Centre de Référence sur l Huître. Bilan 2012

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1 Centre de Référence sur l Huître Bilan 2012

2 Sommaire Présentation du Centre de Référence sur l Huître Programme GIGAVIR FRE BioMEA Université de caen Basse Normandie Cadre général 1. Etude transcriptomique des phénomènes de surmortalités sur estran 2. Compréhension du phénomène infectieux en milieu contrôlé 3. Perspectives et projets 2013 Programme ASIL IFREMER LER-N Port en Bessin Cadre général Phase 1: Peut on évaluer l efficacité des méthodes de diagnostic du statut sanitaire des lots (lors de leur réception)? Phase 2: Peut on définir les périodes au cours desquelles s effectue la contagion? Phase 3: Peut on moduler la résistance des lots, lors de leur réintroduction sur les zones d élevage traditionnelles, par les pratiques zootechniques? Bilan général du programme ASIL Programme Portbail Laboratoire Départemental Frank Duncombe Objectifs Protocoles Résultats et discussion Bilan Bilan général Programme «Etudes des mortalités en 1ère et 2ème année pendant et après isolement en bassin ou en site sanctuaire. CFPPA Coutances Cadre général Etat des lieux Objectifs Protocole Résultat et discussion Bilan de l étude Bilan général des opérations d isolement Perspectives Observatoire d agents infectieux de l huître sur les cheptels ostréicoles basnormands (2012) Comité Régional de la Conchyliculture Normandie Mer du Nord Contexte matériels et méthodes Résultats et discussion Conclusion

3 Programme GIGAVIR Aude Jouaux (IGR), Christophe Lelong (MCU-HDR), Michel Mathieu (Pr) FRE3484 BioMEA CNRS INEE, Université de Caen - Basse Normandie Partenaires : SMEL : Jean Louis Blin CFPPA : Michel Le Guillois LFD : Maryline Houssin

4 Cadre général : Le programme GIGAVIR repose sur une collaboration entre l unité de recherche Université de Caen Basse Normandie - CNRS INEE FRE3484 BioMEA «Biologie des Mollusques marines et Ecosystèmes Associés» (ex UMR PE2M) dirigée par le Pr Pascal Sourdaine et le Laboratoire Frank Duncombe (LFD). L objectif est la mise en place d un axe de recherche sur les surmortalités du naissain dont les travaux s inscrivent dans le cadre du Centre de Référence sur l Huître (CRH). Depuis Août 2012, ce programme est entré dans une seconde phase (GIGAVIR2), financé à 50% par le CRBN et à 25% par les Conseils Généraux du Calvados et de la Manche. Face aux surmortalités du naissain, la nécessité de mettre en place une démarche de sélection génétique visant à obtenir des souches résistantes a été considérée comme prioritaire. Deux projets menés par des écloseries privées sont en cours et ont pour objectif la production de naissain triploïde offrant des capacités de survie améliorée. Un autre programme de sélection (SCORE) mené par le CNC suite à un appel à projet lancé par le Ministère de l Agriculture en juin 2011 vise en complément à permettre la reconstitution de bancs de géniteurs pour le captage naturel avec des souches présentant également ce caractère de résistance à l OsHV-1. En parallèle à cette démarche, il est impératif d apporter aux professionnels des données objectives pour conduire à une réflexion sur les pratiques culturales. En effet, les surmortalités actuelles liées au virus OsHV-1, la présence généralisée de Vibrio, l émergence de nouvelles pathologies sont des signes évidents d une grande fragilité des cheptels en élevage. La mise à disposition de souches résistantes à l OsHV-1 sans remise en cause des pratiques actuelles conduira inéluctablement à de nouveaux problèmes dans les années à venir. L efficacité de ces plans de sélection nécessite de comprendre les relations entre les hôtes et leur pathogène mais aussi de déterminer ce qui distingue les huîtres résistantes des huîtres sensibles. Ainsi les orientations principales du programme GIGAVIR sont i) de fournir des outils pour valider les pratiques culturales ou compléter des procédures de qualification du naissain et ii) d identifier des marqueurs génétiques pour une «sélection assistée».

5 1. ETUDE TRANSCRIPTOMIQUE DES PHENOMENES DE SURMORTALITES SUR ESTRAN Les événements de surmortalités virales du naissain et des juvéniles (1 ère et 2 nde années d élevage respectivement) présentent une même dynamique chaque année. Observés en premier en Corse à l Étang de Diane, ils progressent vers l Étang de Thau, puis à Arcachon, et remontent la côte Atlantique pour atteindre en dernier celle de la Manche. Cette progression et les différents relevés, semblent lier ces surmortalités à l élévation de la température de l eau au-dessus de 19 C. Pour permettre d enrayer ce phénomène, il est primordial de déterminer l origine de ce phénomène infectieux et les modes de contamination des huîtres par le virus, pour prendre à terme des mesures zoosanitaires et orienter les professionnels vers des pratiques culturales adaptées. a- Rappel L an dernier du naissain qualifié de naïf après une analyse en individuel sur 120 naissains (prévalence de 2.5% d OsHV-1 à des niveaux inférieurs à 1000UG/50mg de chaire) et un comportement sans mortalités ni montée de charge virale en challenge thermique (test biologique consistant à placer des animaux dans un contexte favorable d expression de la mortalité). Une partie de cet échantillon était restée maintenue en bassin isolé à Blainville sur mer à la CABANOR du CFPPA, une autre avait été placée sur la concession expérimentale de Cricqueville en Bessin (14) et enfin un dernier lot a été mis en élevage à Blainville sur mer sur la zone des parcs ostréicoles. La mesure de la charge virale suivie régulièrement au cours de l expérimentation montrait de fortes charges virales uniquement en site ostréicole lors des périodes de mortalités. Des surmortalités n ont été observées que sur le lot élevé en zone conchylicole (figure 1). Figure 1 : Schéma représentant l organisation de l expérimentation menée pour obtenir des animaux dans des contextes de contamination tranchés. Le même lot d individus qualifié de naïf a été suivi dans différents scénari soit en bassin à terre ou en zone sanctuaire soit en zone ostréicole. Afin d appréhender les relations entre l huître Crassostrea gigas et le virus OsHV-1, nous avons privilégié une approche au niveau génomique. En effet, les progrès récents obtenus dans le cadre du séquençage du génome de l huître nous ouvrent l accès aux techniques de microarrays ou puces à ADN. Cette technique permet la comparaison du niveau d expression de tout le génome pour des animaux différents (ex. : adultes vs naissain, 2n vs 3n) ou soumis à des traitements différents (ex. : présence vs absence de virus, ). Nous disposons aujourd hui de séquences uniques (EST) disposées sur une lame de verre et qui couvrent environ 80% du génome de l huître. Le plateau PROTEOGEN de la SF ICORE dispose des équipements nécessaires pour l analyse des puces à ADN. Les microarrays ont d ores et déjà été initiées au laboratoire pour explorer la spécificité de chaque tissu de l huître, mais aussi les caractéristiques de chaque stade de gamétogenèse des diploïdes (Dheilly et al., 2011 et 2012). Lors de la vague de surmortalité rencontrée en 2011, nous avons pu effectuer un échantillonnage d huîtres sur estran afin de comparer les niveaux d expression des gènes de l huître dans deux situations contrastées : exposées ou non exposées à une surmortalité.

