Rapport annuel d'activité, année Laboratoire National de Référence. Virus Influenza porcin

Transcription

1 Rapport annuel d'activité, année 214 Laboratoire National de Référence Virus Influenza porcin Nom du responsable du LNR Gaëlle Simon Nom de l'unité où l'activité du LNR est mise en œuvre Unité Virologie Immunologie Porcines Nom du laboratoire où l'activité du LNR est mise en œuvre Laboratoire de Ploufragan-Plouzané Nombre de laboratoires agréés et/ou reconnus dans le réseau 11 Précisez la catégorisation du danger (en SA) sinon la justification de l'existence du mandat de LNR Selon l arrêté du 29 juillet 213 relatif à la catégorisation des dangers sanitaires pour les espèces animales, la grippe porcine n est pas une maladie de catégories 1 ou 2. Elle n est donc pas soumise à réglementation. Cependant, la grippe porcine est une zoonose, et suite à la pandémie de 29 (due à un virus influenza A issu du réassortiment de plusieurs virus influenza porcins), la Direction Générale de l Alimentation a décidé de créer un LNR Influenza Porcin afin de conforter le diagnostic et l épidémiosurveillance des virus influenza porcins en France. Un réseau national de surveillance des virus influenza porcins (Résavip) a été mis en place début 211 (NS DGAL/SDSPA/215-38). 1

2 Introduction Les faits marquants de l'année L étude approfondie des virus influenza porcins identifiés en France a confirmé la circulation d un nouveau variant du virus H1huN2, lequel a émergé suite à un glissement antigénique (ou drift). La proportion croissante de nouveaux variants parmi les virus H1huN2 a nécessité l adaptation des réactifs de référence pour le sous-typage antigénique de ces souches et le diagnostic sérologique des infections dues à ces variants. En 214, les méthodes de RT- PCR en temps réel dédiées à la détection et au sous-typage moléculaire des virus influenza porcins ont également été adaptées pour des analyses en haut-débit. Un test de microneutralisation virale a été mis au point pour la détection des anticorps neutralisants dans les sérums. 1. Méthodes développées ou révisées Nombre de méthodes développées ou révisées proposées à l autorité compétente Nombre de méthodes développées ou révisées qui sont susceptibles d être prêtes pour être proposées à l autorité compétente au cours de l année N+1 2. Matériels biologiques ou chimiques, matériaux de référence et échantillons et souches d'intérêt Décrire ici les collections d'échantillons biologiques ou d'autre nature (environnement, aliment...) conservés par le LNR; indiquer les méthodes de conservation, la température, le nombre de "repositories", le nombre d'échantillons par souche, l'enregistrement associé...). Le LNR Influenza Porcin dispose d une collection d échantillons biologiques de différentes natures. Il s agit de prélèvements de porcs atteints de grippe, provenant d élevages français conventionnels ou de l animalerie protégée de porcs EOPS de l Anses-Ploufragan (suite à réalisation d inoculations expérimentales) : surnageants d écouvillons nasaux, fragments de poumons, salives, sérums. L étiquetage de ces prélèvements mentionne le numéro d enregistrement du dossier, le numéro d ordre, le type de prélèvement et la date de réception/aliquotage. Les surnageants d écouvillons (et organes) sont aliquotés en cryotubes (2 de.7ml (ou 2 de 2g) si possible), et conservés en échantillothèque à -7 C, sans limitation de durée, dans des boîtes identifiées «prélèvements d origine - boîte X - année N». Un fichier informatique est tenu à jour. 2

3 A partir des surnageants d écouvillons et échantillons de poumons (dits prélèvements d origine) sont isolées des souches virales, lesquelles alimentent la souchothèque. Les virus étant isolés et/ou amplifiés en culture cellulaire ou sur œufs embryonnés, les souches sont présentes soit sous forme de surnageant de culture cellulaire, soit sous forme de liquide allantoïdien. Un fichier récapitulatif «isolats année N» est mis à jour avec les commémoratifs associés à chaque nouvelle souche identifiée. Chaque utilisation (déstockage), amplification supplémentaire (stockage) ou caractérisation (titres HA, titres infectieux ) sont renseignées dans un document spécifique. Les isolats sont aliquotés en cryotubes et conservés en souchothèque à -7 C, sans limitation de durée, dans des boîtes identifiées «IVM ou IVO - Année N - boîte n X». La souchothèque est dupliquée dans deux surgélateurs. La règle d étiquetage pour les isolats est la suivante : nomenclature internationale de la souche / n échantillon / support d amplification (type cellulaire) + nombre de passage sur celui-ci / code analyse / volume. La nomenclature officielle pour les souches françaises est composée comme suit : type d influenza (A) / espèce (Sw pour swine) / Pays / lieu géographique (= numéro du département) / numéro interne (= numéro d enregistrement du dossier) / année d isolement. Les sérums post-infectieux et hyperimmuns récoltés sur porcs EOPS constituent la sérothèque. Ils sont stockés à -2 C. Certains sérums issus d élevages du terrain sont également conservés dans des boîtes identifiées «sérothèque - boîte X - année N». Un fichier informatique est tenu à jour. Nombre de souches/échantillons reçu(e)s et mis(es) en collection dans l'année 44 Nombre de souches/échantillons maintenu(e)s au total Activités d'analyse 3.1 Analyses officielles de première intention Nombre d'analyses de première intention réalisées dans l'année (de biotypie, sérotypie, caractérisation moléculaire...) 3.2. Analyses officielles de confirmation Nombre d'analyses de seconde intention réalisées dans l'année (de biotypie, sérotypie, caractérisation moléculaire...) 3

