Les nouvelles technologies de séquençage au Genoscope. Jean-Marc Aury, France Denoeud

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1 Les nouvelles technologies de séquençage au Genoscope Jean-Marc Aury, France Denoeud

2 Introduction Présentation du Genoscope et des activités liées aux NTS Séquençage et assemblage des génomes procaryotes Plateforme de détection de mutations par capture Annotation des génomes eucaryotes par RNA-Seq Annotation du génome de la vigne

3 Genoscope (Centre National de Séquençage) Parmi les plus grands centres de séquençage en Europe Fait partie du CEA depuis mai 2007 Activité centrée aussi bien autour de projets propres que de projets collaboratifs A participé à des projets génomiques de grande envergure : projet génome humain, Arabidopsis, Riz, Anophèle, Coordination de grands projets de séquençage : Tetraodon, Paramécie, Vigne, Oikopleura, Mais aussi des génomes de champignons (Botrytis, Truffe) et de nombreux procaryotes

4 Genoscope (Centre National de Séquençage) Activités liées aux NTS : Séquençage de génomes procaryote (2007) Transcriptomique / Annotation de génomes eucaryotes (2008) Détection de mutations (2008) Métagénomique procaryote (2008) Séquençage de génomes eucaryotes (2009) Génomique fonctionnelle (2009)

5 Genoscope (Centre National de Séquençage) Capacité de séquençage : 19 ABI /Roche Titanium 2 GA2 Illumina 1 Soli d v3

6 Genoscope (Centre National de Séquençage) Niveaux d accès aux capacités du Genoscope par Appel d Offres Projet Séquençage Assemblage, finition Annotation procaryote (MAGE) Annotation eucaryote (GAZE)

7 Séquençage de génomes procaryotes

8 Séquençage de génomes procaryotes Objectifs : diminuer le cout du séquençage des génomes procaryotes produire des séquences de qualité finie : taux d erreur < 10-4 (moins d une erreur tous les 10Kb) Principe : Incorporer des données issues de NTS utilisables pour assembler des génomes de novo Les données produites par le pyroséquençage sont différentes des données Sanger : évaluer la qualité des données brutes estimer la proportion de séquence nécessaire pour produire un assemblage de qualité

9 Séquençage de génomes procaryotes 454 / Roche Genome Sequence FLX 2006 Gs20 20Mb / run 100pb / lecture 2007 GsFLX 100Mb / run 250pb / lecture 2009 Titanium 500Mb / run 500pb / lecture Version actuelle (GS FLX) : Majorité des lectures à 250bp Environ lectures / run et 100Mbp / run Durée du run : 8h Taux d erreurs non négligeable dans les homopolymères Assemblage de qualité à environ 20X Pas de biais de clonage

10 Séquençage de génomes procaryotes 454 / Roche Genome Sequence FLX Un run sur Acinetobacter baylyi (3,5Mb) : lectures - taille cumulée de 96Mb, soit 26,7 équivalents génome (26,7X)

11 Séquençage de génomes procaryotes 454 / Roche Genome Sequence FLX Alignement des lectures au niveau nucléotidique : lectures mappées (soit 99,68%) nt alignés contenant erreurs (soit 8, erreurs, de l ordre de 10-3 à en sanger) 17% délétions, 62% insertions, 21% mismatches (12% de Ns). Erreurs concentrées autour des régions homopolymériques => le taux d erreur n est pas constant, il dépend du taux d homopolymères

12 Séquençage de génomes procaryotes 454 / Roche Genome Sequence FLX

13 Séquençage de génomes procaryotes 454 / Roche Genome Sequence FLX Quelle profondeur de séquençage nécessaire?

14 Séquençage de génomes procaryotes 454 / Roche Genome Sequence FLX Quelle profondeur de séquençage nécessaire?

15 Séquençage de génomes procaryotes 454 / Roche Genome Sequence FLX Quelle profondeur de séquençage nécessaire?

16 Séquençage de génomes procaryotes Sanger Unpaired 454 Unpaired + PE 454 Coverage 7.4X 20X 25X Assembler Arachne (Broad Institute) Newbler (454/Roche) Newbler (454/Roche) # of contigs Contigs N50 (Kb) # of scaffolds Scaffolds N50 (Kb) 2, ,000 Assembly size (% of reference) 3.417Mb (95%) Mb (98%) Mb (98%) Mis-assemblies # of errors 3, Substitutions 2, Insertions / Deletions