6 Les animaux étudiés par puce à ADN sont issus d un même lot de naissain «naïf» provenant d écloserie élevé soit sur parc ostréicole exposé à la contamination virale à Blainville sur mer (47% de mortalités) soit dans un site «sanctuaire», à Cricqueville en Bessin ou en bassin à la Cabanor (4,5% de mortalités). Les ARN de ces animaux ont été extraits puis marqués à la cyanine 3 avant d être hybridés sur lames de microarray. Après scannage des lames, plusieurs analyses ont été réalisées pour discriminer des gènes différentiellement exprimés chez les animaux exposés ou non à des surmortalités. b- Identification de gènes régulés lors d un épisode infectieux Ces travaux nous avaient permis d identifier des gènes régulés lors d un épisode infectieux. Brièvement, la comparaison entre les animaux infectés et sains a permis d obtenir à partir d un test ANOVA composé de 2 groupes d animaux infectés et 2 groupes d animaux sains, une liste de 249 séquences différentiellement exprimés (figure 2). Tout d abord sur la figure 2, on remarque que les animaux sains (CAB et CRIC) et les animaux infectés (BL et i) se regroupent entre eux. Ces 249 séquences s organisent entre elles et sont surexprimées en vert ou bien sous exprimées en rouge chez le naissain d huître infectés comparés au naissain sain. Il y aussi un petit nombre de séquences qui évoluent en fonction du milieu d élevage des animaux comme on peut le voir dans le premier groupe de 7 séquences sur la figure 2. Figure 2 : Résultats obtenus lors de l ANOVA à 4 groupes présentant les gènes différentiellement exprimés entre le naissain contaminé et le naissain non contaminé. La partie gauche représente l expression selon un dégradé de couleur vert pour sous exprimé et rouge pour surexprimé. Les graphiques représentent le graduel d expression de séquences identifiés dans les différents cas de figures. Seulement 51% des 249 séquences étaient annotées mais ces annotations ont été complétées à partir des données récentes du génome de l huître (Zhang et al. 2012). Cette première liste a donc était

7 réduite à une liste de 128 gènes. Les fonctions de ces gènes ont été recherchées par gène ontologie et ont permis de classer ces gènes entre eux à partir de cette analyse (Figure 3). La majeure partie des gènes identifiés correspondent à des gènes dérégulés de la cellule hôte, 68% des gènes. Vingt-six pourcents correspondent à des moyens de défense contre les pathogènes et certains sont directement impliqués dans des réponses aux virus. Enfin certains gènes sont des éléments appartenant au système nerveux et pourraient représentés un moyen de persistance comme c est le cas chez d autres herpès-virus. Figure 3 : Regroupement des gènes identifiés par fonction à partir d une analyse par gène ontologie. L annotation de ces gènes et la comparaison de ces deux listes nous ont conduit à la sélection d une liste restreinte de gènes d intérêt potentiels. Sur les 128 gènes, certains sont malheureusement de fonction inconnue et un tri a donc été réalisé afin de choisir les gènes les plus pertinents c est à dire ceux déjà connus pour être impliqués dans des réponses à des pathogènes. La validation de ces résultats de microarray a été réalisée par qpcr sur des marqueurs potentiels associés à l infection virale. Un scénario hypothétique a pu être déterminé avec 4 étapes clés : la reconnaissance et l entrée du virus dans la cellule hôte, le cycle de vie du virus, le détournement de la machinerie cellulaire de l hôte et les effets sur la cellule hôte (figure 4). Les gènes figurant dans la liste des 128 gènes sont encore en cours d étude pour préciser leur implication dans les différentes phases de l infection virale afin d affiner le scénario de l épisode infectieux. Figure 4 : Schéma hypothétique du mécanisme d infection virale associant les premiers marqueurs géniques identifiés dans ces travaux.

