Cinétique Enzymatique

Transcription

1 Cinétique Enzymatique 1 BUT INTRODUCTION PARTIE EXPÉRIMENTALE MODE OPÉRATOIRE GRAPHIQUES Michaelis Menten Lineweaver Burk Plot CALCUL DES ERREURS EXPÉRIMENTALES... 8 Aguilar Augusto Papaine.doc Page 1 sur 8

2 1 But Etude de la cinétique d'un réaction catalysée par une enzyme contenue de manière naturelle dans la papaie: la papaine 2 Introduction Une réaction catalysée par une enzyme E suit le mécanisme réactionnel suivant pour le substrat S : K 1 K2 S + E ES E + P K -1 La vitesse de formation du produit P est donnée par: V 0 =dipi = K 2 lesl dt (A) L'hypothèse de l'état stationnaire pour ES conduit à diesi = 0 et donc dt K 1 lel lsl= ( K -1 K 2 ) IESI (B) En remplaçant B dans A : V 0 = K 1 K 2 IEI lsl = K2 lei lsi (C) K -1 +K 2 K m La constante de Michaelis-Menten vaut : K m = K -1 + K2 et a pour unité : [M] K1 Expérimentalement seule la concentration totale en enzyme peut être Déterminée : le tot l=iei + lesl (D) En introduisant C dans D : l E tot l = l E l (1+ K 1 ISI) = I E I (1+ ISI ) K -1 + K 2 K m Aguilar Augusto Papaine.doc Page 2 sur 8

3 La fraction libre en enzyme IE I vaut donc IE I = IE tot I K m (E) K m +ISI La substitution de E dans C mène à l'équation: V 0 = d lpl = K 2 l E tot l ISI (A) Dt K m +ISI -La vitesse de formation du produit est proportionnelle à la concentration de l'enzyme mais elle dépend de la concentration en substrat de façon plus complexe. -Si K m << I S I, V 0 = K 2 IE tot I = V max La vitesse est d'ordre zéro en substrat et ne dépend plus de sa concentration. Elle correspond à la vitesse maximale de la réaction enzymatique => Ce qui donne l'équation de Michaelis-Menten : V 0 =V max I S I K m +ISI La représentation «Lineweaver-Burk plot»obtenue à partir de l'inverse de l'équation précédente correspond à une linéarisation de la relation entre K m et V max. 1 =1/ ( V max I S I ) = K m V 0 K m +ISI V max ISI V max Aguilar Augusto Papaine.doc Page 3 sur 8

4 A propos de la papaine C'est une protéase, une enzyme qui peut casser une liaison peptidique par hydrolyse. Elle se trouve dans la papaye et est utilisée dans nombreuses applications. (industrie de la bière, nettoyage des lentilles de contact) 3 Partie expérimentale Le substrat est la Nα-benzyl-arginine-p-nitroanilide (), une arginine synthétique qui est une molécule plus simple qu'une protéine. Son hydrolyse va casser sa liaison amide et générer un produit de couleur jaune intense : la p- nitroaniline. Puisque le substrat et le deuxième produit sont incolores, l'évolution de la réaction peut être étudiée grâce à l'absorption optique de la p-nitroaniline en fonction du temps. 4 Mode opératoire 5 solutions de concentrations différentes en sont réalisées afin de réaliser un «Lineweaver-Burk plot». Ici la relation C 1 V 1 = C 2 V 2 est utilisée. C 1 = 0.02M et V 2 = 5 [ml] Solution n 5 [mi] (V 2 ) de V 1 en [ml] de solution mère 0.02[M] C 2 en [M] L appareil est calibré avec un blanc contenant 2.5 [ml] de solution d enzyme tamponné à ph 6 qui permet de régler le zéro de l'absorbance à 400[nm]. La cuvette suivante contient comme le blanc plus 0.5 [ml] de solution n 1 qui sont ajoutés juste avant d'utiliser le spectromètre puisque la réaction commence dès la présence de substrat. L'absorption à 400[nm] est suivie pendant 5 minutes. Le contenu des éprouvettes est au préalable bien mélangé en les couvrant avec un parafilm de manière a obtenir un mélange homogène. L'expérience est répétée pour les solutions 2,3,4,5 ainsi que pour la solution mère de 0.02[M]. Aguilar Augusto Papaine.doc Page 4 sur 8

5 Résultats -Le ph de la solution de l'enzyme est égal à 6. -La température du laboratoire est de 22 C. -Le coefficient d'extinction molaire de la p-nitroaniline à 400[nm] est trouvé égale à Solution n Conc. initiale M Conc. cuvette M 1/Conc. cuvette M -1 Pente [A/min] V 0 [M/min] 1/V 0 [min/m] 1/Conc. cuvette M E E E E E E E E E E E E E E E Mère E E E I I cuvette =V pris = 0.25 l I initiale V total exemple de calcul II cuvette pour la solution 1 : II cuvette = 0.5[ml] 0.0 M = M 3[ml] Pour chaque mesure de l'absorption en fonction du temps, la détermination de la pente permet de trouver la vitesse initiale V 0 selon : pente da => V 0 = da 1 = pente dt dt εi εi A= ε I c l= 1 cm ε= 10 4 AM -1 cm -1 exemple de calcul pour la solution 1 : V 0 = [Amin -1 ] / (10 4 [AM -1 cm -1 ] 1[cm]) = [M/min] Aguilar Augusto Papaine.doc Page 5 sur 8

6 4.1 Graphiques Michaelis Menten Le graphique ci-dessous exprime la vitesse de réaction V 0 en fonction de la concentration de substrat. Cinétique de Michaelis Menten 8.00E E E E-06 y = x x - 3E-07 R 2 = Série1 Polynomial (Série1) V0 4.00E E E E E E E E- 1.90E- 2.40E- []cuvette 2.90E- 3.40E- On devrait observer une forme plus marquée de 2 ème degré ce qui n est pas le cas dans ces concentrations. Aguilar Augusto Papaine.doc Page 6 sur 8

7 L'équation du graphe ci-dessous est : 1 = K m V 0 V max II cuvette V max Les points qui coupent les axes permettent de trouver les constantes de Michaelis-Menten : Lineweaver Burk Plot Lineweaver Burk Plot 2000 y = 0.002x R 2 = Série1 Linéaire (Série1) 1/Vo E+00 2.E+05 4.E+05 6.E+05 8.E+05 1.E+06 1.E+06 1/[] y = 0.002x =0 x= /K m = K m = /V max = V max = Aguilar Augusto Papaine.doc Page 7 sur 8

8 5 Calcul des erreurs expérimentales L'erreur sur les concentrations dans les cuvettes provient de l'erreur commise sur la préparation des solutions initiales qui se calcule selon I I initiale = C mère V i V f => II initiale = C mère V i + V i C mère + C mère V i ( V f = V i + V rajouté ) V f V f V f 2 ou en sachant que Ln II initiale = Ln C mère + LnV i - LnV f % d' erreur = II initiale = C mère + V i + V i + V rajouté II initiale C mère V i V f Ces deux démarches mathématiques donnent les mêmes valeurs pour II Tableau des résultats selon calcul ci-dessus : Solution n C initial "+/-" V i V i V rajouté V rajouté en M en M [ml] [ml] [ml] [ml] d erreur E % E % E % E % E % Calcul d erreur sur 1/[] : A = S/S 2 A = 9.8 * 10-5 /(0.0) 2 = 10.9 % Conc. cuvette M "+/-" M S S 2 S/S E E E E E E E E E- 1.28E E E E- 1.52E E E E E E Aguilar Augusto Papaine.doc Page 8 sur 8