17 Séquençage de génomes procaryotes Structure de l assemblage satisfaisante (plus de scaffolds => banque de 3 et 10Kb pour le sanger contre 3Kb pour 454 PE) Meilleur représentation du génome (couverture homogène) Taux d erreurs trop élevé pour une qualité finie : ~ 1 erreur / 8,5Kb, et surtout composé de nombreux indels (problématique pour l annotation) Idée : ajouter des lectures présentant un type d erreur différent pour corriger les indels de l assemblage 454

18 Séquençage de génomes procaryotes Illumina / Solexa Genetic Analyzer 1G Test sur Acinetobacter baylyi (3,5Mb) : environ 10M de lectures de 36pb taille cumulée de 440Mb, soit 120 équivalents génome (120X) Lane6 Lane7 Lane8 Mapped reads 87,75% 89,74% 88,76% 100% (length) mapped reads 78,38% 81,05% 79,80% Perfect reads 68,17% 71,41% 69,27% # of aligned bases # of errors (0,377%) (0,347%) (0,386%) Insertions 0,17% 0,15% 0,14% Deletions 1,02% 1,03% 0,99% Mismatches 98,81% 98,81% 98,87%

19 Séquençage de génomes procaryotes Alignement des lectures illumina sur l assemblage 454 en utilisant Soap (alignements gappés) : 2 mismatches et 3 gaps maximum Elimination des lectures alignées de façon non-unique Chaque différence est conservée si elle satisfait les critères suivants : Elle n est pas située dans les 5 premières et dernières bases de la lecture La qualité de la base en question et des bases encadrantes est >= 20 Les séquences flanquantes ne sont pas des homopolymères Une différence est considérée comme une erreur de séquence si : Elle est vue au moins par 3 lectures différentes 70% des lectures alignées à cette position sont en accord Ces critères qualités entrainent une chute de la couverture

20 Séquençage de génomes procaryotes Quelle profondeur de séquençage nécessaire pour corriger le consensus 454? A 50X, reste 163 erreurs : 51 sont dues à des erreurs dans la séquence de référence ou à la présence de variations (cultures différentes). 112 sont localisées dans les régions répétées (pas de couverture solexa) ou en extrémité de contigs.

21 Séquençage de génomes procaryotes Step Sequenced reads Uniquely mapped reads Filtered reads Number of reads Number of bases Genome coverage 50,0X 45,5X 16,9X Alignement des lectures illumina sur l assemblage 454 en utilisant Soap (alignements gappés) : 2 mismatches et 3 gaps maximum Elimination des lectures alignées de façon non-unique Chaque différence est conservée si elle satisfait les critères suivants : Elle n est pas situé dans les 5 premières et dernières bases La qualité de la base et des bases encadrantes est >= 20 Les séquences flanquantes ne sont pas des homopolymères

22 Séquençage de génomes procaryotes Sanger Unpaired + PE 454 unpaired + paired 454 with Illumina / Solexa GA1 Coverage 7.4X 25X 25X and 50X Assembler Arachne (Broad Institute) Newbler (454/Roche) Newbler (454 / Roche) # of contigs Contigs N50 (Kb) # of scaffolds Scaffolds N50 (Kb) 2,200 1,000 1,000 Assembly size (% of reference) 3.417Mb (95%) Mb (98%) Mb (98%) Mis-assemblies # of errors 3, (1 erreur / 8Kb) 163 (1 erreur / 22Kb) Substitutions 2, Insertions / Deletions

23 Séquençage de génomes procaryotes

24 Séquençage de génomes procaryotes Genomic DNA Roche/454 sequenced paired-end library to a ~7x fragment size coverage (for 3Kb fragments) Add 454 unpaired data to a final 25x coverage Newbler assembly Correct errors with ~50x Solexa/illumina short reads data High quality draft (< 10-4 error rate)