8 La première phase concerne l entrée du virus dans la cellule hôte, certains gènes seraient impliqués dans cette étape. Par exemple, RAC1 est un inhibiteur de l entrée du virus dans les cellules, dans notre cas ce gène est inhibé et favoriserait l entrée du virus dans les cellules (Petermann et al. 2009). Certains gènes sont impliqués dans la régulation du cycle de vie du virus comme le gène RABAC qui permet l inhibition du cycle de vie des herpes virus (Compton et Behrend, 2006). Le gène PRDM5 et ses miarn sont impliqués dans la latence des herpès virus et constitue un point clé de la réplication virale et de l entrée du virus en phase lytique (Roizman et al. 2011et Roizman 2011). La sous-expression de ces 2 gènes suggère un changement en faveur de la phase lytique du cycle de vie du virus. Lors de l infection virale un détournement de la machinerie cellulaire de l hôte s opère, les 3 gènes nommés DRAP1, APBA2, Nup54 sont sous-exprimés chez les animaux infectés et traduisent une baisse des activités de la cellule hôte (Kahle et al ; Okamoto et Sudhof, 1997). Très récemment des travaux ont montré que Nup54 est également impliqué dans le transport des ARN viraux (Nakano et Watanabe, 2012). Au niveau des effets sur la cellule hôte, le cycle cellulaire et l apoptose semblent affectés les 3 gènes DRG2, GroupL1 and Cbx1 montrent que les proliférations et la croissance cellulaire sont réduites et que l apoptose diminue chez les naissains infectés (Ishikawa et al ; Hohfled et Jentsch, 1997 ; Melcher et al. 2000). Ce scénario doit intégrer les autres gènes identifiés, ainsi une analyse exhaustive de la liste des 128 gènes a été d ores et déjà initiée pour essayer de compléter ce schéma. Des expériences en milieu contrôlé permettront de cibler les différentes étapes et d établir la cinétique de leur expression lors de l infection virale. c- Bilan Les gènes identifiés comme marqueurs potentiels d une infection virale par l herpès virus montrent que les animaux infectés connaissent une baisse d activité dans de grandes fonctions biologiques se traduisant par un état physiologique affaibli. Chez les animaux infectés, l entrée dans les cellules et le passage du virus en phase lytique de son cycle de vie sont facilités. Cette étude constitue la première étape afin de comprendre la réponse physiologique de l huître au pathogène en milieu naturel, un article scientifique sur ce sujet et sera prochainement soumis. Jouaux Aude, Lafont Maxime, Blin Jean-Louis, Houssin Maryline, Mathieu Michel, Lelong Christophe. Physiological change under OsHV-1 contamination in Pacific oyster Crassostrea gigas through massive mortality events on fields. In prep d- Perspectives A ce stade, il est nécessaire d analyser le phénomène infectieux en pouvant suivre sa cinétique pour comprendre la mise en place de cette réponse physiologique et les étapes clés de la contamination comme les voies d entrée du virus dans l huître. Ces travaux sont aussi indispensables afin de déterminer la fin d un phénomène infectieux et le statut des animaux survivants. D autres techniques ont également été appliquées dans le cadre d une collaboration avec des chercheurs internationaux et à l acquisition récente du séquenceur NGS sur la plateforme SESAME CLC Baclesse de la SFR ICORE (voir partie suivante). Très peu de données concernent les voies d entrée du virus dans son hôte et sa localisation préférentielle dans les tissus de l hôte. La localisation du virus dans les différents tissus de l hôte sera entreprise au cours d un événement infectieux en milieu contrôlé à différents temps post inoculation. Ces travaux seront entrepris dans le cadre du stage de master 2 de M Maxime LAFONT. 2. COMPREHENSION DU PHENOMENE INFECTIEUX EN MILIEU CONTROLE Les infections expérimentales nécessitent de maintenir des animaux dans de bonnes conditions physiologiques dans une structure de type laboratoire dédié à ce type d expérimentation. Cette première étape a été réalisée dans les locaux de l Université mis à disposition pour le CRH. a- Mise en place d un système d élevage d huître creuse pour la pathologie expérimentale

9 Ces expérimentations ont fait l objet d une étude de master 1 intitulé «Mise en place d un système d élevage d huîtres creuses Crassostrea gigas pour la pathologie expérimentale». Une stagiaire de master 1 ère année (M1) Mme Mélanie Lepoittevin a été accueillie durant son stage afin de valider le fonctionnement de cette structure et d optimiser les conditions d élevage d huître en fonction des paramètres physicochimiques et trophiques. De plus, des infections expérimentales ont été conduites en parallèle afin de maîtriser cette étape de reproduction d un phénomène de surmortalité en milieu contrôlé en routine. Les résultats de cette étude ont permis de valider la structure pour le maintien des huîtres mais aussi des infections expérimentales dans de bonnes conditions physiologiques. Ces travaux sont les préliminaires nécessaires à la création d un dispositif de pathologie expérimentale dans le CRH, ainsi des collaborations entre les membres du CRH ou avec d autres chercheurs comportant des expérimentations de ce type pourront être effectuées au sein de cette structure. Ce dispositif d infrastructure d élevage est nécessaire aux travaux de pathologie mais aussi pour ceux de génomique puisqu il n existe aucune structure équivalente en région pour mener ce type d expérimentations. Ces expérimentations en milieu contrôlé sont la clé pour comprendre un épisode infectieux puisque l on maîtrise le phénomène du début à la fin. Cet outil est précieux pour essayer de décrire un phénomène infectieux et comprendre les mécanismes mis en jeu lors d une infection virale. b- Collaboration avec la chaire d excellence BioMEA Dans le cadre de la chaire d excellence financée par le CRBN et les fonds Européens FEDER, des expériences sur les mortalités ont également été initiées avec les chercheurs accueillis. Une doctorante chinoise invitée dans le cadre de cette chaire d excellence a été reçue à l université pour collaborer à ce programme et développer des techniques complémentaires à celles actuellement maîtrisées. Il s agit pour cette étude d un suivi de la cinétique d infection du virus dans son hôte via la technique du séquençage à haut débit d ARN «RNA Seq» qui consiste à séquencer tous les produits d expression des gènes à un moment donné. Des contaminations expérimentales ont été menées par injection de solution filtrée à 0.22µm contenant du virus dans des juvéniles d huîtres creuses. Le suivi de la charge virale et des mortalités a été suivi au cours de cette étude (figure 5). Figure 5 : Les taux de mortalités sont représentés par les courbes et les niveaux de charges virales par des barres. Ces résultats montrent qu il est possible d induire des mortalités en milieu contrôlé comme dans les travaux de Schikorski et al. publiés en Les mortalités observées dès les premiers jours et qui se stabilisent ensuite sont associées à de fortes charges virales OsHV-1(Figure 5).

