Séquençage Assemblage. de Génomes. Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix-Marseille Université

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1 Séquençage Assemblage de Génomes Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix-Marseille Université

2 Projet de séquençage d un génome Séquençage aléatoire Assemblage Annotation Data Release Library construction Assembler Genome scaffold Gene finding Publication Colony picking Combinatorial PCR Homology searches Template preparation Initial role assignments Sequencing reactions Base calling Ordered contig set Gap closure sequence editing Metabolic pathways Gene families Comparative genomics Sequence files Sample tracking Re-assembly ONE ASSEMBLY! Transcriptional/ translational regularory elements Repetitive sequences

3 Technologies de séquençage Frederick Sanger Nationality : United Kingdom Fields : Biochemist Institutions : Laboratory of Molecular Biology, St John's College, Cambridge Notable awards : Nobel Prize in Chemistry (1958), Nobel Prize in Chemistry (1980) Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74:

4 Principe: Générer à partir d une extrémité fixe tous les fragments d ADN se terminant par une base donnée Utilisation d un oligonucléotide qui après hybridation à sa matrice simple brin, sert d amorce à une réaction de polymérisation enzymatique

5 ddntp fluorescents Primers fluorescents

6 Séparation et détection des fragments Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix Marseille II

7 Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix Marseille II

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10 Cependant! Limitation importante de la technique!

11 Les contraintes Nécessité de fragmenter le DNA génomique Clonage des fragments en vue de leur amplification Séquençage (souvent partiel) des fragments ou sous-fragments Reconstitution de la séquence d origine

12 Applications l Shotgun sequencing l End sequencing l SNP discovery and resequencing l EST sequencing l Primer walking

13 Le pyroséquençage Technique de séquençage automatique en continu: -Repose sur la détection de l incorporation des nucléotides indépendamment de la taille -La détection nécessite la modification enzymatique d un sous-produit de la réaction d incorporation: le pyrophosphate PPi Hyman ED (1988) Anal. Biochem. 174, A new method of sequencing DNA. Ronaghi M., Uhlen M., Nyren P. (1998) Science 281, A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate

14 DNApol et dt TGCAGACTTAGA-OH 3 ACGTCTGAATCTACGTGATCTGATCAAT5 TGCAGACTTAGAT 3 ACGTCTGAATCTACGTGATCTGATCAAT5 + PPi (P 2 O 7 2- ) APS: Adenosine 5'phophosulfate

15 Cycles successifs de 4 étapes: ajout suucessif de l'une des 4 bases avec dosage de Phosphate Mode Opératoire: 1-Injection du nucléotide. Si incorporation, émission de photons. Puis dégradation de l excès par l Apyrase. 2-Lavage 3-Injection d un nouveau nucléotide..

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18 System Workflow : «One Fragment = One Bead = One Read» Sample Input and fragmentation One Bead = One Read Amplification Library preparation A & B adaptators for Purification, amplification & sequencing Sequencing One Fragment = One Bead Microreactors with amplification reagents Data analysis

19 Intérêts du pyroséquençage: Rapidité 500 Mb par run / 1-16 échantillons (~10000 pb / sec == 100 ABI) Miniaturisation possible Faible coût Limitation de la technique: Environ pb / lecture 1000 bp / lecture en 2012

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22 Applications l Microbial whole genome sequencing l BAC sequencing l Metagenomics l Mutation discovery l mirna discovery l cdna library screening

23 Solexa Sequencing technology

24 Variante de la technique de Sanger basée sur l incorporation reversible de nucléotides fluorescents (CRT: Cyclic Reversible Termination)

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28 -Cycle: (i) Incorporation, (ii) Détection, (iii) Déprotection -Très haute densité des puces (100 millions de molécules par cm2, pb par sec) Solexa 1G Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix Marseille II

29 Obtain more than 20 Gb of data per run High quality 35/100 bp reads generated with high confidence di-base encoding Single molecule clonal amplification of templates avoids cloning bias Ability to run up to 8 samples on separate channels Paired end library approaches Solexa / Illumina Generation II Robust chemistry for accurate base-calling