25 Séquençage de génomes procaryotes Until December 2006 : 12x with Sanger technology, 3 libraries (insert sizes 3 kb, 10 kb, 40 kb) Assembly with Phrap or Arachne From january 2007 : 4x Sanger, single library (10 or 40 kb) + 20x GS20 reads Assembly with Arachne (Broad Institute) using Sanger reads and Newbler contigs From June 2007, 4x Sanger, single library (10 or 40 kb) + 15x GSFLX reads Assembly with Newbler2 using Sanger reads and GSFLX reads From June 2008, 7x 454 PE (3kb) x GSFLX reads + ~50x Solexa Assembly with Newbler2 using Sanger reads and GSFLX reads and finishing with inhouse software

26 Plateforme détection de mutations par capture Laboratoire de Ressources Génomique : Gabòr Gyapay Laboratoire de Séquençage : Patrick Wincker Laboratoire d Analyse BIoinformatique des Séquences : François Artiguenave, Vincent Meyer, Marc Wessner, Benjamin Noel

27 Plateforme détection de mutations Objectifs : détection de mutations sur des grands génomes (typiquement l humain) sur plusieurs individus en parallèle pour un cout raisonnable Principe : définir des régions d intérêts sur ces grands génomes de plusieurs mégabases amplifier spécifiquement ces régions par capture séquençage haut-débit Utilisation de puces Nimblegen pour la capture et séquençage en 454 Quels types de projets? Maladies génétiques rares (dermatologie, nevrologie, etc ). Cancerologie. Autres thématiques venant d appels de proposition du Génoscope (analyse du génome humain et d autres mammifères, etc ).

28 Plateforme détection de mutations Digital Light Processing technology

29 Plateforme détection de mutations

30 Plateforme détection de mutations Projet pilote : sélection de gènes, exons, taille cumulée d environ 4 Mb 8 échantillons : 4 échantillons tumoraux et 4 échantillons normaux appariés avec 1 run GSFLX par échantillon (soit ~ 100Mb) régions ciblées : 3,97Mb (moyenne de 300pb) Après passage chez NimbleGen : régions ; 5,6Mb (moyenne de 400pb) Régions séléctionnées Régions capturées

31 Plateforme détection de mutations Alignement des lectures provenant des 8 échantillons sur le génome humain Calcul de la sensibilité et de la spécificité de la capture

32 Plateforme détection de mutations Alignement des lectures provenant des 8 échantillons sur le génome humain B C D E F G H I # lectures # lectures alignées (88%) (85%) (94%) (88%) (89%) (76%) (90%) (90%) # lectures chevauchant des régions cibles (69%) (64%) (63%) (66%) (44%) 977 (3%) (69%) (8%) # lectures incluses dans des régions cibles (49%) (49%) (50%) (46%) (45%)) 424 (43%) (44%) (39%) # régions cibles touchées (92%) (93%) (96%) (93%) (79%) 783 (6%) (92%) (20%) # régions cibles entièrement couvertes (82%) (86%) (83%) (82%) 8610 (65%) 142 (1%) (82%) 622 (5%)

33 Plateforme détection de mutations B C D E F H Couverture initiale 42,9 53,3 35,1 35,1 41,1 29,6 Couverture moyenne 13,9 15,8 12,7 11,5 10,5 10,1 Couverture minimale Couverture maximale 80,7 102,2 102,1 113,0 111,0 86,0 # régions couvertes à 10X (53%) (60%) (54%) (44%) (31%) (41%) Avec >30X initialement, on ne couvre qu environ 50% des régions avec une couverture supérieure à 10X

34 Plateforme détection de mutations Taille des fragments: bp Séquençage de ~225 bp région ciblée région couverte avec les séquences

35 Plateforme détection de mutations % lectures chevauchant des régions cibles % régions cibles touchées % régions cibles couvertes > 10X ,54 0,75 2,58 4,12 5,19 8,81 10,1 11,5 13,9 15,8