4 3.3. Autres analyses Nombre estimé d'autres analyses (non officielles) réalisées dans l'année en lien avec le mandat de LNR Détaillez ici par type d'autres analyses RT-PCR gène M (test qualitatif) = 55 (hors Résavip) (haut débit - recherche) = 367 qrt-pcr gène M (test quantitatif) = 8964 (dont haut débit - recherche) RT-PCR gène H1pdm = 124 (Résavip) + 5 (hors Résavip) = 129 RT-PCR gène N1pdm = 124 (Résavip) + 5 (hors Résavip) = 129 RT-PCR H1av= 112 (Résavip) + 5 (hors Résavip) (haut débit recherche) = 3129 RT-PCR H1hu= 112 (Résavip) + 5 (hors Résavip) (haut débit recherche) = 3129 RT-PCR H3 = 112 (Résavip) + 5 (hors Résavip) (haut débit recherche) = 3129 RT-PCR N1/N2 = 112 (Résavip) + 5 (hors Résavip) = 117 RT-PCR N1 = 312 (haut débit recherche) RT-PCR N2 = 312 (haut débit recherche) IVM (isolement viral sur culture de cellules MDCK) = 162 IVO (isolement viral sur œufs embryonnés) = 2 Sous-typages antigéniques par tests IHA multivalences = 2 Séquençages (gènes entiers) = 81 Tests sérologiques ELISA = 626 (diagnostic) (recherche) = 2539 Tests sérologiques IHA (1 valence) = 431(diagnostic) (essais expérimentaux) = 2696 Tests sérologiques de microneutralisation virale = 15 (recherche). 21 est l année de référence du LNR pour l analyse de l évolution des tendances en termes d activité. Entre 21 et 214, on distingue deux périodes d allures différentes. Une forte augmentation des nombres d échantillons déposés en échantillothèque et de virus entrés en souchothèque avait été observée entre 21 et 212, mais la tendance s est inversée à partir de 213. Ces nombres ont légèrement diminué en 213 et la baisse s est accentuée en 214. L augmentation des nombres d échantillons et de virus entre 21 et 212 avait fait suite à une augmentation du nombre d'élevages investigués (et non pas à une modification de la fréquence des infections grippales) en raison de la mise en place, à partir d'avril 211, du réseau national de surveillance des virus influenza chez le porc (Résavip) (NS DGAL/SDSPA/N215-38). La baisse constatée depuis 213 est principalement liée à une diminution du nombre de cas directement investigués par l Anses- Ploufragan et du nombre de demandes d analyses hors Résavip. Ainsi, le nombre d analyses virologiques de diagnostic de première intention (RT-PCR gène M) réalisées par le LNR est en baisse constante depuis 211, puisque Résavip fait intervenir un réseau de laboratoires vétérinaires départementaux agréés pour la détection des virus Influenza A chez le porc. Les analyses de seconde intention (RT-PCRs de soustypage, isolement viral) ont par contre nettement augmenté jusqu en 213. En 214, le nombre d analyses de seconde intention a légèrement diminué par rapport à l année précédente, en lien avec la baisse du nombre de cas investigués et détectés positifs. 4

5 Comme en 213, les isolements des virus détectés n ont pas été mis en œuvre de façon systématique, dès lors que le sous-typage moléculaire réalisé sur les prélèvements d origine était fructueux. L adaptation aux analyses en haut débit des RT-PCR gène M qualitative et quantitative, ainsi que des RT-PCR de sous-typage a permis, en 214, de tester un très grand nombre d échantillons issus d essais expérimentaux et d enquêtes en élevage. Les nombres d analyses sérologiques fluctuent en fonction des investigations menées en élevage par l Anses-Ploufragan, des essais expérimentaux réalisés dans le cadre de la recherche et des sollicitations externes dans le cadre d enquêtes ponctuelles. En 214, le nombre d analyses sérologiques a été très important. Ces analyses ont essentiellement concerné des prélèvements issus d essais expérimentaux, essais qui ont en outre nécessité la mise au point d un test de microneutralisation virale. 4. Activités de production et de contrôle de matériaux de référence et de réactifs biologiques Le LNR produit-il et fournit-il des réactifs? Oui Cette activité est-elle une obligation découlant de textes réglementaires, normatifs ou infra-réglementaires (notes de service). Si oui, lesquels? Non Quels sont les types de réactifs produits et fournis (vaccins, kits, autres)? Souches virales amplifiées, non inactivées. Quels est le nombre de lots produits et fournis par an? (moyenne sur les 5 dernières années) 13 Quelles sont les quantités produites/fournies par lot? (moyenne sur les 5 dernières années) 1 5

