Etude expérimentale de la phosphatase alcaline Enzymologie 2

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1 Etude expérimentale de la phosphatase alcaline Enzymologie 2 Cabaret Laurine Martin Laetitia Groupe C2 01/10/2010

2 I. Introduction Le but de cette manipulation est de déterminer les paramètres cinétiques d une enzym d étudier l influence de la concentration en substrat et de la présence d un inhibiteur su vitesse de réaction. Dans ce TP, nous allons utiliser une préparation commerciale de phosphatase alcaline d veau. Il s agit d une enzyme alcaline à 2 substrats, capable d hydrolyser les monoesters phosphoriques selon la réaction suivante : R-O-PO H2O R-OH + HPO4 2- II. Principe Afin de suivre la réaction enzymatique, nous allons réaliser un dosage spectrophotomét des produits apparus dans le milieu, lorsque l enzyme est en présence de son substrat. faciliter le dosage, nous allons utiliser comme substrat le P-nitrophénolphosphate (PNPP qui, après action de l enzyme, libère un produit coloré (jaune) : le P-nitrophénol (PNP) directement dosable à 410nm. + 2O H 4 2- HPO+ PNPP incolore Le principe du dosage spectrophotométrique est de mesurer l absorbance d une subst colorée, au cours du temps. Le spectrophotomètre est relié à un dispositif d enregistrem (ordinateur), qui nous permet de visualiser l évolution de l absorbance dans un interval temps (3min), et donc de déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique grâc pente de la droite obtenue, dans les temps initiaux (ΔDO/min). De plus, pour connaître la quantité de produit apparu dans le milieu, on réalise une gam étalon de tubes contenant différente concentration (connues) de produit. On trace la dr

3 DO = f ([PNP]). En reportant l absorbance d une solution de concentration inconnue, on peut en déduire sa concentration. III. Manipulations préliminaires Afin de réaliser la gamme étalon et les milieux d incubation, nous devons préalablemen préparer les solutions de substrats de concentrations différentes. 1) Solution de PNPP : Nous voulons préparer 6 tubes de solution de PNPP à 2,5 mm, 1mM, 0,5mM, 0,25mM, 0,167mM, 0,125mM, à partir d une solution mère de 5mM. Pour cela, nous effectuons u dilution en cascade. 10mL 8mL 10mL 10mL 13,4mL 5mL 5mM 2,5 mm 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM

4 [PNPP] 5mM 2,5mM 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM 0,125mM (umol /L) Solution ,4 5 mère (ml) H20 (ml) ,6 15 Calcul pour la première dilution : C1 V1 = C2 V2 V1 = 20mL Donc V1 = (C2 V2 )/ C1 V= (0,0025 * 0,02) / 0,005 = 10 ml Il faut donc prélever 10mL de la solution mère, et ajouter 10mL d eau pour la diluer 2 fo 2) Solution de glycérophosphate : Comme précédemment, nous voulons préparer 2 tubes de solution de glycérophosphat 2,5mM et 1mM, à partir d une solution mère à 5mM. 7mL 4mL 5mM 2,5 mm 1mM [GRO-P] 5mM 2,5mM 1mM Solution mère (ml) H20 (ml) 0 7 6

5 Calcul pour la première dilution : C 1 V1 = C2V2 Vf1 = 10mL Donc V1 = ( C2 V2)/ C1 V= (0,0025 * 0,0014) / 0,005 = 7 ml Il faut donc prélever 7mL de la solution mère et ajouter 7mL d eau pour la diluer 2 fois. IV. Etude cinétique de la libération du produit 1) Gamme étalon n 1 : Nous préparons la gamme étalon puis nous mesurons la DO dans chaque tube à 410 nm longueur d onde à laquelle le produit (PNP) absorbe. Nous traçons, ensuite, la droite éta DO corrigée = f (quantité de PNP) CF tableau 1 et figure 1a Calcul de la quantité de produit dans les tubes : n = CV Tube 1: n= 0 µmole Tube 2: n= (0, , )= 0,0125 µmole (C= 6, 25 µmole/ L) Tube 3: n= (0, , )= 0,025µmole (C=12,5 µmole/ L) Tube 4: n= (0, , ) =0,05 µmole (C=25 µmole/ L) Tube 5: n = (0, , ) = 0,075µmole (C=37,5 µmole/ L) Tube 6: n = (0, , ) = 0,1µmole (C=50 µmole/ L) 2) Milieux d incubation : Cf tableau 2 Calcul de [PNPP] dans chaque tube (A à G) : On effectue deux dilutions successives du PNPP: On en ajoute 0,5 ml dans 3,5 ml de m réactionnel, puis on prélève 1,75 ml de ce milieu dans lequel on rajoute 0,25mL d enzy

