Contrôle exercé par le répresseur

Transcription

1 Contrôle de la transcription de l opéron lac Les gènes de l opéron lac sont contrôlés par une REGULATION NEGATIVE Ils sont transcrits sauf s ils sont sous la coupe d une protéine régulatrice Contrôle exercé par le répresseur

2 Quel est la nature du produit codé par le gène I? Expérience PAJAMO (Pardee AB et al. (1959) J. Mol. Biol. 1, 173) Conjugaison Hfr I + Z + x F - I - Z - On ne s intéresse qu aux cellules receveuses; les cellules donneuses sont tuées. Démonstration de l existence du répresseur lac : Expérience de conjugaison *

3 Rôle du composant qui répond à l'inducteur (la protéine répresseur codée par laci) dans le contrôle de la transcription des gènes structuraux laczya en réponse à l'environnement Les gènes structuraux sont transcrits en un seul ARNm à partir d'un promoteur situé juste en amont de lacz. L'état du répresseur détermine si ce promoteur sera initié ou non. 1- absence d'inducteur : pas de transcription, liaison à l'opérateur de la protéine répresseur (dans sa forme active). 2- addition d un inducteur : transformation du répresseur en une forme inactive qui quitte l'opérateur. transcription débute alors au niveau du promoteur et se poursuit le long des gènes jusqu'à un terminateur situé quelque part au-delà de laca.

4 Fonctionnement de l opéron lac d E. coli en l absence de lactose La protéine répresseur se fixe à l opérateur et empêche la transcription. L ARN polymérase peut se fixer au promoteur quand le répresseur est présent sur l opérateur mais il ne peut y avoir initiation de la transcription. *

5 Fonctionnement de l opéron lac d E. coli en présence de lactose *

6 répresseur lac Comment fonctionne le répresseur? le répresseur est contrôlé par une petite molécule inductrice La synthèse d enzymes en réponse à l apparition d un produit spécifique est appelée induction.

7 répresseur lac Répresseur lac (suite) Le répresseur lac : - un tétramère de sous-unités identiques de 360 résidus disposées selon 3 axes de symétrie d ordre 2, mutuellement complémentaires (chaque sous-unité lie une molécule d IPTG avec une constante de dissociation K = 10-6 M) 1- en l absence d inducteur, liaison non spécifique du répresseur sous forme tétramérique à l ADN double brin (K = 10-4 M) 2- en présence d inducteur, liaison spécifique du répresseur opérateur lac (affinité supérieure K = M). Deux domaines fonctionnels pour chaque sous-unité : - un domaine N-terminal de 58 résidus : liaison à l ADN (mais pas à l IPTG) - le restant : liaison à l IPTG. Le répresseur lac trouve l opérateur en se liant de façon non spécifique à l ADN et en diffusant sur sa longueur selon une recherche à une dimension. Le répresseur se fixe à un ADN double-brin contenant la séquence de l'opérateur lac de type sauvage. Le répresseur ne se fixe pas à un ADN de mutant O c. L'addition d IPTG in vitro libère le répresseur de l'adn opérateur. *

8 répresseur lac Pièce maîtresse Fixation à l opérateur cœur Fixation de l inducteur Domaine C-terminal Oligomérisation * (Lewis et al. (1996) Science 271, 1247) Structure de la sous-unité du répresseur lac. Il existe plusieurs domaines indépendants dans la molécule.

9 répresseur lac IMPLICATIONS STRUCTURALES de l INDUCTION Changement de la structure du noyau par l inducteur : les pièces maîtresses d un répresseur ne sont plus dans une orientation qui permet la fixation à l ADN. En bleu : domaine de fixation à l ADN En rouge : hélices α impliquées dans la tétramérisation En vert : sites de fixation de l inducteur En jaune: petites hélices de liaison * Structure d un dimère du répresseur lac

10 Annexe 13 Model of lac repressor tetramer (4 polypeptides) protein.

11 Effet de l IPTG sur la structure du répresseur lac La structure du répresseur lac sur lequel est fixé l inducteur IPTG est présentée en orange; superposée à cette structure est présentée, en violet, la structure du répresseur lac associé à l ADN. La fixation de l IPTG induit un changement de la structure du répresseur ce qui altère les contacts établis avec l ADN.