6 Analyse de l'évolution (augmentation, diminution) des tendances en termes d'activité sur les 5 dernières années La fourniture de souches virales a été moindre en 214 en raison de la clôture, fin 213, de l action concertée européenne ESNIP3 pour laquelle le LNR alimentait la banque de virus. Le LNR fournit-il des matériaux de référence? Oui Cette activité est-elle une obligation découlant de textes réglementaires, normatifs ou infra-réglementaires (notes de service). Si oui, lesquels? Non Quels sont les types de matériaux de référence (MRE, MRI, contrôles positifs ou négatifs, autre) produits et fournis? MRI, contrôles positifs, contrôles négatifs Quel est le format (sérum, souche, produit chimique, autre) de ces matériaux de référence? Sérums hyper immuns, souches virales amplifiées inactivées (antigènes de référence pour tests IHA), calibrées et diluées dans une matrice spécifique (contrôles positifs pour réactions RT-PCR), prélèvements de porcs EOPS non inoculés (contrôles négatifs : sérums, surnageants d écouvillons nasaux, poumons ) Quel est le nombre de lots produits et fournis par an? (moyenne sur les 5 dernières années) 1 Quelles sont les quantités produites/fournies par lot? (moyenne sur les 5 dernières années) 1 Analyse de l'évolution (augmentation, diminution) des tendances en termes d'activité sur les 5 dernières années La fourniture de matériaux de référence est stable. 6

7 Le LNR réalise-t-il des contrôles de réactifs commerciaux? Oui Cette activité est-elle une obligation découlant de textes réglementaires, normatifs ou infra-réglementaires (notes de service). Si oui, lesquels? Oui. La note de service DGAL/SDSPA/N du 28/1/29 donne la liste des cinq kits de RT-PCR qui ont été validés par le LNR et que les laboratoires agréés peuvent utiliser. Quelles sont les modalités de contrôle (initiaux, répétitifs, lot par lot)? Le LNR réalise des contrôles lot par lot. Quel est le nombre de contrôles - ou de lots contrôlés - par an? (moyenne sur les 5 dernières années) 6 Analyse de l'évolution (augmentation, diminution) des tendances en termes d'activité sur les 5 dernières années L activité de contrôle est stable. 5. Activités d'expertise scientifique et technique 5.1. Demandes d expertise scientifique et technique du ministère (chargé de l agriculture, santé, etc ) ou d instances communautaires et internationales qui concernent votre domaine de compétence Nombre de rapports d'est rendus dans l'année 5.2. Autres expertises Les membres de l'équipe du LNR peuvent avoir des activités d'expertise (internes: CES, GT ou externe: EFSA...) ou des activités auprès de commissions de normalisation (Afnor...). Détaillez ici ces activités et estimez le temps qui y est consacré. La responsable du LNR est membre du Groupe d Expertise Collective d Urgence (GECU) Influenza Porcin de l Anses. Aucune saisine n a été traitée en 214. Elle est également enregistrée comme expert auprès de l EFSA, mais n a pas été sollicitée par l agence européenne en

8 5.3. Dossiers de demande d'agrément Nombre de dossiers de demande d'agrément étudiés dans l'année 5.4. Activités de conseil aux professionnels Détaillez ici ces activités et estimez le temps qui y est consacré Le LNR Influenza porcin reçoit, en moyenne, 1 appel téléphonique ou courriel par semaine en provenance des laboratoires vétérinaires, agréés ou autres, des animateurs régionaux du Résavip ou des vétérinaires volontaires pour des demandes de renseignements sur les méthodes d analyses, sur l interprétation des résultats des sous-typages de souches, sur les modalités de prélèvements en élevage, etc. Un guide et un formulaire relatifs aux envois d échantillons au LNR et aux demandes d'analyses sont disponibles sur le site internet de l Anses, dans la rubrique «Recherche et référence/cartes des Laboratoires/Ploufragan- Plouzané/Activité de référence/influenza porcin». 6. Animation du réseau de laboratoires officiels 6.1. Organisation d'eila Précisez ici le nombre d'eila organisés par le LNR au cours de l année N Nom (s) et nombre(s) d'eila que vous prévoyez d'organiser au cours de l année N+1 «Influenza porcin, RT-PCR en temps réel», 1 EILA Précisez le nombre d'eil (hors EILA - dont EILV en lien avec méthodes en cours de validation telles que précisées dans le paragraphe 1) organisés par le LNR au cours de l année N Précisez le nombre d'eil (hors EILA) que vous prévoyez d'organiser au cours de l année N+1 8

9 6.2. Formation, organisation d'ateliers, accueil de stagiaires Nombre de journées d'échange et de restitution rassemblant les laboratoires agréés du réseau, organisées dans l'année Détaillez ici ces activités et indiquez le nombre de participants par journée 1 Journée nationale du réseau de surveillance des virus influenza chez le porc (Résavip) - 6 participants (5 laboratoires départementaux agréés représentés). Nombre de sessions de formation des personnels des laboratoires agréés aux méthodes utilisées pour les contrôles officiels, organisées dans l'année 6.3. EILA auxquels le LNR a participé dans l'année Détaillez les EILA auxquels le LNR a participé dans l'année, dans le cadre : National; UE (EILA organisé par le LRUE); International Sans objet 7. Participation aux activités de surveillance 7.1 PS/PC Existe-t-il un ou plusieurs PS/PC élaboré(s) par l'autorité sanitaire dans le champ du LNR? Non 7.2 Activités de surveillance hors PS/PC Dispositif(s) hors PS/PC Indiquer si le LNR est intégré à un (ou des) dispositif(s) de surveillance (hors PS/PC)? Oui 9