30 Non-optical sequencing based on Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) Ion sequencing technology mm diameter well - Ion chip - No optical components - An electronic reader board to interface with the chip -A microprocessor for signal processing -A fluidics system to control the flow of reagents over the chip - Routine acquisition of 100-base read lengths (max 200 bases)

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32 A typical 2-h run using an ion chip with 1.2M sensors generates approximately 25 million bases

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34 Applications De Novo Sequencing Targeted Resequencing Whole Genome resequencing Gene Expression profiling Small RNA analysis Whole Transcriptome Analysis Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

35 Stratégies de séquençage des génomes

36 DNA fragmentation (mécanique ou enzymatique) «shotgun» clonage des différents fragments dans un vecteur

37 Constitution d une ou plusieurs librairies de fragments dans différents vecteurs. puc (insert jusqu à 10 Kb) (insert jusqu à 45 Kb) (insert jusqu à 100 Kb) (insert 300 Kb) (insert jusqu à 1 Mb, mais réarrangements fréquents)

38 Automatisation de toutes les étapes Préparation des matrices Réactions de séquence Séparation et détection des fragments Intégration des éléments dans une chaîne de production Analyse informatique Eviter les goulots d étranglement dans le processus Multiplier les éléments en parallèle USINE Permettant le séquençage d ADN à haut débit

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40 GS 20 Pétits et grands Génomes Solexa technology Ion sequencing technology -Etiquettes de séquences -Séquençage de SNP / reference Petits génomes peu complexes Grands génomes Forte complexité Mixage des deux/plusieurs approches

41 Assemblage des génomes Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix Marseille II

42 Projet de séquençage d un génome Séquençage aléatoire Assemblage Annotation Data Release Library construction Assembler Genome scaffold Gene finding Publication Colony picking Combinatorial PCR Homology searches Template preparation Initial role assignments Sequencing reactions Base calling Ordered contig set Gap closure sequence editing Metabolic pathways Gene families Comparative genomics Sequence files Sample tracking Re-assembly ONE ASSEMBLY! Transcriptional/ translational regularory elements Repetitive sequences

43 Assemblage Assembler Genome scaffold - Théorie du contigage - Outils d assemblage Combinatorial PCR Ordered contig set Gap closure sequence editing - Etapes de finition - Difficultés et résolution Re-assembly ONE ASSEMBLY!

44 Procédure ATCGATGCGTAGCAGACTACCGTTACGATGCCTT TAGCTACGCATCGTCTGATGGCAATGCTACGGAA TAGCTACGCATCGT TAGCAGACTACCGTT GTTACGATGCCTT

45 Procédure ATCGATGCGTAGC TAGCAGACTACCGTT GTTACGATGCCTT TGCTACGCATCG CGATGCGTAGCA (sequence inv-compl) CGATGCGTAGCA ATCGATGCGTAGC TAGCAGACTACCGTT GTTACGATGCCTT Régions de chevauchements ATCGATGCGTAGCAGACTACCGTTACGATGCCTT Contig ou Consensus

46 Théorie du contigage

47 La couverture d un contig: un exemple Couverture Contig Reads Pour prévoir une assez bonne couverture de ces contigs lors de l assemblage, il existe une méthode statistique (Lander- Waterman) permettant de determiner le nombre de clones à séquencer, le nombre de contigs prévisibles.

48 E(#ilôts) = Ne -cσ Théorie du contigage (Lander-Waterman statistics) E(taille des ilôts) = L(e cσ 1) / c + 1 σ L = longueur de la lecture T = chevauchement minimum G = Taille du génome N = Nombre de lectures c = couverture (NL / G) σ = 1 T/L contig = ilôts d au moins 2 lectures

49 Chromobacterium violaceum genome project

50 Outils et programmes d Assemblage

51 Le Defi!!!! Image original Pièces du puzzle Reconstruction de l image La mission s apparente à resoudre un puzzle unidimentionnelle avec des centaines de milliers (voire des millions) de pieces et sans l image d origine, bien sur!!!!!!