12 Modèle de liaison d un répresseur tétramérique à deux opérateurs Lorsqu un répresseur tétramérique se fixe à 2 opérateurs, la séquence d ADN entre eux est contrainte en une boucle étroite. La structure en bleue au centre de la boucle d ADN est la protéine régulatrice CAP, qui se fixe dans la même région. Boucle de l ADN (fragment de 93pb) formée lorsque le répresseur lac est fixé en O 1 & O 3.

13 opérateur Opérateur lac - l opérateur lac occupe ~ 35 bp - il est situé en aval du promoteur et couvre celui-ci - il présente 2 séquences symétriques (séq. palidromique imparfaite) - ~22 bp sont protégées des nucléases lors d une expérience d empreinte - l affinité du répresseur pour l opérateur est 4x10 6 plus forte que pour une séquence d ADN quelconque Séquence de l opérateur *

14 opérateur Interactions entre l opérateur et le répresseur La séquence des bases de l opérateur lac *

15 opérateur L opérateur possède une caractéristique commune à de nombreux sites de reconnaissance : il est palindromique. Il est formé de 2 séquences répétées inversées; chaque répétition peut être considérée comme un demi site pour l opérateur. Séquence de l opérateur lac : centré autour d un GC en +11

16 résumé Footprints of RNA polymerase and lac repressor on lac control-region DNA.

17 résumé Séquence nucléotidique de la région promoteur lac-opérateur lac d E. coli, depuis la région C-terminale de laci (à gauche) à la région N-terminale de lacz. Les séquences palindromiques de l opérateur et le site de liaison de CAP sont surlignées ou soulignées (d après Dickson RC et al., Science , 32) Le répresseur et l ARN polymérase se fixent sur des sites qui se chevauchent au niveau du point de départ de l opéron lac. *

18 opérateur L opéron lac comprend 3 sites de fixation pour le répresseur lac. * O 1 O 2 O 3 : the original operator : 410 bp downstream in lacz : 83 bp upstream in laci

19 L opéron lac est également soumis à une régulation positive Un autre mécanisme régulateur appelé répression catabolique est mis en œuvre.

20 Répression catabolique : mis en évidence Phénomène de diauxie Le colibacille (E. coli) utilise le glucose du milieu comme source d énergie. Si on remplace le glucose par du lactose, la croissance cesse. La croissance reprend rapidement lorsque les cellules ont produit les enzymes nécessaires à la conversion du lactose en glucose. Quand deux sources de carbone particulière sont présentes ensembles dans le milieu de culture, la courbe de croissance est biphasique : phénomène de diauxie. *

21 Répression catabolique Cinétique de synthèse de l ARNm de l opéron lac suite à l induction par l IPTG puis après addition de glucose. Glucose : métabolite de choix d E. coli *

22 Comment s exerce l effet du glucose? L effet répressif du glucose est médié par l AMPc et une protéine appelée activateur des gènes cataboliques (CAP ou CRP)

23 Mécanisme de transport des sucres chez E. coli La plupart des sucres sont transportés chez E. coli par le système PTS : phosphotransférase dépendante du PEP Les sucres transportés sont phosphorylés lors de leur acheminement dans la cellule. Ainsi le glucose entre dans la cellule sous la forme de glucose-6-phosphate. Le groupement phosphate est transféré au PEP par l intermédiaire d une série de protéines.

24 Entrée du glucose dans la cellule bactérienne Glucose Glucose-6-phosphate EN PRESENCE DE GLUCOSE P roducti on d AMP c ACTIVATION de GENES *

25 Répression catabolique CRP (cyclic AMP [camp] re cep tor p rote in), également appelée C AP (cataboliteacti va t or p rotein) L AMPc s accumule quand le glucose est absent. Quand le glucose est présent - l adénylate cyclase est inhibée - AMPc phosphodiestérase est activée. glucose - Adénylcyclase AMPc ATP AMPc phosphodiestérase + glucose * AMP

26 La répression catabolique : plus généralement représente un système de coordination générale de régulation système qui marque sa préférence pour l utilisation du glucose en inhibant l expression des opérons qui codent les enzymes des voies métaboliques alternatives déclenchée dans la cellule par la réduction de la concentration de l AMP cyclique (AMPc) NH 2 N N O P O O N N O - O OH Structure de l AMP cyclique (AMPc)