10 En dehors du dispositif PS/PC de la DGAl préciser si le LNR est intégré à un autre dispositif (Résapath, Salmonella, Resabeille,...) Le LNR est intégré au Résavip, réseau national de surveillance des virus influenza porcins. Le dispositif a été mis en place en 211 suite à un accord entre la Direction générale de l alimentation (DGAl) et les représentants de la filière porcine, en concertation avec l Anses (DGAL/SDSPA/ du 16/1/215). L objectif de Résavip est d approcher la diversité et la dynamique des virus influenza A circulant chez le porc en France métropolitaine. La surveillance est événementielle. Les prélèvements sont effectués par des vétérinaires volontaires lors de suspicions cliniques de grippe. Les laboratoires vétérinaires agréés effectuent les analyses de 1ère intention. Le LNR intervient aux fins d identification des sous-types et des lignages d appartenance des virus détectés. En collaboration avec l Unité Epidémiologie et bien-être porcin, le LNR est également chargé de confronter, par des analyses statistiques, les résultats de virologie et les données récoltées en élevage par les vétérinaires, afin de décrire les différentes caractéristiques épidémiologiques associées aux infections détectées et d interpréter les données. Le LNR est en outre membre du comité de pilotage du réseau, et à ce titre participe à la définition des orientations stratégiques et des modalités de la surveillance. Il est également membre du Groupe de Suivi Virus Influenza Porcin (GS-VIP) de la plateforme d épidémiosurveillance en santé animale (ESA), lequel apporte un appui scientifique et technique à Résavip pour son fonctionnement, son évaluation et les retours d information aux acteurs de terrain Gestionnaire du dispositif Indiquer qui est le gestionnaire de ce dispositif L'ordonnateur de Résavip est la DGAl, les SRAL sont gestionnaires au niveau régional, l'animateur national est Coop de France unités intégrées dans le dispositif Préciser si d'autres unités/entités de l'agence sont intégrées dans ce dispositif à vos cotés Oui Lesquelles? L'Unité Epidémiologie et Bien-Etre du Porc (UEBEP) du laboratoire Anses de Ploufragan- Plouzané a pour mission de participer au traitement des données épidémiologiques relevées dans les Documents d Accompagnement des Prélèvements (DAP) renseignés dans le cadre de Résavip. 1

11 7.2.4 Les partenaires et acteurs de ce dispositif de surveillance Sont acteurs ou partenaires de ce dispositif: Le réseau de laboratoire du LNR Un réseau de vétérinaires Un réseau d'acteurs professionnels Les partenaires et acteurs de Résavip sont la DGAl (gestionnaire national), les SRAL (gestionnaires en régions), Coop de France (animateur national), GDS France et SNGTV (représentants des professionnels), l Adilva (représentant des laboratoires agréés), l Anses- Ploufragan (LNR Influenza Porcin et Unité EBEP), les animateurs régionaux (nommés par la DGAl sur proposition des représentants des professionnels), des vétérinaires et éleveurs volontaires. Résavip fait en outre l objet d un accompagnement et d une évaluation par la plateforme d épidémiosurveillance en santé animale (ESA) au sein du groupe de suivi Virus Influenza Porcins GS-VIP), groupe auquel participent les partenaires nationaux Modalités de surveillance Préciser si ce dispositif repose : Sur des modalités de surveillance événementielles (notification de cas par des acteurs de terrain) 8. Activités de recherche en lien avec l activité de référence 8.1. Recherches méthodologiques pour la référence Détaillez ici les recherches méthodologiques que vous avez réalisées dans l'année : objectifs, partenariats, apports du LNR, projets retenus dans le cadre d'appels à projets... Les recherches et développements méthodologiques opérés en 214 ont concerné : 1) L adaptation aux analyses en haut débit des RT-PCR gènes M et beta-actine, qualitatives d une part, quantitatives d autre part. Ces nouveaux développements méthodologiques ont été opérés en collaboration avec la plateforme IdentyPath de l Anses à Maisons-Alfort. Ils permettront d analyser rapidement et de manière robuste (analyses possibles en triplicats) de très grandes séries d échantillons, issues d essais expérimentaux ou d enquêtes particulières menées en élevage ; 2) L adaptation aux analyses en haut-débit des RT-PCR en temps réel précédemment mises au point pour le sous-typage moléculaire des virus influenza porcins (amplification identification des différents gènes HA et NA). Ces développements ont également été opérés en collaboration avec la plateforme IdentyPath. Ils ont contribué aux actions menées dans le cadre du projet européen CoVetLab (octobre mars 215) dédié au développement et à la validation de nouveaux outils moléculaires dédiés au sous-typage des virus influenza porcins en Europe (collaboration Anses, AHVLA, SVA, DTU, CVI- Lelystad + partenariat FLI et IZSLER-Parma). Comme pour les méthodes de détection et de quantification, ces développements permettront d analyser rapidement et de manière robuste de très grandes séries d échantillons, issues d essais expérimentaux ou d enquêtes particulières menées en élevage ; 11