6 Première dilution (milieu A) : [PNPP] = (C PNPṖVPNPP) / Vtotal [PNPP] = (0,125.0,5) / 3,5 = 17,85 µm Deuxième dilution (cuve A): [PNPP] = (C PNPṖVPNPP) / Vtotal [PNPP] = (17, ,75)/2 = 15,6 µm On procède de la même manière pour les autres milieux et on obtient: [PNPP]B = 20,90 µm [PNPP]C = 31,25 µm [PNPP]D = 62,5 µm [PNPP]E = 124,95 µm [PNPP]F = 324,71 µm [PNPP]G= 625,0 µm Calcul de la concentration de l enzyme dans les milieux réactionnels: CenzVenz= CtubeVtube Ctube = (0,1. 0,25)/ 2 = 0,0125 mg/ml = 12,5 µg/ml Maintenant, nous mesurons les variations de la DO dans chaque milieu d incubation, au cours du temps (3minutes), à l aide d un spectrophotomètre et d un système d enregistrement. Nous obtenons différentes droites ΔDO = f (t). La pente de chaque d ΔDO/min, représente la vitesse de la réaction, aux temps initiaux, pour une concentrati substrat donnée. Cf tableau 2 figure 2 Commentaire : D après les courbes obtenues, on peut voir que la DO augmente au cours du temps, et façon linéaire pendant environ 1min. Ce qui signifie que la quantité de produit dans le milieu augmente.

7 De plus, on remarque que plus la concentration en substrat est grande (croissante de A plus la pente de la courbe, dans les temps initiaux, est importante. Ainsi, la vitesse d apparition du produit dans le milieu, augmente avec la concentration en substrat. Ensuite, pour un temps > 1minute, Il n y a plus de relation linéaire (pour les milieux A, D, E). En effet, la quantité de substrat dans le milieu, diminue au fur et à mesure de la réaction. Ainsi, il y a de moins en moins de produit formé donc l absorbance n augmen plus de façon linéaire. Pour F et G, on remarque que pour un temps > 1min, la courbe reste linéaire. Effectivem la quantité de substrat est encore suffisante pour que la réaction s effectue à une vitess initiale, maximale. Nous voulons déterminer [PNP]/min, c'est-à-dire la vitesse d apparition du produit à pa de la pente ΔDO/min. Pour cela, on reporte la valeur de la pente de chaque courbe sur gamme étalon n 1, et on regarde à quelle quantité de produit cela correspond. On obtient : ΔDO/min 0,0126 0,108 0,2646 0,3762 0,3792 0,4128 0,4295 [PNP]/min 0,62 5,62 17,2 23,12 23,74 25,0 26,25 µmole/l/min V. Influence de la concentration en substrat su la vitesse de la réaction 1) Etude graphique de la vitesse de réaction en fonction de [PNPP] : Grâce aux vitesses initiales déterminées précédemment, on trace la courbe de Mickaeli Menten : Vi = f([pnpp]). Représentation graphique :

8 On obtient alors des valeurs approximatives de Vmax et Km : Vmax = 0,411 ΔDO/min Si on reporte cette valeur sur la gamme étalon n 1, on trouve Vmax = 24,9 µmole/min Km = 23,4 µmole/l Ces valeurs ne sont que des estimations, la représentation de Mickaelis-Menten étant u courbe, il y a une importante marge d erreur lors de la détermination de Vmax. De plus, le Km est lié à la valeur de Vmax, donc la marge d erreur se rapporte égaleme valeur du Km. Ainsi, il est nécessaire de linéariser cette représentation, afin de diminuer ces incertitud et obtenir des valeurs beaucoup plus précises. Nous allons donc utiliser les représentat de Lineweaver-Burke, et Hanes-Woolf. 2) Détermination de la vitesse maximale et de la constante de Mickae La cinétique de la réaction suit l équation de Mickaelis- Menten : la vitesse initiale pour certaine concentration en substrat (PNPP) est de la forme : Vi = Et d après cette équation, on peut en déduire la représentation de Lineweaver Burke : = = + =. + Représentation graphique :

9 A partir de la représentation de Lineweaver-Burke, on peut en déduire celle de Hanes- Woolf : =. + =. + = [PNPP]. + Représentation graphique : Les représentations graphiques de ces deux relations, sont préférables à celle de Micka Menten, car elles sont linéaires et donc plus précises pour la détermination des constan cinétiques Vmax et Km, d une réaction enzymatique. On obtient donc les résultats suivant : Lineweaver-Burke : - Vmax = - Km = Hanes-Woolf : - Vmax = 27,2 µmole/l/min - Km = 34,42 µmole/l Pour la représentation de Hanes-Woolf, nous avons enlevé le premier point de la courbe il ne correspondait pas au résultat attendu, il faussait la droite. Cf figure 4b et 4b 3) Ordre de la réaction : D après la courbe de Mickaelis-Menten, pour des faibles concentrations en substrat (de 0,3 µm), on a une courbe linéaire.