36 Plateforme détection de mutations Les régions faiblement couvertes sont souvent communes à différents échantillons => biais de capture

37 Plateforme détection de mutations Initialement environ variations de haute qualité Une 50aine de variations à valider par re-séquençage après classification et sélection Les critères de sélection importants : qualité de la variation (profondeur de séquence) localisation de la variation comparaison entre échantillon et avec les variations connues

38 Annotation de génomes eucaryotes avec des données de RNA-Seq

39 Annotation de génomes eucaryotes Objectif : annoter des génomes eucaryotes à partir de données de transcriptome issues de séquençage haut-débit (Solexa/Illumina ou Solid) Difficultés : Prédire une structure de gène avec des tags d une 40aine de bases Aligner les tags qui tombent sur une jonction exon/exon (alignements gappés avec au plus 5 gaps) Molecular biology: Power sequencing. Brenton R. Graveley. Nature 453, (26 June 2008)

40 Annotation de génomes eucaryotes Short-Read Sequencing Technologies for Transcriptional Analyses. Simon SA, Zhai J, Nandety RS, McCormick KP, Zeng J, Mejia D, Meyers BC. Annu Rev Plant Biol Jan 9.

41 Annotation de génomes eucaryotes mapped reads coverage depth 1. covtigs construction genome ag 2. candidate exons covtig 100 nt gt threshold covtigs forward and reverse candidate exons Etape 1. construction des covtigs Etape 2. Extraction des exons candidats

42 Annotation de génomes eucaryotes Définition imprécise des bornes exoniques GGTGTTCACTACTTAGCCATGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTTAGAAAGCTG... covtig Tags mappés Tags non mappés TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCAAACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCT TGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCT CTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTTAGAAAGC TCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTTAGAAAG CTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTTAGAAAGC CTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTTATAAAG ATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTTAGAA CTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTTAGAAAG CTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTTATAAAG ATCTAGATTTCACACTTTTAGAAGCCTTAGAA GACACCATGAAGATCTAGATTTCACACTTTTAG CACCAACACCATGAAGATCTAGATTTCACACTT CACCAACACCATGAAGATCTAGATTTCACACTT CGACACCATGAAGATCTAGATTTCACACTTTTA CCAGCACCCACCAACACCATGAAGATCTAGATT CACCAACACCATGAAGATCTAGATTTCACACTT GGTGCACCCACCAACACCATGAAGATCTAGATT CAACACCATGAAGATCTAGATTTCACACTTTTA CCAACACCATGAAGATCTAGATTTCACACTTTT CACCAACACCATGAAGATCTAGATTTCACACTT Amélioration : Extension des covtigs avec les tags non mappés

43 Annotation de génomes eucaryotes Variation de couverture au niveau exon et gène - données simulées - données réelles Variation au niveau exonique : - biais expérimentaux - épissage alternatif Biais Global entre 3 et 5 exons

44 Annotation de génomes eucaryotes unmapped reads word dictionary k-mer 1 X 1 Etape 3: Validation des jonctions exons/exons Validation of junctions between candidate exons using a word dictionary built from the unmapped reads.. k-mer 2 k-mer n X 2 X n verify words existence in the dictionary candidate exons gt ag validated junction covtig1...ggtgttcactacttacccatgt...agatctacacacttttagaagcctgaaag... covtig2 Mots dérivés TTACCCAT CTTACCCAT ACTTACCCAT TACTTACCCAT CTACTTACCCAT ACTACTTACCCAT CACTACTTACCCAT TCACTACTTACCCAT TTCACTACTTACCCAT GTTCACTACTTACCCAT ATCTACACACTTTTAGA ATCTACACACTTTTAG ATCTACACACTTTTA ATCTACACACTTTT ATCTACACACTTT ATCTACACACTT ATCTACACACT ATCTACACAC ATCTACACA ATCTACAC Validation de la jonction Tags non mappées Création du dictionnaire TGTTCACTACTTACCCATATCTACACACTTTTAGAA TGTTCACTACTTACCCATATCTACA TCACTACTTACCCATATCTACACACTTTTAGAAGCC GTTCACTACTTACCCATATCTACAC GTTCACTACTTACCCATATCTACACACTTTTAGAAG TTCACTACTTACCCATATCTACACA TTCACTACTTACCCATATCTACACACTTTTAGAAGC TCACTACTTACCCATATCTACACAC TGTTCACTACTTACCCATATCTACACACTTTTAGAA CACTACTTACCCATATCTACACACT GTTCACTACTTACCCATATCTACACACTTTTAGAAG... GTGTTCACTACTTACCCATATCTACACACTTTTAGA