52 Comment s y prendre? Chromatogramme Programmes d assemblage Sequence complète

53 Sequençage automatique Analyse informatique des images du gel: - lane tracking identifier chaque ligne - trace processing Estimation de l intensité du signal (et bruit de fond) - lane profiling Creation du profile (trace) de chaque chromatogramme - base-calling Transformation des profiles de bases (sequence) Le programme Phred est devenu quasi-standard pour le base calling Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix Marseille II

54 Base calling - Phred Trace idéale consiste en: -pics espacés et non chevauchantes Qualité supérieure Aucune ambiguité Traces généralement obtenues different de l idéal à cause des: -imperfections des réactions de séquençage, de l électrophorèse, ou du trace processing Taux d erreurs varient de 1-17% Extremités de la trace Qualité faible confiance faible

55 Phred quality values q = - 10 log 10 (p) avec: q - quality value p - estimated probability error for a base call Examples: q = 20 means p = 10-2 (1 error in 100 bases) q = 40 means p = 10-4 (1 error in 10,000 bases)

56 Taches effectués par Phred: Phred a. Lire les traces compatible avec la plupart des formats de sequences: SCF (standard), ABI (373/377/3700), ESD (MegaBACE) and LI-COR. b. Base Calling c. Assigne une valeur qualité à chaque base. d. Créer un fichier de séquence et un fichier qualité e. Modifier les chromatogrammes ( vector trimming )

57 Phred BEGIN_SEQUENCE a112e211b.b BEGIN_COMMENT phd2fasta phred Projet.fasta >a112a1.b... ACTGCTCGATGTGTGTG ACTGCTAGCTAGCTAGTC... >a112a2.b ACTGCATGTTCGATCGTAGC... >a112a1.b >a112a2.b Projet.fasta.qual.phd.1 CHROMAT_FILE: a112e211b.b ABI_THUMBPRINT: 0 PHRED_VERSION: c CALL_METHOD: phred QUALITY_LEVELS: 99 TIME: Mon Jan 15 11:27: TRACE_ARRAY_MIN_INDEX: 0 TRACE_ARRAY_MAX_INDEX: TRIM: CHEM: term DYE: big END_COMMENT BEGIN_DNA n 0 5 t 4 24 t 6 35 g 6 44 a 6 71 g 6 92 t t

58 Phred >a112a1.b... ACTGCTCGATGTGTGTG ACTGCTAGCTAGCTAGTC... >a112a2.b ACTGCATGTTCGATCGTAGC... Projet.fasta Crossmatch Séquences de vecteurs >a112a1.b... XXXXXXXXXXXXGTGTG ACTGCTAGCTAGCTAGTC... >a112a2.b ACTGCATGTTCGATCGTAGC... Projet.fasta.screen Projet.fasta.qual Projet.fasta.screen.qual Assemblage

59 Formats et Codification des séquences Nommage des séquences Format des sequences ABI, SCF Les séquences du même clone ont le même prefix L orientation des séquences est matérialisée par g ou b / f ou r Longueur des clones sequencés doit etre définis Taille du clone KT g.SCF KT b.SCF Si séquences provenant des BACs, on effectue également une codification de ces séquences

60 Le système Phred-Phrap-Consed Lire tous les fichiers de séquences (10-100,000) Reverse complemente toutes les séquences (double le # de séquences à aligner) Alignement multiple de ces séquences afin d obtenir une séquence unique

61 Phrap 1) Rechercher les pairs de séquences chevauchantes 2) Construire l alignement multiple 3) Améliorer l alignement multiple

62 1) Rechercher les paires de séquences chevauchantes -Compare chaque séquence (et son reverse-complement) avec chacune des autres séquences -Génère une liste des régions ayant certains critères de similarités de séquences. Paramètres importants: minimum overlap length, stringency (% of bases identiques), and minimum repeat length.

63 Chevauchement entre deux séquences overlap (19 bases) overhang (6 bases) AGCCTAGACCTACAGGATGCGCGGACACGTAGCCAGGAC CAGTACTTGGATGCGCTGACACGTAGCTTATCCGGT overhang % identity = 18/19 % = 94.7% overlap - region of similarity between regions overhang - un-aligned ends of the sequences Formation des paires de séquences chevauchantes basée sur: length of overlap % identity in overlap region maximum overhang size.