10 [PNPP] >> Km donc, V= (Vm/Km). [PNPP] Or Vm/Km = constante, donc V = K[PNPP] La vitesse est proportionnelle à la concentration en substrat dans le milieu, donc réaction est d ordre 1. Pour des concentrations en substrats importantes (de 200 à 500 µm), on a un plateau. [PNPP] << Km donc, V = Vmax La réaction est d ordre 0 4) Détermination de l activité spécifique de l enzyme : L activité spécifique As est la quantité de substrat convertie en produit par unité de tem au cours d une réaction enzymatique. Elle est exprimée en µmole/min. Activité Enzymatique AE = Vmax. V cuve AS Zn2 + = (Vmax cuve). V / (menz) AS Zn2 + = (27,2. 0,002) / (0,1. 0,25) = 2,2 µmol/min/mg Or l activité spécifique obtenue en présence 2+ dans de Mg les conditions optimales est cinq fois plus forte que l activité spécifique en présence 2+. de Zn AS Mg2+= AS Zn2+. 5 = 2,2. 5 = 11,0 U/mg L activité spécifique que nous trouvons est légèrement plus élevée que celle donnée pa fabriquant. VI. Etude d un phénomène de compétition entr deux substrats 1) Gamme étalon n 2 Nous réalisons une deuxième gamme étalon de tube, puis nous mesurons la DO à 410n Cf tableau 4 et figure 1b Calcul de la quantité de PNP dans chaque tube : Tube 1: n= 0 µmol Tube 2: n= PNP (C. VPNP) = (0,5. 0,2) = 0,10 µmole

11 De la même manière, on obtient : Tube 3: n= 0,20 µmole Tube 4: n= 0,30 µmole Tube 5: n= 0,40 µmole Tube 6: n= 0,50 µmole Calcul de la concentration de PNP dans chaque tube : Tube 1: C= 0 µmol/l Tube 2: C= PNP (C. VPNP) / Vtot = (0,5. 0,2) / 5 = 20 µmol/l De la même façon, on obtient : Tube 3: C= 40 µmol/l Tube 4: C= 60 µmol/l Tube 5: C= 80 µmol/l Tube 6: C= 100 µmol/l 2) Compétition entre le glycérophosphate et le PNPP Cf tableau 5 Dans cette partie, nous allons étudier l influence d un inhibiteur : le glycérophosphate (GRO-P) vitesse de la réaction enzymatique. Pour cela, nous allons préparer des séries de tubes de concentration en inhibiteur et en substrat (PNPP) différente. Nous allons ensuite, lancer la réac enzymatique dans chaque tube, pendant 3min exactement, afin de pouvoir comparer les vitess avec celles obtenues précédemment. Enfin, nous mesurons la DO à 410nm. Calcul des concentrations en Glycérophosphate dans les tubes : C1V1 = C2V2 C1 = C2V2/V1 Série A : C = (0,001. 0,001)/0,004 = 0,25mM Série B : C = 0,625mM Série C : C = 1,25mM Calcul des concentrations en PNPP dans les tubes : C1V1 = C2V2 C1 = C2V2/V1 Série 1 : C = (0, ,000125)/0,004 = 15,6 µmol/l Série 2 : C= 20,90 µmol/l Série 3 : C =31,25 µmol/l