10 Des échantillons ont été prélevés au cours de l infection (T0, 6h, 12h, J1, J3 et J5). Des banques d ARN ont été réalisées à partir des ARN transcrits présents dans les animaux prélevées. Les ARN présents dans ces échantillons ont été séquencés. Ces banques ont ensuite été étudiées sur le séquenceur GAIIx Illumina de la plateforme SESAME. Les clusters obtenus représentent les gènes les plus exprimés. Cette étude permet de suivre la réponse de l huître au virus au cours d un épisode infectieux. Les données ont conduit à l identification de gènes candidats, dont la validation par qpcr est en cours. Certains de ces gènes sont également retrouvés dans la liste des 128 gènes présentés en première partie et permettent de renforcer le scénario proposé mais aussi de le compléter. Ces travaux sont toujours en cours d étude et permettront de mieux comprendre le mode d infection du virus en milieu contrôlé. Cette étude fera l objet d une publication scientifique en collaboration avec les chercheurs de l Université Rutgers et de l institut océanographique de Qingdao. 3. Perspectives et projets 2013 Les perspectives du projet GIGAVIR sont de poursuivre les expérimentations décrites ici et en particulier en milieu contrôlé afin d avoir accès à l épisode infectieux dans sa globalité. a- Recherche et validation de marqueurs génétiques associés à l infection Lors de ces expériences, un certain nombre de gènes marqueurs associés à l infection ont été identifiés. Il convient de valider parmi ces gènes ceux qui présentent un réel intérêt. Dans ce but, des infections contrôlées vont être entreprises au sein du CRH sur des larves ou du naissain pour permettre la validation de ces marqueurs et identifier les réseaux de gènes impliqués dans la cinétique de réponse au virus. Ainsi, un stagiaire de master 2 sera accueilli pour assurer les infections in vitro, tester des gènes candidats et éventuellement d en identifier d autres. Les listes de gènes initialement obtenues soit par microarray soit par RNAseq (collaboration avec l Université Rutgers) vont également faire l objet d une étude bibliographique plus approfondie pour mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans la reconnaissance du virus, son cycle de vie ou son action dans la cellule hôte. Un partenariat avec le LFD est également prévu et consiste en un transfert de technologie portant sur les microarrays et en particulier sur la réponse de l huître aux différents variants (thèse de Claire Martenot). Dans ce cadre, une puce à ADN contenant à la fois le génome de l huître et celui du virus va être développée au laboratoire afin d étudier le dialogue entre l hôte et son pathogène au cours d une infection virale en milieu contrôlé mais aussi sur estran. b- Régulation de l interaction fine hôte pathogène (mirna) Des résultats récents ont montré qu un grand nombre de régulations impliquent de petites molécules d acides nucléiques baptisées miarn. Ces molécules interfèrent avec l ADN et modulent l expression de gènes d intérêt. En 2013, un projet de séquençage des miarn chez l huître sera piloté par Christophe Lelong sur le séquenceur nouvelle génération de la SFR ICORE. Un projet de séquençage de miarn mené en parallèle entre animaux sains et infectés va être entrepris afin d essayer d identifier des miarn spécifiques de l interaction hôte-pathogène comme il en existe chez d autres modèles. En effet, certaines de ces molécules sont impliquées dans les changements dans le cycle de vie de virus pour le maintien en phase de latence. Bibliographie Burge, C. A., Friedman, C. S., Quantifying ostreid herpesvirus (OsHV-1) genome copies and expression during transmission. Microbial ecology, 1-9. Compton, S.L., Behrend, E.N PRAF1: a Golgi complex transmembrane protein that interacts with viruses. Biochemistry Cell Biology, 84: Dheilly, N. M., Lelong, L., Huvet, A., Favrel, P., Development of a Pacific oyster (Crassostrea gigas) feature microarray: Identification of reference genes and tissue-enriched expression patterns. BMC Genomics 12, Dheilly, N. M., Lelong, L., Huvet, A., Kellner, K., Dubos, M.P., Rivière, G., Boudry, P., Favrel, P., Gametogenesis in the Pacific Oyster Crassostrea gigas : A microarrays-based analysis identifies sex and stage specific genes. Plos ONE 7 (5) 1-15 BMC Genomics 12, 468. Hohfled, J., Jentsch, S GrpE-like regulation of the Hsc70 chaperone by the anti-apoptotic protein BAG-1. EMBO Journal, 16: Ishikawa, K., Azuma, S., Ikawa, S., Semba, K., Inoue, J.I Identification of DRG family regulatory proteins (DFRPs): specific regulation of DRG1 and DRG2. Genes to Cells, 10:

11 Kahle, J., Piaia, E., Neimanis, S., Meisterernst, M., Doenecke, D Regulation of nuclear import and export of negative cofactor 2. Journal of Biology Chemistry, 284(14): Melcher, M., Schmid, M., Aagaard, L., Selenko, P., Laible, G., Jenuwein, T Structure-function analysis of SUV39H1 reveals a dominant role in heterochromatin organization, chromosome segregation, and mitotic progression. Mol Cell Biol 20(10): Nakano, K, Watanabe, T., HTLV-1 Rex: the courier of viral messages making use of the host vehicle. Frontiers in microbiology 3:3-13. Okamoto, M., Sudhof, T.C Mints, Munc18-interactiong protein in synaptic vesicle exocytosis. The Journal of Biological Chemistry, 272: Petermann, P.,Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D Impact of Rac1 and Cdc42 Signaling during Early Herpes Simplex Virus Type 1 Infection of Keratinocytes. Journal of Virology Roizman, B., Zhou, G., Du, T Checkpoints in productive and latent infections with herpes simplex virus 1: conceptualization of the issues. Journal of Neurovirology, 17: Roizman, B The checkpoints of viral gene expression in productive and latent infection: the role of the HADC/CoREST- LSD1/REST repressor complex. Journal of Virology, 85(5): Schikorski, D., Faury, N., Pepin, J.F., Saulnier, D., Tourbiez, D., Renault, T. 2011a. Experimental ostreid herpesvirus 1 infection of the Pacific oyster Crassostrea gigas: Kinetics of virus DNA detection by q-pcr in seawater and in oyster samples. Virus Research, 155: Schikorski, D., Renault, T., Saulnier, D., Faury, N., Moreau, P., Pépin, J.F. 2011b. Experimental infection of Pacific oyster Crassostrea gigas spat by ostreid herpesvirus 1: demonstration of oyster spat susceptibility. Veterinary Research, 42:27.