64 Phrap 1) Rechercher les paires de séquences chevauchantes Une séquence peut avoir plusieurs régions chevauchantes

65 1) Rechercher les paires de séquences chevauchantes

66 2) Construire l alignement multiple Combinaison des paires de séquences chevauchantes pour construire des grands fragments de séquences

67 2) Construire l alignement multiple Combinaison des paires de séquences chevauchantes pour construire des grands fragments de séquences

68 2) Construire l alignement multiple Combinaison des paires de séquences chevauchantes pour construire des grands fragments de séquences

69 2) Construire l alignement multiple Combinaison des paires de séquences chevauchantes pour construire des grands fragments de séquences

70 2) Construire l alignement multiple Combinaison des paires de séquences chevauchantes pour construire des grands fragments de séquences

71 2) Construire l alignement multiple Combinaison des paires de séquences chevauchantes pour construire des grands fragments de séquences

72 3) Améliorer l alignement multiple Introduction de gaps dans les alignements de séquences si cela doit ameliorer les alignements. Paramètres: gap creation penalty (default 2.0) gap extension penalty (default (0.1)

73 Au final

74 Menus de navigation Consed Séquence du contig Mismatch en rouge Outils de navigation

75 Consed Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix Marseille II

76 Création des Scaffolds (SuperContigs)

77 Contraintes sur les lectures -Les extrémités des lectures doivent avoir une orientation en miroir l un par rapport à l autre -La distance entre deux lectures est connue (avec une certaine erreur expérimentale) clone length F R sequenced ends (pair-ends)

78 Création des scaffolds Ordonner et Orienter les contigs (non-chevauchants) le long du chromosome Assembly Scaffolding

79 Overlaps Linking informations Mate-pair links Similarity links Physical markers reference genome physical map Clone/Bac reads Gene synteny

80 PCR combinatoire A B D C F E G H A B C D E F G H A B C D E F G H A B C D E F G H A B C D E F G H A B C D E F G H A B C D E F G H A B C D E F G H A B C D E F G H B--D C--F E--H

81 Reads base-pairs Assembly Contigs bp Scaffolding Scaffolds bp

82 Finition Fermeture des gaps

83 physical gap Shotgun scaffold A scaffold B Finition sequencing gaps Shotgun Temps Finition FINITION : - Correction des zones de basse qualité - Ordonnancement des contigs - Séquençage des parties manquantes - gap de séquence - gap de clonage (ou physique) - Réorganisation des séquences répétées

84 Problèmes associés à l assemblage Banques Biaisées ===è Assemblage foireux L ensemble des clones des différentes banques utilisées doivent couvrir la presque totalité du génome à séquencer Tailles incorrects des Inserts Faible couverture Orientation inconnue des reads. ACGT or TGCA??? Erreurs de séquençage Séquences repétées

85 Finishing repeats RPT A RPT B clones or PCR walks STEP 1. Isolate repeat copies STEP 2. Assemble in isolation STEP 3. Incorporate assembled repeats into rest of assembly - TIGR Assembler can hold together previously assembled contigs - Other assemblers: use repeat consensus as input to the assembler

86 SASA repeat (4776 AA, 14Kb) from Streptococcus Pneumoniae - likely involved in cell adhesion MTETVEDKVSHSITGLDILKGIVAAGAVISGTVATQTKVFTNESAVLEKTVEKTDALATNDTVVLGTISTSNSASSTSLSASESASTSASESASTSASTSASTSASESASTSASTSISASSTVVGSQTAAAT EATAKKVEEDRKKPASDYVASVTNVNLQSYAKRRKRSVDSIEQLLASIKNAAVFSGNTIVNGAPAINASLNIAKSETKVYTGEGVDSVYRVPIYYKLKVTNDGSKLTFTYTVTYVNPKTNDLGNISSMRPGY SIYNSGTSTQTMLTLGSDLGKPSGVKNYITDKNGRQVLSYNTSTMTTQGSGYTWGNGAQMNGFFAKKGYGLTSSWTVPITGTDTSFTFTPYAARTDRIGINYFNGGGKVVESSTTSQSLSQSKSLSVSASQS ASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASVSASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASGS ASTSTSASASTSASASASTSASASASISASESASTSASESASTSTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSAS VSASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASASAS TSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSAS ASASTSASASASTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASVSASTSASASASTS ASESASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASAS TSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASVSASTSASESASTSAS ASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASAS TSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASVSASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSAS ASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASVSASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASAS TSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASESASTSTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTS ASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASVSASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESAS TSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSAS ESASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTS ASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASVSASTSASASASTSASESASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASES ASTSTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSAS ASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASVSASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASAS TSASASASTSASASASTSASASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASESASTSTSASASTSASESASTSASASAS TSASASASTSASASASTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASVSASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASTSASESASTSASASASTSASASAS TSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASGSASTSTSASASTSASASASTSAS ASASISASESASTSASESASTSTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASVSASTSASASASTSASASASTS ASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASES ASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASTSAS ESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASVSASTSASASASTSASESASTSASASASTSASESAS TSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASTSASESASTSASASASTSASAS ASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASVSASTSASESASTSASASASTSASASASTSASESASTS ASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASAS ASTSASASASTSASVSASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTS ASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASAS ASTSASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASVSASTSAS ESASTSASASASTSASASASTSASESASTSASASASTSASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASAS TSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASVSASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASISASESASTSASASASTSASASASTSAS ASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSASASASTSVSNSANHSNSQVGNTSGSTGKSQKELPNTGTESSIGSV LLGVLAAVTGIGLVAKRRKRDEEE