12 Série 4 : C= 62,5 µmol/l Série 5 : C= 124,95 µmol/l Série 6 : C= 312,5 µmol/l Série 7 : C= 625 µmol/l Détermination de la vitesse de réaction : Après l arrêt de la réaction, nous mesurons l absorbance de chaque tube à 410nm. Afin de déterminer la quantité de produit libéré (en µmole/l), on reporte les valeurs de DO sur la gamme étalon n 2. Pour obtenir la vitesse de la réaction, on divise ces valeur le temps d incubation (3min). On a alors, une vitesse en µmole/l/min. Cependant, il faut d abord calculer la concentration de PNP libéré, avant 2HPO4, l ajout de NA qui a permis de stopper la réaction enzymatique. On multiplie alors cette concentration le coefficient de dilution d = 5/4. d = volume total/volume sans NA 2HPO4 CPNP = CPNP (NA2HPO4). 5/4 CPNP (A1) = 7,5. 5/4 = 9,4 µmole/l C est la valeur de la concentration non diluée, que l on divise par le temps d incubation. V(A1)= 9,4/3 = 3,1 µmole/l/min On procède de la même manière pour les autres essais. Nous traçons, ensuite, les courbes V= f ([PNPP] (figure 3) pour chaque concentration de glycérophosphate. Commentaire : Sur la figure 3, on observe que la vitesse de réaction sans inhibiteur est supérieure à ce avec inhibiteur. Effectivement, pour une même concentration en substrat (124,9 µmole la vitesse est de 23,74 µmole/l/min sans inhibiteur, alors qu elle est de 12,5 µmole/l/m avec une concentration en inhibiteur de 0,25mM. Ainsi, on peut dire, que le glycérophosphate diminue la vitesse d hydrolyse du substrat. De plus, on remarque, que plus la concentration en inhibiteur est importante, plus la vit de réaction est faible. On voit que pour la même concentration de substrat que précédemment, la vitesse est de 12,5 µmole/l/min pour une concentration de glycérophosphate de 0,25mM, et de 3,73 µmole/l/min pour une concentration de 1,25m

13 Pour conclure, la vitesse de réaction est diminuée par la présence d inhibiteur, et d auta plus que sa concentration est importante. Afin de déterminer les paramètres cinétiques (Vmax et Km), on linéarise la représentati Mickaelis-Menten, en utilisant l équation de Lineweaver-Burke (figure 4a). [PNPP] En µmole/l 15,6 20,9 31,3 62,5 124,9 312, /[PNPP] 0,064 0,048 0,032 0,016 0,008 0,0032 0,0016 Commentaire : Sur la figure 4a, on peut voir que chaque courbe se coupe en un même point sur l axe des ordo On a alors une valeur de (1/Vmax) identique pour chacune. En revanche, la valeur de ( -1/Km) diffère en fonction de la concentration en inhibiteur : On remarque que plus la concentration en glycérophosphate est grande, plus( -1/Km) est petit don le Km est grand. Ainsi, l inhibiteur a une influence sur le Km de la réaction, mais pas sur la Vitesse maximale. On donc en déduire, que le glycérophosphate agit comme un inhibiteur compétitif, c est-à-dire qu prend la place du substrat naturel de l enzyme. Celle-ci présente, alors, une plus faible affinité son substrat (PNPP) : le Km augmente. Schéma réactionnel d une inhibition compétitive : Km kcat E+S ES [E]totale= EP [ES] + [EI] + [E] Ki EI Sans inhibiteur [GRO-P] =0,25mM Vmax en µmole/l/min Km en µmole/l [GRO-P] =0,625mM [GRO-P] =1,25mM

14 Détermination des paramètres apparents : D après l équation de Mickaelis-Menten, on cherche l expression théorique de la fonction 1/V =f ( 1/[PNPP]) : Vi = = Avecα = + 1 = = (. ) + =(. )+ Pour 1/[PNPP] = 0, on a 1/V = 1/Vmax Ce qui correspond à l intersection de chaque droite avec l axe des ordonnées. Pour 1/V = 0 on a, (. )+ = 0 = Ce qui correspond à l intersection des droites avec l axe des abscisses. Nous pouvons en déduire le Km apparent, on trouve : Km app= Km. = Serie -1/Km app Km app en µmole/l A B C

15 On sait que Km app = On veut déterminer le KI, la constante de dissociation de l enzyme pour l inhibiteur. KI = Pour la série A : KI = Série [GRO-P] en mmole/l Km appen µmole/l K m en µmole/l A 0,25 B 0,625 C 1,25 Représentation de Dixon A partir de la relation en double inverse, on veut trouver la relation de Dixon : =(. )+ =. + =(. [GRO-P]+ (. + 1)) On obtient une équation de droite du type y= ax + b. Il s agit de la représentation de Dixon. Nous traçons donc les droites 1/V = f ([GRO-P] (figure 5) pour chaque concentration en PNPP. Commentaire : Sur la figure 5, on observe que les droites convergent en un seul et même point de coordonnées (-Km, 1/Vmax). Démonstration : Cf annexes

16 On peut donc en déduire les paramètres cinétiques Km et Vmax. Km = Vmax = VII. Conclusion

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