12 Zhang, G., Fang, X., Guo, X. et al The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shell formation. Nature 490:

13 Programme ASIL J. Normand 1, A. Jouaux 2, J.L. Blin 3, M. Treille 4, B. Petton 5, C. Lazard 1, S. Parrad 1, C. Mary 1, B. Simon 1, T. Gauquelin 3, V. Lefebvre 3, S. Pétinay 3, N. Laisney 3, N. Daguier 4, D. Esperet 4 1 Ifremer LERN, Station de Port-en-Bessin, Avenue Général de Gaulle, Port-en-Bessin 2 FRE BIOMEA, IFR146 ICORE FRE 3484 BioMEA CNRS INEE, Université de Caen Basse Normandie, Esplanade de la paix Caen Cedex 3 Synergie Mer et Littoral, Centre Expérimental de Blainville, Zone conchylicole, Blainville-sur-Mer 4 Laboratoire Départemental d Analyses de la Manche, 1352 av. de Paris, St Lô Cedex 5 Laboratoire de Physiologie des Invertébrés UMR 6539 Ifremer LEMAR, Station expérimentale d Argenton, Landunvez.

14 Programme ASIL J. Normand 1, A. Jouaux 2, J.L. Blin 3, M. Treille 4, B. Petton 5, C. Lazard 1, S. Parrad 1, C. Mary 1, B. Simon 1, T. Gauquelin 3, V. Lefebvre 3, S. Pétinay 3, N. Laisney 3, N. Daguier 4, D. Esperet 4 1 Ifremer LERN, Station de Port-en-Bessin, Avenue Général de Gaulle, Port-en-Bessin 2 FRE BIOMEA, IFR146 ICORE FRE 3484 BioMEA CNRS INEE, Université de Caen Basse Normandie, Esplanade de la paix Caen Cedex 3 Synergie Mer et Littoral, Centre Expérimental de Blainville, Zone conchylicole, Blainville-sur-Mer 4 Laboratoire Départemental d Analyses de la Manche, 1352 av. de Paris, St Lô Cedex 5 Laboratoire de Physiologie des Invertébrés UMR 6539 Ifremer LEMAR, Station expérimentale d Argenton, Landunvez. Cadre général L implication prioritaire d un ou de plusieurs agents pathogènes dans le déclenchement des surmortalités de naissains d huître creuse est rendue évidente par le caractère contagieux du phénomène et fait donc aujourd hui l objet d un large consensus. Trivialement, un tel postulat implique également que des individus naïfs isolés des pathogènes impliqués n ont aucune chance de déclarer la maladie. Une mesure de gestion zootechnique de l épizootie reposant sur l isolement des lots a donc été proposée très tôt. Elle consisterait à élever des lots de naissains, identifiés comme «naïfs» vis-à-vis des agents infectieux incriminés dans les surmortalités, sur de nouvelles zones d élevages isolées et encore indemnes de pathogènes. Une telle mesure semble particulièrement adaptée au contexte de la Basse-Normandie, où la profession a fait preuve d un grand volontarisme dans la mise en place de mesures de gestions des transferts dès 2010 et où la rareté des stocks sauvages permet de s affranchir d une origine potentielle de contamination (difficilement évitable dans les autres secteurs ostréicoles français). La mise en application de cette mesure dans le contexte d élevage actuel impose toutefois plusieurs contraintes. 1 ) Les outils de diagnostic disponibles doivent permettre d identifier avec certitude les lots porteurs d une infection virale latente afin d éviter de contaminer ces zones sanctuaires avec des individus «porteurs» non-détectés. 2 ) Il paraît difficilement envisageable de délocaliser la totalité des cheptels actuellement en élevage sur de telles zones sanctuaires pour des raisons évidentes d occupation de l espace. Une solution commode consisterait à ce que ces zones soient plutôt destinées à une sauvegarde temporaire des lots avant réintroduction sur les secteurs ostréicoles habituellement exploités. Un tel schéma zootechnique ne s avèrerait alors efficace qu à condition que les cheptels aient vu leur résistance améliorée pendant la période d isolement mais surtout lors de leur réintroduction en contexte infectieux (cf rapport CRH 2011). 3 ) Enfin, il est probable que certaines périodes de l année soient plus propices à la réintroduction, dans la mesure où la maladie suit une dynamique saisonnière. La mise en évidence des périodes pendant lesquelles le risque de contagion des lots naïfs est le plus fort pourrait ainsi permettre d améliorer l efficacité des mesures d isolement temporaire des lots, ou celle des mesures de restriction d immersion. Ce projet de recherche s articule donc en 3 parties, visant chacune à répondre à une question posée pour l optimisation de mesures de gestion des surmortalités de naissain par le diagnostic du statut des lots (porteurs ou non-porteurs d une infection latente) et l isolement (Figure 1). Pris ensemble, les résultats devraient permettre d appréhender l efficacité d un tel protocole alliant certification et isolement pour son application en production.

15 Figure 1 : Représentation schématique d un protocole d élevage alliant certification et isolement pour la gestion des surmortalités, mise en perspective avec les questions traitées dans le projet ASIL. Phase 1 : Peut-on évaluer l efficacité des méthodes de diagnostic du statut sanitaire des lots (lors de leur réception)? Introduction Une mesure de gestion de l épidémie pourrait consister à trier les lots mis en élevage en fonction de leur statut sanitaire vis-à-vis des pathogènes impliqués dans les surmortalités, afin d éviter autant que possible l entrée de ces agents infectieux sur les secteurs ostréicoles. Un tel scénario de gestion nécessiterait alors la mise en œuvre de tests diagnostiques sûrs pour qualifier le statut sanitaire des lots à leur entrée sur les zones d élevage, pendant la période hivernale. Plus généralement, l identification des parcours d élevage conduisant à l infection de certains lots constitue évidemment un élément majeur pour la compréhension des dynamiques infectieuses. Les travaux entrepris depuis 2008 sur le sujet ont permis le développement de 2 types de méthodes de diagnostic. Le premier type de méthodes permet d estimer le degré d infection par l OsHV-1 des individus testés, grâce à des méthodes moléculaires ciblant le génome viral (Pépin et al., 2008). Les développements récents de ces outils ont abouti à la mise au point d une technique de PCR quantitative basée sur la chimie Taqman et dont les seuils de détection ont pu être abaissés par rapport à la méthode précédente (Martenot et al., 2010). Le second type de méthodes de diagnostic est basé sur une technique de conditionnement zootechnique qui permet l induction de la virulence des pathogènes impliqués chez les lots porteurs, en l absence de tout phénomène de contagion. Ce protocole, développé par l équipe du Laboratoire de Physiologie des Invertébrés UMR 6539 Ifremer LEMAR (Petton et Pernet, in prep) consiste à placer les individus pendant 1 mois dans des conditions d élevage simulant les conditions environnementales propices au développement de la pathologie (température élevée et nourriture ad libitum). Cet outil diagnostique a été adapté et mis en œuvre au centre d expérimentation du SMEL après avoir été calibré en 2011, en collaboration avec l équipe de la station expérimentale Ifremer d Argenton. Ainsi, disposant désormais en Normandie d outils moléculaires de plus grande sensibilité et de l outil de conditionnement zootechnique, il était envisageable d en comparer les résultats afin de tester leur efficacité pour évaluer le statut sanitaire de lots de naissain d huîtres. La présente étude visait donc à utiliser de façon concomitante ces différentes méthodes de diagnostic sur un nombre aussi élevé que possible de lots de naissain de diverses origines pour en comparer les résultats. Les expérimentations devaient également permettre de tester l effet de différents parcours zootechniques sur le statut sanitaire des lots.