87 Exemple de pipeline de séquençage/assemblage Consed A B I vector_dir chromat_dir preta phd_dir base calling quality trimming vector trimming.seq,.qual phd2fasta.contig ace2contig arachne2gbrowse Gbrowser.links.reads.ps prearachne runta phrap.xml ta2ace.asm Arachne.bases/.fasta/.contigs repeatfinder gobambus.mates.ace.repeats.stats.details.dot toarachne Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix Marseille II

88 Le problème de la qualité des génomes : deux écoles La séquence d un génome doit être complète et de très haute qualité Approche de type recherche fondamentale C'est la stratégie initialement adoptée pour les microorganismes, y compris la levure. Cependant, dans le cas de régions difficile à séquencer, cette exigence est très coûteuse en temps. Si quelques jours sont suffisants pour avoir un recouvrement de haute qualité de 90-95% d'un génome de procaryote, plusieurs semaines, voire plusieurs mois, seront nécessaires pour obtenir les 5-10% restants. La séquence du génome peut rester incomplète si une majorité des gènes a été trouvée Approche de type recherche appliquée C'est la stratégie adoptée pour les microorganismes par beaucoup d'industriels qui recherchent avant tout de nouvelles molécules. Ces données génomiques ne seront généralement pas publiées. C'est la stratégie également adoptée pour les eucaryotes complexes dans le cas de l'hétérochromatine ou des régions trop répétées et apparemment vides de gènes. à copies dites "de brouillon" (draft genome).

89 Programmes d Assemblage des Séquences Phrap - sequence assembly program (UNIX) Systeme Phred-Phrap-Consed TIGR Assembler - microbial genomes (UNIX) The Staden Package (UNIX) GeneTool/ChromaTool/Sequencher (PC/Mac) Arachne www-genome.wi.mit.edu/wga/ Celera Assembler Paracel Genome Assembler Stroll Amass (Pattern Matching) bio.informatics.indiana.edu/sunkim/amass/ Phusion (SSAHA) Assembler Genome Research 2003 vol 13 p AMI based Assembler (Stochastic process) Bioinformatics 2003 vol 19 p22-29 For Pyrosequencing reads, three tools [de novo assembly (max 400 MBp) ; Resequencing genomes ; Amplicon variant detection with a known reference genome]

90 From Zhang et al. Plos one 2011

91 From Zhang et al. Plos one 2011

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93 Quelques Succès

94 Sequencing Successes T7 bacteriophage completed in ,937 bp, 59 coded proteins Escherichia coli completed in ,639,221 bp, 4293 ORFs Sacchoromyces cerevisae completed in ,069,252 bp, 5800 genes Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix Marseille II

95 Sequencing Successes Caenorhabditis elegans completed in ,078,296 bp, 19,099 genes Drosophila melanogaster completed in ,117,226 bp, 13,601 genes Homo sapiens 1st draft completed in ,160,079,000 bp, 31,780 genes Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix Marseille II

