0 kpa à l aide d'une pompe à vide (R5 Series, Busch, USA) dont le débit est régulé par un contrôleur de débit (Alicat Sci, USA) et un orifice critique (Swagelok, USA). Il est essentiel en outre que la pression soit stabilisée pour pouvoir effectuer les mesures. Lorsque que l on permute différentes lignes de mesure, le temps de stabilisation de la pression est de l'ordre de quelques secondes et il est d autant plus court que les différents échantillons prélevés ont une pression proche. Le régulateur de débit, qui contrôle la pression, repose sur le principe de la dissipation thermique d'une sonde dans un flux de gaz contrôlé. Ce régulateur étant étalonné pour contrôler le débit d'échantillon d'air, il est important que les bouteilles de gaz utilisées pour l étalonnage de la mesure (voir 3) soient des mélanges de CO 2 dans de l'air et non dans de l'azote pure. Laser "multimoding" Pour une courant électrique donné, la source laser utilisée (un sel de plomb) a une longueur d onde d émission principale bien déterminée. Cependant, ces sels de plomb ne sont pas parfaits et émettent également dans des longueurs d onde parasites. C est ce qu on appel le "multimoding". Pour les diodes laser utilisées ici, environ 3% de l énergie d émission a lieu dans ces fréquences parasites. Les détecteurs peuvent potentiellement mesurer ce signal parasite car il induit un offset systématique. Pour déterminer la valeur de cet offset, on utilise le signal mesuré dans la cellule de référence où circule un gaz concentré en CO 2 (25%). Du fait de la forte concentration en CO 2, la totalité de l énergie dans la longueur d onde principale est absorbée, de sorte que le signal mesuré correspond alors à l énergie résiduelle résultant du "multimoding". 3 Traitement des données et étalonnage 3.1 La notation «delta» Pour les éléments chimiques légers comme le carbone ou l oxygène, les isotopes stables légers ( 12 C, 16 O) sont les plus abondants et les autres espèces isotopiques stables ( 13 C, 18 O) sont toujours en très faibles quantités par rapport à l espèce la plus abondante (< 1%). Le rapport de concentration entre les différents isotopes stables ( 13 C/ 12 C, 18 O/ 16 O) est appelé rapport isotopique. Afin de faciliter l inter-calibration des mesures isotopiques entre laboratoires, les teneurs isotopiques sont généralement exprimées sous forme d un écart («delta») par rapport à un standard international. Un delta négatif correspond à une teneur en isotopes lourds plus faibles que les standard international. Cependant ces écarts entre rapports isotopiques restent relativement faibles et sont donc souvent exprimées en «pour mille» ( ) : R échantillon δéchantillo n = Rstandard (1) C-66

18 où R échantillon est le rapport isotopique de l échantillon étudié, R standard est le rapport isotopique du standard international et δ échantillon est l écart entre ces 2 rapports isotopiques, exprimé en «pour mille». Il existe différents standards pour chaque type d'isotopes. Pour le CO 2, l échelle VPDB (Vienna Pee Dee Belemnite) est maintenant définie par l Agence Internationale de l'energie Atomique (AIEA) comme l'échelle de référence. Les rapports isotopiques de ce standard sont R standard ( 13 CO 2 / 12 CO 2 ) = et R standard (CO 18 O/CO 16 O) = (Allison 1995; Coplen, 2006). 3.2 Etalonnage Fréquence d étalonnage et choix des gaz étalons Etant donné la faible concentration et la relativement faible variation des isotopes dans l'air, la TGA a été optimisée pour augmenter la résolution de l instrument (ou diminuer sa limite de détection). Pour cela, on chauffe légèrement le détecteur et on décale un peu le focus optique de la diode de manière à augmenter la trace du faisceau laser sur le détecteur, ce qui a pour effet d amplifier et de rendre plus linéaire la réponse de ce dernier. Cependant, ceci se fait au détriment de la précision de l appareil, c est-à-dire de la détermination de la valeur absolue des concentrations. Pour accéder à la valeur absolue de l'échantillon, il est donc indispensable de procéder à un étalonnage régulier de l appareil. Ceci se fait en encadrant chaque mesure d'air par une série de gaz étalon, caractérisés à la fois en CO 2 total