45 Annotation de génomes eucaryotes 4. graph of candidate exons linked by validated junctions Etape 4: Création du graphe des exons candidats Open Reading Frame G-Mo.R-Se models 5. model construction and coding sequence detection M1 M 2 M3 M 4 M5 M 6 M 7 T 1 T 2 Real transcripts T 3 Etape 5: Construction des modèles de gènes et détection de séquences codantes Parcours du graphe, un chemin représente un transcrit Recherche d un cadre de lecture dans chaque transcrit Une séquence codante (CDS) est dite plausible si elle fait au moins 50 acides aminés et couvre au moins 2/3 du modèle Les modèles M1, M2, M5 et M7 modélisent correctement les transcrits T1, T2, T3 et T5 Certains chemins ne représentent pas des transcrits réels (modèles M3, M4 et M6) T 4 T 5

46 Annotation de génomes eucaryotes Méthode baptisée G-Mo.R-Se (Gene MOdeling using Rna-Seq), téléchargeable à cette adresse : Utilisable sur des données solexa, mais facilement adaptable à des données Solid (colorspace) Méthode utilisée pour annoter le génome de la vigne

47 Annotation du génome de la vigne avec des données de RNA-Seq

48 Utilisation de G-Mo.R-Se pour l'annotation du génome de la vigne mapped reads coverage depth threshold covtigs 1. covtigs construction genome Génome de Vitis vinifera: 500 Mb RNA-Seq : 173 millions de lectures Solexa/Illumina (4 tissus: feuille, racine, tige, callus) 138 millions de lectures mappées avec SOAP (position unique, max 2 mismatches) : 73.5 Mb Seuil de profondeur pour construire les covtigs: 4 (minimise les splits et les fusions dans les modèles finaux -par rapport à l'annotation de référence) ( Mb covtigs (38.5 Fusions % of exons from predicted models that fuse at least two reference exons Splits % of reference exons that are split by model exons threshold

49 Utilisation de G-Mo.R-Se pour l'annotation du génome de la vigne 2. candidate exons covtig 100 nt covtigs ag gt forward and reverse candidate exons 35 millions de lectures non mappées 3. junction validation unmapped reads. word dictionary k-mer 1 k-mer 2 k-mer n X 1 X 2 X n verify words existence in the dictionary Pour chaque covtig on teste 20 voisins candidate exons gt ag validated junction jonctions validées

50 Utilisation de G-Mo.R-Se pour l'annotation du génome de la vigne 4. graph of candidate exons linked by validated junctions Open Reading Frame modèles avant fusion M1 M 2 M3 M4 T 1 T 2 G-Mo.R-Se models Real transcripts 5. model construction and coding sequence detection M5 M 6 T 3 T 4 M 7 T 5 ( loci modèles (19486 ( loci avec CDS plausible (12341 Run G-Mo.R-Se : ~ secondes (1.7 jours) sur 1 CPU + mapping des lectures : ~ secondes (0.8 jours) sur 1 CPU

51 Evaluation de G-Mo.R-Se contre les gènes de référence de Vitis vinifera Chevauchement nucléotidique entre lectures/covtigs/modèles et les différents compartiments relatifs à l'annotation de référence 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Exons de l'annotation de référence Reads Covtigs Models SP SN 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Introns + régions intergéniques Reads Covtigs Models Seuil de couverture pour construire les covtigs Validation des jonctions Seuil de couverture pour construire les covtigs Validation des jonctions SP= % of nucleotides in reads/covtigs/models falling in the compartment SN= % of nucleotides in the genomic compartment overlapped by reads/covtigs/models