16 Méthode Figure 2 : Schéma du protocole expérimental La méthodologie adoptée a consisté dans un premier temps à renseigner différents indicateurs du parcours zootechniques pour 11 lots de naissain (Figure 2). La prévalence initiale en individus porteurs du virus OsHV-1 dans le lot a ensuite été estimée par une première PCR quantitative réalisée sur 96 individus afin d avoir une idée précise de la prévalence (proportion d individus porteurs dans la population expérimentale) et de la charge virale des individus porteurs (nb. de copies de génome viral par unité de tissus d huître). Pour chacun des lots, 3 souséchantillons de 200 individus ont ensuite été isolés, et soumis au conditionnement zootechnique décrit ci-dessus. 3 semaines après le début du conditionnement, 3 pools de 5 individus survivants ont été constitués pour chacun des bacs, et une recherche d ADN viral a été effectuée en utilisant la même méthode de PCR quantitative. La proportion d échantillons dans lesquels la présence de l OsHV-1 a été avérée a permis d estimer une probabilité de détection de l OsHV-1 à l issue du conditionnement. Enfin, la probabilité de mortalité dans les bacs a été estimée par dénombrement des individus vivants et morts à l issue de cette phase de testage. L analyse des résultats a d abord consisté à comparer les résultats des différentes méthodes 2 à 2. La seconde étape de l analyse a consisté à tester l effet des différents paramètres zootechniques sur le statut sanitaire du lot caractérisé par les 3 méthodes de diagnostic.

17 Résultats Indicateurs du parcours zootechnique des lots Lot Origine Ploïdie Passé sur l'estran Passé sur l'estran pendant la période des mortalités Masse moyenne initiale (g) 1 captage 2n oui oui 0,362 2 écloserie 3n oui oui 0,699 3 écloserie 3n non non 0,639 4 captage 2n oui oui 0,192 5 écloserie 2n non non 0,172 6 écloserie 2n oui oui 0,213 7 écloserie 3n oui non 0,504 8 captage 2n oui oui 0,098 9 écloserie 2n oui non 0, captage 2n oui oui 0, captage 2n oui oui 0,306 Tableau 1 : Données de caractérisation du parcours zootechnique précoce des lots Parmi les 11 lots testés dans le cadre de cette étude, 6 étaient issus de production d écloserie, et 5 étaient des lots de captage naturel (Tableau 1). Parmi ceux-ci, le lot 10 a été mutualisé dans le cadre de différentes actions du CRH parmi lesquelles l Observatoire d agents infectieux de l huître sur les cheptels ostréicoles bas-normands (Savary M., dans ce rapport). Sur les 6 lots d écloserie, 3 d entre eux étaient constitués d individus triploïdes et 3 lots étaient diploïdes (Tableau 1). Par ailleurs, 4 lots (2 lots 2n et 2 lots 3n) parmi ces 6 lots n avaient pas été élevés sur l estran pendant la période de mortalité. Parmi ces 4 lots, 2 lots (1 lot 2n et 1 lot 3n) n avaient jamais été en contact avec l estran, puisqu ils avaient été obtenus directement à leur sortie des installations d élevage à terre. Comparaison des résultats des différents indicateurs du statut sanitaire des lots Relation entre prévalence initiale et probabilité de mortalité dans les bacs de testage D un côté, certains lots présentant une forte prévalence initiale ont effectivement montré des taux de mortalité importants (comme les lots 1, 4 et 6) (Figure 3). Parallèlement, aucune mortalité significative n a été déclenchée lors du conditionnement chez les 3 lots détectés comme complètement indemnes d individus porteurs du virus (lots 3, 5 et 9). La probabilité de mortalité dans les bacs de testage apparaît toutefois relativement indépendante de la proportion d individus détectés comme porteur de l OsHV-1 lors de la réception des lots (Pr > 0,05) (Figure 3). Ainsi, le lot 11, qui présentait à sa réception une forte proportion d individus porteurs du virus (quoiqu à des charges virales très faibles), a montré dans le même temps des mortalités très faibles dans les bacs de conditionnement. Le lot 8 présentait également une prévalence initiale très faible mais avec une forte charge virale, et a montré des mortalités très importantes lors de la phase de conditionnement zootechnique.