12 3) La détection des virus influenza porcins dans des prélèvements d air (bioaérosols). Cette compétence permettra de compléter les études expérimentales sur la transmission des SIV, les études sur la persistance des virus en élevage, ainsi que les études sur la qualité de l air en élevage ; 4) L introduction d une nouvelle valence H1huN2 dans les tests d inhibition de l hémagglutination afin de détecter les anticorps sériques dirigés contre le nouveau variant ; 5) La production sur porc EOPS d un sérum hyper immun de référence dirigé contre le nouveau variant H1huN2, pour introduction dans le panel de sérums de référence dédié au sous-typage antigénique par test d inhibition de l hémagglutination ; 6) La mise au point d une méthode de microneutralisation virale pour la détection des anticorps neutralisants anti-virus influenza porcins dans les sérums de porc ; 7) Le développement d un système de génétique inverse pour la production de virus influenza porcins recombinants. En 214, les 8 segments génomiques d un virus H1huN2 de référence ont été insérés dans des plasmides d expression. La mise au point de la production in vitro de virus recombinants, suite à transfection cellulaire, se poursuit en 215 en collaboration avec le laboratoire VirPath de l Université de Lyon. Ce système permettra l étude approfondie de l impact de délétions et/ou mutations particulières observées dans les génomes de virus émergents comme le nouveau variant H1huN2 apparu en 212. Il permettra également l étude des mécanismes sous-jacents aux réassortiments génomiques ainsi que les conséquences de certaines combinaisons de gènes Recherches associées pour la référence Détaillez ici les recherches associées auxquelles vous avez participé dans l'année (participations à des études cliniques, études d'incidences, modèles d'infections expérimentales, études toxicologiques, essais vaccinaux...): objectifs, partenariats, apports du LNR, projets retenus dans le cadre d'appels à projets... Parallèlement aux activités de référence, l équipe «Influenza Porcin» de l Unité VIP mène des travaux de recherches associées dans deux thématiques majeures : d une part le suivi de l évolution des souches et l étude des déterminants de la spécificité d hôte ; d autre part l étude du rôle joué par les virus influenza porcins dans le développement des syndromes respiratoires complexes et l étude de la dynamique des souches en élevage. Ces projets s inscrivent dans l évaluation du risque de transmission des virus influenza porcins à l Homme et de la génération chez le porc de nouveaux virus réassortants à potentiel zoonotique voire pandémique. Ils s inscrivent également dans une démarche globale de la préservation de la santé et du bien-être en élevage, dans un contexte de démédicalisation. Globalement, la surveillance menée en 214 a montré que les virus influenza porcins européens H1avN1 et H1huN2 sont responsables d environ 2/3 et 1/3 des cas de grippe, respectivement. Le H1avN1 circule sur tout le territoire, tandis que le H1huN2 affecte plutôt les élevages de l Ouest, région où sont ponctuellement isolés des virus réassortants entre virus enzootiques. La présence du H3N2 dans des élevages du Nord, près de la frontière belge, a été confirmée. Même si la proportion de H1N1pdm reste faible au niveau national, sa circulation s est maintenue, notamment dans les régions les plus centrales du pays, là où les autres virus enzootiques semblent moins actifs que dans les régions de forte densité 12

13 porcine. Cependant, sa détection à l est de la Bretagne en juin 214, montre que la situation pourrait évoluer et qu on peut craindre l émergence de nouvelles souches issues de réassortiments entre H1N1pdm et les autres SIV, comme dans d autres pays européens. De tels virus réassortants, contenant un ou plusieurs gènes du H1N1pdm, n ont pas pour l instant été identifiés en France. L étude phénotypique et génotypique des H1N1pdm isolés chez le porc en France depuis 21 a révélé qu ils ont globalement peu évolué pour le moment par rapport à la souche humaine de référence de 29. Cependant, des mutations se sont quand même accumulées au cours du temps, conduisant à une distinction de plus en plus marquée des H1N1pdm isolés chez le porc de ceux isolés chez l homme. Ces mutations concernent l ensemble des gènes et il n a pas été identifié de déterminants particuliers de la spécificité d hôte. En 214, l étude approfondie des virus influenza porcins identifiés en France a principalement confirmé la circulation d un nouveau variant H1huN2 qui a émergé au cours de l année 212. Depuis leur apparition en 1994, les virus H1huN2 avaient jusque-là peu évolué au niveau antigénique, mais nous avons ici mis en évidence un glissement (drift). La proportion croissante de variants parmi les virus H1huN2 détectés en 213 et 214 a nécessité la sélection d un nouvel antigène de référence pour inclusion dans les tests sérologiques et la production d un nouveau sérum de référence pour le sous-typage antigénique (voir supra). A ce jour, le nouveau variant ne semble pas avoir été responsable de syndromes grippaux d intensité supérieure à ceux provoqués par le virus H1huN2 d origine, mais il conviendra de comparer leurs propriétés et pathogénicités en conditions expérimentales (notamment à l aide de virus recombinants produits par génétique inverse voir supra). Des H1avN1 porcins étant isolés chez la dinde, nous avions entrepris de comparer les génotypes de virus isolés dans les deux espèces, dans la même région (Bretagne) au cours de la même période de temps (25-28) (collaboration Unité Virologie Aviaire). Cette étude n a pas mis en évidence de modifications génomiques spécifiques suite au passage de la barrière d espèces, mais la comparaison des virus se poursuit au niveau fonctionnel. Un projet avait précédemment été mené en collaboration avec l Unité Epidémiologie et Bienêtre Porcin (UEBEP) de l Anses-Ploufragan afin d objectiver les facteurs favorisant les formes récurrentes de grippe en élevage. Une étude longitudinale menée dans 3 élevages sélectionnés avait permis de démontrer des infections à virus influenza porcin au moins une fois et à âges fixes sur chacune des 3 cohortes de 4 porcs suivies par élevage. Des H1avN1 ou H1huN2 et leurs réassortants ont successivement, et parfois simultanément, été identifiés, suggérant une co-circulation à l échelle de l élevage, de la bande, voire de l individu. Suite aux premiers résultats obtenus par RT-PCR conventionnelles sur quelques échantillons sélectionnés, un projet complémentaire (SIVREC) a été lancé afin de mieux approcher la diversité virale au sein des bandes et des animaux, et d étudier l évolution des virus dans les élevages suite à leurs passages inter-bandes successifs. Le sous-typage moléculaire haut débit (voir supra) a permis d analyser 14 échantillons positifs contre 218 lors du premier projet et de déterminer les populations virales présentes dans 52% des échantillons positifs (contre 9,4%). Les nouvelles données acquises, en cours d interprétation, ont conduit à la sélection d échantillons à séquencer. Elles vont aussi permettre d évaluer les taux de transmission en fonction du/des sous-type(s) impliqué(s). Une des hypothèses concernant le déterminisme de la récurrence des infections grippales à 13