et en teneurs isotopiques (δ 13 C-CO 2, δ 18 O-CO 2 ) par rapport à des standards internationaux. Pour chaque série de mesure et pour chaque isotopomères on établit alors une courbe d'étalonnage à partir de la moyenne des mesures des séries de gaz étalons jouxtant la série de mesure (Fig. 4). Ces courbes d'étalonnage sont alors utilisées pour corriger les mesures instantanées de concentrations de la série de mesure. Les deltas sont alors calculés à partir de ces concentrations instantanées corrigées, suivant l'eq. 1. Un étalonnage en 3 ou 4 points, répartis dans la gamme de mesure attendue ( µmol mol -1 ), avec des courbes d'étalonnage de type polynôme de degré 2 permet alors d obtenir des résultats précis au champ et sur une longue période (Bowling et al. 2005). Par exemple, l'utilisation de 4 gaz étalons et un polynôme de degré 2 assure une incertitude de mesure de l'ordre de 0.15 µmol mol -1 pour la concentration en CO 2 total, et de l'ordre de 0.15 VPDB pour δ 13 C-CO 2 (Bowling et al. 2005). Corrections des effets de non-linéarité du détecteur La réponse des détecteurs n'est pas parfaitement linéaire et le logiciel fourni par Campbell permet de corriger en partie ces erreurs liées à la non-linéarité (Bowling et al ; Griffis et al. 2005). Des tests en laboratoire ont montré que, pour des concentrations en CO 2 total dans la gamme µmol mol -1 la réponse de l instrument restait linéaire (Bowling et al. 2005) mais que, en dehors de cette gamme, des réponses non-linéaires (atténuation du signal en 13 CO 2 ) pouvaient apparaître (D. Bowling, communication personnelle). Pour les faibles concentrations en CO 2 total, cette atténuation pourrait être liée au fait que le signal est inférieur à la limite de détection du détecteur mais pour les concentrations élevées, l atténuation du signal est plus énigmatique mais pourrait être liée au fait que les raies liées à 12 C et 13 C ne réagissent pas de façon identique aux fortes concentrations car elles ne correspondent pas à la même région de leur spectre d'absorption respectifs (D. Bowling, communication personnelle). Cependant, ces effets non-linéaires semblent dépendre de la configuration de l appareil et n affectent que les valeurs absolues des concentrations. Le rapport isotopique, exprimé en delta, ne semble lui pas sujet à de tels non-linéarités sur de plus larges gammes de concentration en CO 2 total (Griffis et al. 2005). L utilisation de gaz étalons sur une plus large gamme de concentration en CO 2 total pourrait permettre de tester et C-67

19 éventuellement de corriger de tels effets non-linéaires sur notre système et suivant le type d application recherchée. Détermination du CO 2 total Le système TGA mesure un signal proportionnel aux concentrations en isotopomères ([ 12 CO 2 ], [ 13 CO 2 ] et [ 12 C 18 O 16 O]), mais les gaz étalons, eux, sont fournis avec des caractérisations en [CO 2 ] total, δ 13 C-CO 2 et δ 18 O-CO 2. Or le CO 2 total contient du 12 C 16 O 16 O ( 98.5%), du 13 C 16 O 16 O ( 1.1%) et du 12 C 18 O 16 O ( 0.4%) mais aussi d autres isotopomères en traces (< 0.1%). Les valeurs exactes de ces différents rapports dépendent bien entendu du réservoir de CO 2 étudié. Afin de pouvoir calibrer la TDL avec les valeurs donnée pour chaque gaz étalon, on doit donc estimer une valeur de CO 2 total à partir des mesures en concentration mesurées. On écrit donc : [ CO2 ] = [ C O2 ] + [ C O2 ] + [ C O O] + [ CO2 ] total autres [ C O2 ] + [ C O2 ] + [ C O + f [ CO 2 ] total (2) La valeur du facteur f dans l Eq. 2 dépend du réservoir de CO 2 mais, pour des abondances naturelles, ce facteur est de l ordre de 0.1%. Dans la pratique on suppose qu il est donc nul. En revanche, si la TDL est utilisée en mode «2 rampes», c est-à-dire pour ne mesurer que 2 isotopomères du CO 2 ([ 12 CO 2 ] et [ 13 CO 2 ] ou [ 12 CO 2 ] et [ 12 C 18 O 16 O]), alors ce facteur correctif sur le CO 2 total n est plus négligeable et doit impérativement être pris en compte (Bowling et al ; Griffis et al. 2005). 