18 Relation entre taux de mortalité dans les bacs de conditionnement et probabilité de détection de l OsHV-1 à l issue du conditionnement La relation entre l intensité des mortalités dans les bacs et la probabilité de détection de l OsHV-1 à l issue du conditionnement apparaît significative (Pr < 0,01) (Figure 3). La relation apparaît clairement positive, avec une probabilité de détection du virus nettement accrue dans les bacs où la mortalité s est exprimée le plus fortement. Le bac 1 du lot 10 vient apporter une parfaite illustration de cette relation, avec de très fortes mortalités (> 80%) associées à la détection de l OsHV-1 dans les 3 échantillons constitués (Figure 3). La relation est également appuyée par l absence de détection du virus herpès de l huître dans les échantillons issus des bacs présentant de faibles mortalités (lot 3 bacs 2 et 3 ; lot 7 bac 1 ; lot 9 bacs 1, 2 et 3 et lot 11 bacs 1, 2, et 3) (Figure 3). Il faut toutefois noter que cette relation admet un nombre non négligeable d exceptions. Certains bacs présentent en effet de très faibles mortalités associées à une forte probabilité de détection de l OsHV-1 (lot 3 bac 1 ; lot 4 bac 2 ; lot 5 bac 1) (Figure 3). Dans ce cas toutefois, il faut remarquer que les charges virales mesurées restent relativement faibles, de l ordre de quelques centaines à quelques milliers de copies de génome viral pour 50 mg de tissus. Ceci suggère que les indicateurs de l infection virale à l issue du conditionnement devraient intégrer à la fois la prévalence, mais également la charge virale individuelle pour décrire au mieux la dynamique infectieuse. Le faible effort d échantillonnage à l issue du conditionnement, couplé à une très forte variabilité des charges virales entre échantillons, n a toutefois pas permis de mettre en œuvre cette approche ici. A contrario, certains bacs montrent dans le même temps de fortes mortalités associées à de faibles probabilités de détection du virus à l issue du conditionnement (lot 8 bac 1) (Figure 3). Plusieurs hypothèses peuvent être formulées pour expliquer un tel phénomène, parmi lesquelles : - un effet de la dynamique d infection virale propre au lot considéré, traduisant un effet d abattement de la charge virale chez les individus en cours de guérison et l élimination des individus les plus porteurs par mortalité différentielle ; - l implication d un ou plusieurs pathogènes non-identifiés dans le déclenchement de l épisode infectieux dans les bacs de testage.

19 Figure 3 : Prévalence initiale estimée (A), taux de mortalité dans les bacs de testage (B) et nombre d échantillons (sur 3) dans lesquels l OsHV-1 a été détecté à l issue du conditionnement zootechnique (C). Relation entre prévalence initiale et probabilité de détection de l OsHV-1 à l issue du conditionnement La relation entre la prévalence initiale estimée à la réception des lots et la probabilité de détection du virus à l issue du conditionnement est clairement non-significative (Pr > 0,05) (Figure 3). Ainsi, de fortes valeurs de prévalence mesurées lors de la réception du lot ne débouchent pas forcément sur une forte probabilité de détection de l OsHV-1 dans les échantillons constitués à l issue du conditionnement zootechnique. On constate ainsi une absence totale de détection dans certains bacs, pourtant issus de lots qui présentaient initialement une forte proportion d individus infectés par le virus (lot 4 bac 1 et lot 11 bacs 1, 2 et 3) (Figure 3). A l inverse, des lots apparemment indemnes du virus lors de leur réception ont montré une forte probabilité de détection de l OsHV-1 dans plusieurs bacs à l issue du conditionnement (lot 3 bac 1 ; lot 5 bacs 1, 2 et 3) (Figure 3). Là encore, les charges virales individuelles mesurées dans ce cas à l issue du conditionnement restent relativement faibles, de l ordre de quelques centaines à quelques milliers de copies de génome viral pour 50 mg de tissus. L augmentation modérée de la charge virale dans

20 ces lots à l issue du conditionnement traduit probablement une infection en cours, quoique relativement peu active. Effet des différents paramètres zootechniques sur le statut sanitaire du lot caractérisé par les 3 méthodes de diagnostic Var = Prévalence Mortalité dans Proba. de détection de l OsHV-1 à l issue du initiale les bacs conditionnement zootechnique Pr > Khi² Pr > Khi² Pr > Khi² Origine < ,0091 0,8771 Ploïdie < ,0108 0,8265 Estran < ,0099 0,7405 Estran_été <.0001 < ,0409 Tableau 2 : Valeurs de probabilité associées aux test de Khi2, pour les modèles logit(π) = µ + a*[variable x] ; avec π = π prévalence_initiale, puis π = π mortalité ou π = π probabilité de détection de l OsHV-1 à l issue du conditionnement zootechnique et Variable x = Origine ; Ploïdie ; Estran ; Estran été. Les paramètres zootechniques montrent tous un lien fort avec la probabilité de détection du virus dans le lot lors de sa réception, et la probabilité de mortalité dans les bacs de testage (Pr toutes inférieures à 0,05) (Tableau 2), quoique leur fort degré d imbrication implique que certains estimateurs des rapports de risque sont confondus, ou redondants les uns par rapport aux autres. Les analyses univariées montrent que le risque de révéler une infection lors de la mesure de la prévalence initiale, ou lors du conditionnement zootechnique est accru : - chez le naissain issu de captage comparé au naissain produit en écloserie d écloserie, - chez les lots diploïdes plutôt que triploïdes, - chez les lots élevés sur l estran comparativement aux lots isolés dans des installations à terre, - chez les lots élevés sur l estran pendant la période de mortalité, comparativement aux lots isolés dans des installations à terre à cette période. Si l on considère la probabilité de détection de l OsHV-1 estimée à l issue du conditionnement zootechnique, le seul effet détecté comme significatif est celui de l élevage sur l estran pendant la période de mortalité (Pr < 0,05) (Tableau 2), qui coïncide avec une occurrence nettement accrue des individus infectés par le virus.