14 l échelle de l élevage est un déficit de réponse immunitaire, notamment lorsque l infection survient chez des jeunes présentant une immunité passive. Afin d évaluer l impact des anticorps maternels sur la réplication et la transmission virales, et sur la réponse immunitaire post-infectieuse, un essai a récemment été conduit et est en cours d exploitation (SIVMAB, collaboration UEBEP). Des truies EOPS ont été vaccinées afin de produire des porcelets présentant des anticorps d origine maternelle (MDA). Les réponses cliniques, virologiques et immunitaires à une infection H1avN1 chez des porcelets MDA+ sont comparées à celles mesurées chez des porcelets MDA-. Des porcelets MDA+ et MDA- ont été placés au contact (direct et indirect) des animaux inoculés afin de comparer le potentiel de transmission du virus dans les deux situations. Enfin, les réponses immunitaires post-infectieuses sont évaluées via l estimation du niveau de protection conféré vis-à-vis d un second challenge homologue. SIVMAB s inscrit dans une démarche de modélisation de la propagation des virus grippaux en élevage porcin (thèse MODFLUPIG, UEBEP). Les résultats obtenus complèteront également l étude des réponses post-infectieuses menées dans le cadre de la thèse MHFLU ( ) conduite en UVIP. Le projet MHFLU a pour objectif de synthétiser et d approfondir les études comparées de la pathogénèse des SIV chez le porc pré-infecté ou non par Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp), un autre pathogène à tropisme respiratoire largement répandu en élevage. L étude de la pathologie pulmonaire avait confirmé l implication du H1avN1 dans le complexe respiratoire porcin et nous avions montré l exacerbation de l infection H1avN1 (mais pas H1huN2) chez des porcs pré-infectés par Mhp. Il était apparu que l infection Mhp induit un stress oxydant, accentué par l infection H1avN1, et que la sévérité de la grippe varie en fonction du niveau de stress oxydant de l animal au moment de l infection, niveau qui pourrait lui-même être influencé par l alimentation. Afin d étudier l influence du statut nutritionnel sur la capacité des porcs à mobiliser leurs ressources pour faire face à l infection, une autre étude a concerné les effets d une restriction alimentaire de courte durée (RestriAlFlu, collaboration. INRA Saint-Gilles, Unité Mycoplasmologie Bactériologie (UMB) Anses-Ploufragan). La restriction appliquée quelques jours avant l infection H1avN1 n a pas montré d effet, ni sur les lésions pulmonaires, ni sur l excrétion virale, ni sur la dissémination des pathogènes dans les poumons, mais s est montrée bénéfique au regard des performances zootechniques (période d hyperthermie plus courte, pas de perte de poids). Ce travail a par ailleurs montré que la co-infection Mhp/H1N1 modifie les métabolismes glucidique et protéique, mettant notamment en évidence les modifications des cinétiques post-prandiales des concentrations plasmatiques en en thréonine et arginine. Les réponses inflammatoires et immunitaires mises en place très précocement après infection H1avN1 chez des porcs sains versus des porcs pré-infectés Mhp ont été abordées suite à abattages séquentiels à 5h, 24h et 48h post-infection (SIVINATE, collaboration TiHo Hanovre, INRA Tours, UMB). Les signes cliniques et les quantités de virus excrétés étaient identiques dans les deux lots d animaux. Aucune différence n a été observée concernant la quantité ou la distribution des pathogènes dans le poumon. Cependant, les analyses histologiques ont révélé des lésions microscopiques pulmonaires plus précoces et plus sévères chez les porcs pré-infectés Mhp, avec un afflux important de neutrophiles et une forte réaction inflammatoire. La quantification de transcrits relatifs à la réponse interféron, la production de cytokines et la régulation de la réponse innée dans les tissus pulmonaires, ainsi que les dosages de cytokines dans les lavages broncho-alvéolaires ont montré un pic de réponse inflammatoire à 24h sans toutefois mettre en évidence de différence entre les 2 14