52 Comparaison de G-Mo.R-Se avec l'assemblage direct des lectures par Velvet Chevauchement entre gènes de référence et contigs Velvet / modèles G-Mo.R-Se % reference exonic nucleotides covered reference genes overlapped on >=1 nt reference genes overlapped on >=75% nt Velvet assemby+mapping 24.8% 12,270 (40.3%) 3595 (11.8%) G-Mo.R-Se models 42.9% 15,323 (50.3%) 9306 (30.6%) Profondeur pour les gènes de référence chevauchés par Velvet / G-Mo.R-Se G-Mo.R-Se Velvet

53 Comparaison de G-Mo.R-Se avec l'assemblage direct des lectures par Velvet Exemple d'un gène annoté par G-Mo.R-Se et fragmenté par Velvet Comparaison entre Velvet et G-Mo.R-Se pour la prédiction de la structure exacte des transcrits (cdnas): Transcripts and loci derived from cdnas G-Mo.R-Se Velvet Transcripts with exact structure predicted (total : 9829) Genes having at least one transcript with exact structure predicted (total: 7895) 4600 (47%) 2529 (26%) 4407 (56%) 2509 (32%)

54 Epissage alternatif détecté dans les modèles G-Mo.R-Se Nombre de transcrits par locus Nombre de modèles/transcrits G-Mo.R-Se (all) G-Mo.R-Se (plausible CDS) cdnas * Nombre de loci Nbr de modèles/locus * ~ ESTs multiexoniques assemblées en structures non redondantes ( G-Mo.R-Se (95% de ces clusters sont détectés par Evénements d'épissage alternatif Events common to cdnas and models Models (all) Models (CDS) (% of cdna cdnas 7,895 loci 19,486 loci 12,341 loci events) alternative acceptor/donor % % % 156 (22.6%) skipped % % % 18 (7.2%) mutually exclusive 4 0.4% % % 1 (25.0%) intron retention (IR) (944 without Total IR) 11, (18.5%) Total number of loci with alternative splicing (% of all ident ified loci) 783 (9.9%) (598 without IR) 1602 (8.2%) 1029 (8.3%) - G-Mo.R-Se n'est pas optimisé pour détecter les événements d'épissage alternatif de façon exhaustive, mais détecte davantage d'événements que le séquençage de cdnas

55 Epissage alternatif détecté dans les modèles G-Mo.R-Se

56 Amélioration de l'annotation de la vigne: Identification de nouveaux gènes Caractéristiques des modèles G-Mo.R-Se «nouveaux» vs «connus» Number of loci Number of models Avg number of models per locus Avg number of exons per model Number of models with more than 2 exons Known model loci Models with a All models plausible CDS ( 65% ) 18,811 12,236 45, ( 83% ) 37,644 28, ( 90% ) 25,428 Novel model loci Models with All models a plausible ( 17% ) CDS ( 17% ) 128 Exemple d'un gène nouveau identifié par G-Mo.R-Se ( 53% ) 56

57 Amélioration de l'annotation de la vigne : exemple de fusion de gènes 10% des gènes de référence correspondent à des splits qui ont pu être corrigés grâce aux modèles G-Mo.Rse. 40 % des gènes de référence sont étendus en 5' ou 3' par des modèles G-Mo.R-Se.

58 Conclusion Nous avons montré la faisabilité de l'approche G-Mo.R-Se pour prédire des gènes de novo à partir de données RNA-Seq sur un génome complexe. Cette approche a permis d'annoter davantage de gènes ( à partir de 175 million de lectures RNA-Seq) que le séquençage d'ests ( sequences Sanger), en particulier des gènes faiblement exprimés. Même si G-Mo.R-Se n'est pas dédié à la détection d'épissage alternatif, il permet de détecter un grand nombre de variants d'épissage (souvent peu exprimés), et d'enrichir l'annotation de la vigne. Il sera utilisé pour l'annotation de l'assemblage 12X du génome de la vigne. Cette approche sera particulièrement utile pour l'annotation de génomes dans des phylums avec peu de ressources (ESTs, protéines proches).