21 Figure 4 : Effet des paramètres du parcours zootechnique sur la prévalence initiale estimée (A), les taux de mortalité dans les bacs de testage (B) et le nombre d échantillons (sur 3) dans lesquels l OsHV-1 a été détecté à l issue du conditionnement zootechnique (C). Discussion La principale différence entre notre expérimentation, et les travaux menés antérieurement sur le sujet, tenait dans la mise en œuvre d un effort d échantillonnage accru et l emploi d une technique d analyse par qpcr décrite comme particulièrement sensible (Martenot et al, 2010) pour l estimation de la contamination des lots lors de leur réception. En dépit de ces légères différences de protocole, les résultats présentés ici sont tous très concordants avec les résultats des travaux menés en 2010 par l équipe du Laboratoire de Physiologie des Invertébrés UMR 6539 Ifremer LEMAR (Petton et Pernet, in prep). La comparaison des résultats de prévalence initiale et de probabilité de mortalité dans les bacs de testage suggère que l absence de détection du virus lors de la réception du lot pourrait constituer, dans nos conditions expérimentales, une garantie que le lot échappe aux mortalités au cours du conditionnement zootechnique. A l inverse, de fortes valeurs de prévalence d individus infectés par l OsHV-1 lors de la réception du lot ne semblent pas déboucher de façon systématique

22 sur l induction de mortalités significatives lors de la phase de conditionnement si les charges mesurées au départ sont faibles. L expression des mortalités dans les bacs coïncide également avec une augmentation de la probabilité de détection du virus chez les individus survivants, sans que cette association soit systématique. La comparaison des résultats de prévalence initiale dans les lots, et de détection de l OsHV- 1 dans les bacs à l issue du conditionnement zootechnique laisse à penser que : 1 ) l absence de détection du virus lors de la réception du lot ne constitue pas une garantie que le lot soit effectivement indemne d individus porteurs de l OsHV-1, et ce en dépit d un fort effort d échantillonnage (96 individus, traités séparément) consacré à l estimation de la prévalence initiale. Les lots 3 et 5 présentaient ainsi une prévalence apparemment nulle lors de leur réception, mais ont révélé une infection latente au cours du conditionnement zootechnique sans déclarer pour autant de mortalité. 2 ) le conditionnement zootechnique ne garantie pas la révélation d une infection virale latente détectée lors de la réception du lot, puisque le lot 11 qui présentait une forte prévalence lors de sa réception n a pas exprimé les symptômes de l infection par le virus par la suite. L effet des paramètres zootechniques sur la variation des indicateurs du statut sanitaire des lots est globalement concordant, quelle que soit la méthode de diagnostic utilisée. Les rapports de risque indiquent clairement que les facteurs discriminant le plus fortement les lots pour les différents indicateurs sont les paramètres zootechniques «Estran» et «Estran_été», le second étant imbriqué dans le premier. Ces paramètres sont tous 2 imbriqués dans le paramètre «Origine», dans la mesure où les lots issus de captage naturel ont nécessairement été en contact avec l estran à une période où les mortalités se produisent. Par ailleurs, 2 des 3 lots triploïdes testés au cours de notre étude ont été préservés dans des installations d élevage à terre pendant la période des mortalités. Il est alors naturel que la réduction du risque conférée par l isolement à terre pendant la période estivale se confonde ici en partie avec l effet du paramètre «Ploïdie». Une analyse parcimonieuse des résultats aboutie finalement à la conclusion que le passage des lots sur l estran, et ce particulièrement pendant la période de mortalité, constitue le facteur de risque d infection le plus probable. Ce parcours zootechnique (suivi par 7 lots sur les 11 considérés) se traduit dans notre étude par une augmentation très forte de la prévalence initiale, de la mortalité dans les bacs, et de la probabilité de détection du virus dans les échantillons à l issue du conditionnement zootechnique. Une telle conclusion devrait d ailleurs apparaître triviale dans la mesure où des lots indemnes de pathogènes et isolés des foyers de contagion dans des installations d élevage à terre ne présentent pas les symptômes associés à la maladie, comme cela a été mis en évidence au cours de travaux antérieurs (Bilan CRH, 2011), ou plus récents (Le Guillois M., dans ce rapport). Nous pensons que ces résultats encouragent aujourd hui à travailler sur l effet des paramètres zootechniques précoces (avant la mise en élevage des lots) qui pourraient expliquer une part de la variabilité des taux de survie inter-lots, constatée sur le terrain. Le projet EVILS (Etude de la Variabilité Inter-Lots pour la Survie), porté par le LERN et mené dans le cadre du CRH en 2013 focalise sur la question des facteurs impliqués dans cette variance, et devrait apporter les premiers éléments de réponse à ces questions.

23 Bilan de la phase 1: Nos résultats suggèrent que 1) l estimation de la prévalence lors de la réception des lots par qpcr, 2) l estimation de la probabilité de survie à l issue du conditionnement zootechnique et 3) l estimation de la probabilité de détection de l OsHV-1 par qpcr à l issue du conditionnement constituent des méthodes permettant chacune d approcher la qualification du statut sanitaire des cheptels. La phase 1 du projet ASIL montre également une relative divergence des résultats entre ces méthodes. Il apparaît notamment que le conditionnement zootechnique permet la révélation d infections virales latentes, non-détectées initialement. La mise en œuvre du conditionnement zootechnique et de la détection par qpcr au sein d une même procédure de diagnostic constitue probablement le protocole le plus efficace pour détecter une éventuelle contamination du lot par le virus herpès de l huître. Appliqué au scénario d élevage basé sur le diagnostic et l isolement tel qu il est proposé dans les projet Portbail 2 porté par le LFD (Houssin M., dans ce rapport), un tel protocole devrait permettre de diminuer sensiblement la quantité d individus porteurs d une infection virale latente introduits sur les zones d élevage. L utilisation de lots n ayant jamais été mis en contact avec l estran pendant la période de mortalité estivale devrait également réduire de façon très significative la probabilité d apparition de la maladie s ils sont déployés dans les zones indemnes de mortalité. Les résultats montrent toutefois que, même dans ce cas, les probabilités d infection par l OsHV-1 ne sont pas nulles. Des individus infectés par le virus sont d ailleurs observés à l issue du conditionnement zootechnique y compris dans les lots 3 et 5, qui n ont pourtant jamais été en contact avec le milieu naturel. Le fait qu aucune de ces méthodes ne permette de garantir le statut sanitaire des lots reste d une importance capitale pour l application, en situation de production, du scénario envisagé. Du fait du caractère hautement contagieux de la maladie, on peut craindre que l introduction accidentelle d un petit nombre d individus porteurs de l infection puisse suffire à contaminer toute une zone, ou une installation d élevage à terre. Seules des expérimentations à plus grande échelle, comme celles qui sont entreprises dans les projets Portbail 1 et 2 (Houssin M., dans ce rapport), permettront d évaluer la faisabilité de l application d une telle procédure dans les entreprises ostréicoles, et d estimer les bénéfices potentiels obtenus alors.