15 lots. Il semble que l effet additif ou synergique entre les pathogènes ne dépende pas directement d une augmentation de la réponse inflammatoire. Les travaux menés avec l INRA Tours ont en outre permis d approcher l étude in vitro/ex vivo des réponses innées post-infection H3N2 et post-coinfection H3N2/virus du Syndrome Dysgénésique et Respiratoire Porcin. Une collaboration avec l INRA Jouy-en-Josas a été poursuivie pour la caractérisation des cellules dendritiques (DC) inflammatoires de la peau et du poumon. Enfin, nous avons répondu à la sollicitation du consortium FLURIAD (projet labellisé Medicen) pour évaluer l efficacité de nouveaux modes de vaccination anti-grippale par voie muqueuse. Le cas échéant, le projet MUCOGRIP en cours permettra au modèle expérimental d infection grippale chez le porc de servir de preuve de concept pour l amélioration des pratiques vaccinales chez l homme. Il permettra en outre d acquérir de nouvelles connaissances quant à la vaccination mucosale chez le porc et d évaluer son intérêt potentiel pour la santé animale. 9. Relations avec le CNR Existence d'un CNR Oui Intitulé du CNR CNR Grippe région Nord et CNR Grippe région Sud Organisme porteur du CNR Institut Pasteur de Paris (Grippe Nord) et Hospices Civils/Laboratoire VirPath, Université Lyon 1 (Grippe Sud) Collaboration dans le cadre de la surveillance, détailler: Etude comparative de l évolution des virus A/H1N1(29) circulant en France dans les espèces humaine et porcine (fourniture de séquences de virus humains par les CNR) Collaboration dans le cadre de projets de recherche, détailler: Collaboration avec le Laboratoire VirPath dans le cadre d un projet de recherche & développement relatif à l étude de la vaccination anti-grippale par voie muqueuse dans le modèle porcin (projet MUCOGRIP collaboration consortium FLURIAD). 15

16 Autres collaborations, détailler: Collaboration avec le Laboratoire VirPath pour la mise au point de la production de virus influenza porcins recombinants par génétique inverse. 1. Autres mandats Le LNR détient-il d'autres mandats de référence dans le même domaine de compétences Non Annexes Listes des publications et communications: Publications destinées aux professionnels Fablet C., Simon G., Dorenlor V., Eono F., Eveno E., Gorin S., Quéguiner S., Madec F., Rose N. (214) Les circonstances associées à l infection grippale des porcs en engraissement diffèrent selon le sous-type viral en cause : une enquête épidémiologique dans 125 élevages du Grand Ouest de la France. Journées de la Recherche Porcine, 46, Simon G. (214) Swine influenza viruses: mechanisms of evolution and current diversity in European pigs. Pig333.com, What the experts say, 29-May Hervé S., Garin E., Rose N., Marcé C., Simon G. (214) Réseau national de surveillance des virus influenza chez le porc (Résavip) Résultats des trois premières années de fonctionnement. Bulletin Epidémiologique Santé Animale et Alimentation Anses-DGAl, 63, Publications scientifiques internationales Simon G., Larsen L.E., Dürrwald R., Foni E., Harder T., Van Reeth K., Markowska-Daniel I., Reid S.M., Dan A., Maldonado J., Huovilainen A., Billinis C., Davidson I., Agüero M., Vila T., Hervé S., Breum S.Ø., Chiapponi C., Urbaniak K., Kyriakis C.S., ESNIP3 consortium, Brown I.H., Loeffen W. (214) European surveillance network for influenza in pigs: surveillance programs, diagnostic tools and swine influenza virus subtypes identified in 14 European countries from 21 to 213. PLoS One, 9:e Marquet F., Vu Manh T.-P., Maisonnasse P., Elhmouzy-Younes J., Urien C., Bouguyon E., Jouneau L., Bourge M., Simon G., Bonneau M., Dalod M., Schwartz-Cornil I., Bertho N. (214) Pig skin includes dendritic cells subsets transcriptomically related to human CD1a and CD14 dendritic cells presenting different migrating behaviors and T cell activation capacities. Journal of Immunology, 193:

17 Fablet C., Simon G., Dorenlor V., Eono F., Eveno E., Gorin S., Quéguiner S., Madec F., Rose N. (214) Recherche des facteurs associés à l infection des porcs en engraissement par les virus influenza porcins H1N1 et H1N2 dans 125 élevages du Grand Ouest de la France. Épidémiologie et santé animale, 66, Le Floc h N., Deblanc C., Cariolet R., Gautier-Bouchardon A.V., Merlot E., Simon G. (214) Effect of feed restriction on performance and postprandial nutrient metabolism in pigs co-infected with Mycoplasma hyopneumoniae and swine influenza virus. PLoS One, 9: e1465. Equal contributors. Delgado-Ortega M., Olivier M., Sizaret P.Y., Simon G., Meurens F. (214) New born pig trachea (NPTr) cell line cultured in air-liquid interface conditions allows a partial in vitro representation of the porcine upper airway tissue. BMC Cell Biology, 15, 14. Delgado-Ortega M., Melo S., Punyadarsaniya D., Ramé C., Olivier M., Soubieux D., Marc D., Simon G., Herrler G., Berri M., Dupont J., Meurens F. (214) Innate immune response to a H3N2 subtype of swine influenza virus in a newborn porcine trachea cells, alveolar macrophages, and precision-cut lung slices. Veterinary Research, 45, 42. Dobrescu I., Levast B, Lai K., Delgado-Ortega M., Walker S., Banman S., Simon G., Zhou Y., Gerdts V., Meurens F. (214) In vitro and ex vivo analyses of co-infections with swine influenza and porcine reproductive and respiratory syndrome viruses. Veterinary Microbiology, 169, Communications nationales Fablet C., Simon G., Dorenlor V., Eono F., Eveno E., Gorin S., Quéguiner S., Madec F., Rose N. Les circonstances associées à l infection grippale des porcs en engraissement diffèrent selon le soustype viral en cause : une enquête épidémiologique dans 125 élevages du Grand Ouest de la France. Journées de la Recherche Porcine, Paris, France, 4-5 février 214. Simon G., Loeffen W., Reid S.M., Kellam P., Watson S.J., Larsen L.E., Lewis N.S., van Reeth K., ESNIP3 consortium, Brown I.H. Caractérisation des virus Influenza A en circulation chez le porc dans 16 pays européens entre 21 et 213. XVI èmes Journées Francophones de Virologie, Paris, France, 6-7 mars 214. Résumé dans Virologie, 18, S64. Bonin, E., Hervé S., Saulnier A., Quéguiner S., Barbier N., Gorin S., Simon G. Suivi de l évolution génétique des virus pandémiques Influenza A(H1N1) 29 isolés chez le porc en France depuis Janvier 21. XVI èmes Journées Francophones de Virologie, Paris, France, 6-7 mars 214. Résumé publié dans Virologie, 18, S Fablet C., Simon G., Dorenlor V., Eono F., Eveno E., Gorin S., Quéguiner S., Madec F., Rose N. Recherche des facteurs associés à l infection des porcs en engraissement par les virus influenza porcins H1N1 et H1N2 dans 125 élevages du Grand Ouest de la France. Journées scientifiques de l'association pour l'étude de l'épidémiologie des Maladies Animales (AEEMA), Maisons-Alfort, France, mars 214. Simon G., Hervé S., Eveno E., Barbier N., Eono F., Dorenlor V., Andraud M., Camsusou C., Madec F., Rose N. Etude des infections récurrentes à virus influenza A en élevage porcin. Journée Scientifique des Laboratoires Anses, Maisons-Alfort, 26 novembre