13 CO2 concentration [µmol mol -1 ] séquence 1 séquence Temps [s] 13 CO2 TDL [µmol mol -1 ] CO 2 MS [µmol mol -1 ] Figure 4 : (a) Exemple d'une séquence de 6 minutes de mesure de teneur en 13 CO 2 avec 3 gaz étalon et 2 points de mesure. Les valeurs standardisées des teneurs en 13 CO 2 de chaque gaz étalon sont indiquées par les carrés gris. (b) Courbe d étalonnage du spectromètre optique à l aide des 3 mesures de gaz étalons. 4 Discussion - Conclusion D une manière générale, la mesure des isotopes stables nécessite de prendre de nombreuses précautions, notamment si l on envisage d effectuer des mesures sur le terrain et sur de longues périodes. Le système que nous décrivons présente un atout majeur pour le déploiement sur site qui est d être basé sur un chemin optique court et simplifié, positionné C-68

20 sur un châssis afin d éliminer les vibrations mécaniques. Par rapport aux cellules «multipassages» comme les cellules de Herriot, ce court trajet optique facilite grandement l alignement des optiques. En revanche, cela réduit l'absorption du faisceau optique et donc augmente la limite de détection du signal. Il est donc nécessaire d'utiliser un système d'émission du laser précis et régulé, ce qui implique un temps de maintenance assez élevé (refroidissement de la source à l'azote liquide deux fois par semaine). Il est également nécessaire de fonctionner en soumettant l'échantillon sous vide, ce qui implique une source d'énergie importante rendant difficile le fonctionnement sur un site isolé. D'autres types de spectroscopes optiques existent pour mesurer les isotopes stables du CO 2, qui nécessitent moins de maintenance et peuvent fonctionner à des températures régulables par un simple Peltier. C est le cas du laser à cascade quantique (McMannus 2005) ou des spectromètres de type "cavity ring-down" (Wahl 2006). Cependant, à l heure actuelle, aucune de ces techniques n'atteint la résolution, et surtout la fréquence de mesure du TGA100. Ce dernier semble donc actuellement le plus approprié pour étudier les bilans d eau et de carbone des écosystèmes terrestres à différentes échelles spatiales et temporelles. 5 Bibliographie Allison, C. E., R.J. Francey, and H.A.J. Meijer, (1995). Recommendations for the reporting of stable isotope measurements of carbon and oxygen in CO2 gas, in Reference and intercomparison materials for stable isotopes of light elements: proceedings of a consultants meeting, Vienna (IAEA-TECDOC-825). p Bowling D.R., Sargent S.D., Tanner B.D. & Ehleringer J.R. (2003) Tunable diode laser absorption spectroscopy for stable isotope studies of ecosystem-atmosphere CO 2 exchange, Agricultural and Forest Meteorology, 118, Bowling D.R., Burns S.P., Conway T.J., Monson R.K. & White J.W.C. (2005) Extensive observations of CO 2 carbon isotope content in and above a high-elevation subalpine forest, Global Biogeochemical Cycles, 19(3), GB3023. Coplen, T., Brand, W., Gehre, M., Groning, M., Meijer, H.., Toman, B., and Verkouteren, R (2006) New Guidelines for 13 C Measurements Anal. Chem., 78, 7, , Dawson T.E., Mambelli S. Plamboeck A.H., Templer P.H. & Tu K.P. (2002) Stable isotopes in plant ecology, Annual Review of Ecological Systems, 33, De Bievre, M. Gallet, NE Holden, ILBarnes, (1984) Isotopic Abundances and Atomic Weightgof the Elements, J. Phys. Chem. Ref. Data, 13, Edwards G.C., Neumann H.H., den Hartog G., Thurtell G.W. & Kidd G. (1994) Eddycorrelation measurements of methane fluxes using a tunable diode laser at the Kinosheo Lake tower site during the Northern Wetlands Study (NOWES) Journal of Geophysical Research, 99(D1), Farquhar G.D., Lloyd J., Taylor J.A., Flanagan L.B., Syversten J.P., Hubick K.T., Wong S.C. & Ehleringer J.R. (1993) Vegetation effects on the isotope composition of oxygen in atmospheric CO2. Nature, 363, Flanagan L.B. & Ehleringer J.R. (1998) Ecosystem-atmosphere CO2 exchange: interpreting signals of change using stable isotope ratios. Tree, 13, Fried B., Henry J. & Drummond R. (1993) Tunable diode laser ratio measurements of atmospheric constituents by employing dual fitting analysis and jump scanning. Applied Optics, 32(6), 821. Griffis T., Lee X., Baker J.M., King J.Y. & Sargent S.D. (2005) Feasibility of quantifying ecosystem-atmosphere C 18 O 16 O fluxes and discrimination mechanisms using laser spectroscopy, Agricultural and Forest Meteorology, 135, C-69