27 Répression catabolique Le glucose entraîne une répression des catabolites en diminuant la concentration de l AMPc. AMPc glucose Concentration réduite en AMPc CAP active CAP inactive transcription Pas de transcription

28 Répression catabolique Sucre(s) dans le milieu de culture Quantité relative de β- galactosidase Glucose 1 induction répression Glucose + lactose 50 Lactose 2500 *

29 Les niveaux de contrôle de l expression de l opéron lac 3 Scénarios : 1- Pas de lactose présent L opéron est éteint, pas d ARNm synthétisé 2- Lactose présent; glucose présent également La présence du lactose inactive le répresseur il y a Transcription Parce que le Glucose est présent camp est faible CRP ne peut aider la transcription 3- Lactose présent; pas de glucose la présence de lactose inactive le répresseur il y a Transcription Il n y a pas de Glucose [camp] est élevée camp se fixe à la CRP (activation) CRP se fixe & aide la transcription Niveau élevé de transcription

30 CAP est un régulateur positif et l AMPc la molécule inductrice Le produit du gène I (répresseur lac) est un régulateur négatif; le lactose ou l IPTG la molécule inductrice. *

31 CRP CAP : ce qu il faut retenir 1- active la transcription de plus de 100 promoteurs (facteur de transcription global). 2- protéine d environ 45 kda qui se fixe à l ADN sous la forme d un dimère (2 sousunités identiques. 3- le 1 er des activateurs transcriptionnels a avoir été isolé (1970) et le 1 er pour lequel la structure 3D a été déterminée. 4- en présence d AMPc, forme un complexe (CRP-AMPc) qui se fixe à une séquence cible de 22pb, située près ou au sein du promoteur qu il contrôle 5- active la transcription du fait de contacts protéine-protéine avec l ARN polymérase *

32 * La protéine CRP : organisation structurale

33 CRP Structure du complexe AMPc-CAP avec un ADN duplex comprenant un motif palindromique de 30pb.

34 CRP Séquence consensus pour la fixation de la protéine CAP AANTGTGANNTNNNTCANATTNN TTNACACTNNANNNAGTNTAANN Pentamère hautement conservé Pentamère moins conservé La séquence reconnue par CAP contient le pentamère TGTGA qui est bien conservé et (parfois) une inversion de cette séquence (TCANA).

35 CRP La protéine CAP crée un coude de plus de 90 dans l ADN autour du centre de symétrie.

36 Cooperative binding of Lac Repressor results in the formation of a DNA Loop Lac Repressor = tetramer O 1 O 2 *

37 CRP Site de fixation de l AMPc-CAP Mutations rendant le promoteur indifférent à CAP A T T A ATGTGAGTTAGCTCACACATT 3 TACACTCAATCGAGTGTGTAA Axe de symétrie Nucléotides aux contacts de l AMPc-CAP * Promoteur

38 CRP Démonstration expérimentale du rôle joué par la protéine CAP dans l expression de la β-galactosidase A mutant CRP protein with 10 lower affinity for camp: if camp-crp complex important for activation then mutant should have reduced production of β-galactosidase

39 CRP CAP Sites de liaison de CAP en des positions différentes par rapport au point de départ de la transcription - le pentamère TGTGA orienté dans un sens ou dans l autre -92 AraC 1- site de liaison de CAP : à l intérieur du promoteur cas du locus gal 2- site de liaison de CAP : adjacent au promoteur cas de l opéron lac 3- site de liaison de CAP : en amont du promoteur cas de l opéron ara

40 CRP Il existe 3 classes de promoteurs dépendant de CAP : Classe I - promoteurs qui requièrent uniquement CAP pour qu il y ait activation - promoteurs avec un seul de liaison pour CAP, localisé en amont du promoteur Le site pour CAP peut être à des positions différentes mais toujours sur la même face de l ADN EXEMPLE : opéron lac lac AR1-61 CAP réalise des contacts avec le α-ctd de l ARN pol.