18 Deblanc C. Comparaison des réponses immunitaires innées mises en place suite à l infection par le virus Influenza porcin H1N1 chez le porc pré-infecté ou non avec Mycoplasma hyopneumoniae. Journée des Doctorants et Post-doctorants de l Anses, Maisons-Alfort, novembre 214. Communications internationales Fablet C., Simon G., Dorenlor V., Eono F., Eveno E., Gorin S., Quéguiner S., Madec F., Rose N. Factors associated with H1N1 or H1N2 influenza virus infections in fattening pigs: a study in 125 herds. In proceedings of 6 th European Symposium on Porcine Health Management, Sorrento, Italy, 7 th -9 th May 214, p. 91. Fablet C., Marois-Créhan C., Simon G., Grasland B., Jestin A., Kobisch M., Madec F., Rose N. Dynamique infectieuse en élevage associée à la pneumonie et à la pleurésie : une enquête épidémiologique dans 125 élevages. 6 ème Colloque International Francophone de Microbiologie Animale (CIFMA), Toulouse, France, mai 214. Résumé p.41. Fablet C., Simon G., Dorenlor V., Eono F., Eveno E., Bourry O., Gorin S., Quéguiner S., Madec F., Rose N. Herd level factors associated with European H1N1 and H1N2 influenza virus infections in fattening pigs. In proceedings of the 23 rd International Pig Veterinary Society congress, Cancun, Mexico, June 8-11, 213, p Fablet C., Simon G., Dorenlor V., Eono F., Eveno E., Gorin S., Quéguiner S., Madec F., Rose N. Herd level factors associated with H1N1 or H1N2 influenza virus infections in finishing pigs. In proceedings of 65 th Annual Meeting of the European Federation of Animal Science (EAAP), Copenhagen, Denmark, August 214, p Simon G., Larsen L.E., Dürwald R., Foni E., van Reeth K., Reid S.M., Harder T., Dan A., Markowska- Daniel I., Maldonado J., Huovilainen A., Billinis C., Davidson I., Agüero-Garcia M., Bublot M., ESNIP3 consortium, Brown I.H., Loeffen W. European surveillance network for influenza in pigs (ESNIP): Surveillance programs, diagnostic tools and swine influenza viruses identified in 14 European countries from 21 to 213. In proceedings of 5th ESWI Influenza Conference, Riga, Latvia, September 214, p. 36. Deblanc C., Delgado-Ortega M., Berri M., Herrler G., Meurens F., Simon G. Comparison of innate immune responses to infection with swine influenza virus H1N1 in naïve pigs and pigs preinfected with Mycoplasma hyopneumoniae. In proceedings of 4th International Influenza Meeting (FluResNet), Munster, Germany, September 214, p.64. Conférences sur invitation Simon G. La Grippe chez le porc. Conférence dans le cadre du Master 2 Qualité et Environnement en production animale, Département de productions animales, UFR Sciences et Techniques, Université de Tours, Ploufragan, France, 23 janvier 214. Simon G. Virus influenza porcins et problématique de santé publique - Evolutions virales et transmissions inter-espèces. Journée nationale du Réseau de Surveillance des Virus Influenza chez le Porc (Résavip), Maisons-Alfort, France, 17 avril

19 Hervé S. Résultats de la surveillance menée en France de 211 à 213 dans le cadre du Résavip. Journée nationale du Réseau de Surveillance des Virus Influenza chez le Porc (Résavip), Maisons-Alfort, France, 17 avril 214. Simon G. La grippe chez le porc. Conférence dans le cadre de l UE Interaction Hôte-Pathogène des Master 2 SCMV, SAED, MFA de l Université de Rennes 1 et du Master 2 BBRT de l Université de Nantes, Rennes, France, 24 novembre 214. Simon G. Diversité croissante des virus influenza porcins : Recherche et Développement en amont et en aval de la Surveillance. Réunion d Informations et d Echanges Secteur Porcin, Ploufragan, France, 11 décembre 214. (rapport p ). 19