96 Homo sapiens 1st draft completed in ,160,079,000 bp, 31,780 genes Génomique 1 M1 ( ): Assemblage des Génomes Emmanuel Talla, Aix Marseille II

97 The Genome Sequencing Era 18 microbial genomes 40 microbial genomes First eukaryote genome Yeast First higher plant Arabidopsis First fish Fugu mouse 2011 First microbial genome H. influenzae E. coli First multicellular animal C. elegans Fruit fly First mammal Homo sapiens malaria: mosquito and parasite 1538 microbial genomes

98 Génomes terminés 1434 Bactéries 104 Archaea 39 Eucaryotes Génomes en cours 4746 Bactéries 89 Archaea 1078 Eucaryotes Situation en Mai Moins de 20% sont étudiés 5913 Génomes attendus dans le (proche) futur 6180 Bactéries 193 Archaea 1117 Eucaryotes 7490 Avalanche de génomes

99 Tendances Chez les procaryotes 1. la variété dans la répétition : souches différentes appartenant à la même espèce v 23 souches differentes de E. coli v 12 de Staphylococcus aureus v etc espèces différentes appartenant au même genre v 15 Pseudomonas v 6 Chlamydia v 24 Streptococcus v etc Mise en évidence d'une variabilité insoupçonnée

100 Tendances Chez les procaryotes 2. Une plus grande diversité biologique et phylogénétique A. Moins de pathogènes B. Représentants d embranchements peu ou pas étudiés Example : Chlorobium tepidum, bactérie modèle du phylum Chlorobia Intérêts : mieux comprendre C est un thermophile qui fixe l azote atmosphérique et qui réduit des composés soufrés comme source d énergie pour faire de la photosynthèse en conditions anaérobies les grands cycles énergétiques à l échelle planétaire comment est apparue la photosynthèse

101 Tendances C. Plus de bactéries utiles Ø dépollution Ø commensaux Ø intérêt agricole Ø intérêt industriel Shewanella oneidensis, Geobacter metallidurens métabolise l uranium et de nombreux autres métaux lourds Geobacter produit en plus de l'électricité Bifidobacterium longum bactérie intestinale hydrolysant des polymères végétaux Pseudomonas putida croît dans la rhizosphère et dépollue les sols Nombreux organismes thermophiles, source d enzymes faciles à purifier et très efficaces D. Exploration de la diversité... Métagénomes Environnement extrêmes (sources d'eaux chaudes, environnements pollués, profondeurs marines,...) Exploration des communautés microbiennes (estomac humain,...)

102 Tendances Chez les eucaryotes 1. Objectifs primaires Grands organismes modèles et les organismes proches pouvant aider à l annotation de leurs génomes Pathogènes, intérêt médical ou agronomique Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Arabidopsis thaliana Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Oryza sativa Magnaporthe grisea Candida albicans Encephalitozoon cuniculi Microsporidie, pathogène des voies respiratoires Homo sapiens Fugu rubripes Tetrahodon souris, rat chimpanzé Anopheles gambiae (Malaria) Plasmodium falciparum Plasmodium yoelii yoelii

103 Tendances Chez les eucaryotes ENSEMBL (SANGER EBI) Genome database

104 Tendances Chez les eucaryotes ENSEMBL (SANGER EBI) Genome database

105 Tendances Chez les eucaryotes 2. Une ambition incroyable (due à une accélération technologique impressionnante) microsporidies, nématodes, nombreux protozoaires, algues, Chlamydomonas nombreux champignons (100) plusieurs insectes (abeille, bombyx,... ), mollusques, oursin plusieurs poissons, dinde, cheval, mouton, kangourou, etc Chou, café, blé, maïs, sorgho, coton, tomate, pomme de terre, haricot, canne à sucre, etc pins (3), eucalyptus, chêne 3. Challenge: Séquençage de chaque individu... Personal Genome Project (PGP) 10 volontaires au debut du projet, PGP-1K en cours et à terme individus

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107 Web-based resources that document the progress of completely sequenced genomes and their reference publication, including: GOLD Genomes OnLine Database (GOLD) GNN Genome News Network Few scientists are involved in generating data and much more (but not enough) are involved in data analysis