41 CRP Classe II- Promoteurs requièrent uniquement CAP pour qu il y ait activation Promoteurs présentent un seul site pour la protéine CAP qui recouvre le promoteur remplaçant la boîte 35 EXEMPLE : gal P1-41.5

42 CRP Classe III- promoteurs requièrent 2 exemplaires (ou plus) de la protéine CAP Exemples: arabad & malk.

43 Positions et séquences des 3 opérateurs Effets de mutations sur chacun des 3 opérateurs *

44 Le rép resse urlac inhibela tra ns crip tion e n f orma nt une boucle da ns l ADN Différents modèles 1- région promotrice de l opéron lac 2- transcription 3- répression : modèle 1 : fixation du répresseur en O 1 & O 3, promoteur libre, site CAP toujours occupé ARN pol. pas fixée au promoteur 4- répression : modèle 2 : fixation du répresseur lac en O 1 & O 2, site CAP toujours occupé, ARN pol fixée au promoteur mais pas de synthèse d ARN car blocage de l ARN pol. par le répresseur *

45 Pour résumer -en l absence de lactose, une protéine tétramérique, possédant deux sites de fixation à l ADN se fixe, en premier lieu, sur le principal opérateur O 1 puis soit sur O 2 soit sur O 3. Deux des quatre sous-unités du répresseur reconnaissent O 1 ; les deux restantes reconnaissant soit O 2 soit O 3. - en général le répresseur se fixe en O 1 & O 3 provoquant la formation d une structure en boucle de l ADN entre les deux sites ce qui empêche l ARN polymérase de se fixer au promoteur et donc d initier la transcription. - en fait la transcription n est pas complètement bloquée : une faible transcription a lieu même en la présence du répresseur fixé en ses opérateurs. -en présence de lactose, la lactose perméase permet, dans un premier temps, l entrée d une petite quantité de lactose, lequel est transformé en allolactose (un isomère structural du lactose) par la β-galactosidase. - l allolactose se fixe alors en des sites de la protéine répresseur provoquant un changement de conformation de celle-ci ce qui la rend incapable de se fixer aux séquences opérateur. - ainsi, avec l opérateur «libéré» du répresseur, l ARN polymérase peut se fixer à la région promotrice et initier la transcription. *

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48 Cooperative binding of camp-cap and RNAP on the lac promoter camp-cap contacts the α-subunits of RNAP and enhances the binding of RNAP to the promoter.

49 Motif «Helix-Turn-Helix «These structures show three sequence-specific DNA-binding proteins that interact with DNA through a helix-turn-helix motif (highlighted in yellow). In each case, the helix-turn-helix units within a protein dimer are approximately 34 Å apart, corresponding to one full turn of DNA.

50 Un exemple d utilisation en génie génétique de l opéron lac Phénomène d α-complémentation

51 α-complémentation Utilisation de souches bactériennes mutantes dans le gène lac Z : synthétisent une β-galactosidase incomplète (dépourvue d'une séquence appelée peptide α) et inactive. La séquence codant le peptide α peut être apportée en trans par un plasmide ; seul, le peptide α n'a aucune activité enzymatique, mais associé avec la protéine codée par lac Z' il restaure l'activité β-galactosidase de la protéine mutante.

52 α-peptide site actif α-peptide site actif lacz délétion de 90pb lacz ( M15) lacz Protéine dimérique INACTIVE α-complémentation α-peptide Protéine tétramérique ACTIVE Protéine ACTIVE *

53 Genomic LacZ ( 15 mutant) β-galactosidase X-Gal white Genomic LacZ ( 15 mutant) Plasmid encoded LacZ X-Gal white α β-galactosidase X-gal product

54 Suivi de la réaction catalysée par la β-galactosidase Le galactoside substrat X-Gal forme, suite à son hydrolyse, un produit coloré.

55 +/- insert pbluescript : vecteurs de clonage permettant de distinguer les bactéries véhiculant un vecteur recombinant de celles qui véhiculent un vecteur non recombinant. Caractéristique majeure : le segment du gène lac Z codant pour le peptide α est placé à cheval sur les sites de clonage. 2 situations : 1- lorsque l'adn est inséré à ce niveau, il interrompt le peptide α et les colonies bactériennes apparaissent blanches sur les boîtes de Pétri. 2- par contre, si aucun ADN n'est inséré, l'α complémentation peut avoir lieu et les bactéries apparaissent bleues.