Techniques de purification d une population cellulaire à usage thérapeutique

Transcription

1 Techniques de purification d une population cellulaire à usage thérapeutique (Isolation, Séparation, Sélection) Le 25 Novembre 2015

2 Phénotype: notion de CD - Classes de différenciation (cluster of differentiation): L ensemble des antigènes membranaires de cellules. - Fonction: - Molécules d adhérence (CD49, 54, 56, 58, 61, 62) - L antenne; capteur de message provenant de l environnement (récepteur) (CD25/CD122 IL-2; CD126 IL-6) - Le transducteur qui délivre des message à la cellule (CD132 IL-2; CD130 IL-6)

3 Révélation de CDs exprimées sur les cellules Marquage (Lavage) Analyse SSC FL (PE) FSC SSC

4 cytométrie

5 Image d un marquage sur les cellules sanguines en cytométrie en flux SSC FSC SSC

6 CD exprimées sur les cellules sanguines Type de cellules CD Cellules souches CD34; CD117; CD133 Cellules myéloïde Neutrophiles CD10; CD15; CD32 Monocyte CD13; CD14; CD64 Mégacaryocyte (Plaquette) CD41; CD61 Erythrocyte Glycoporine A Lymphocyte T CD2; CD3; CD4; CD8 B CD19; CD20; CD138 Cellules NK CD16; CD56; CD161

7 Sélection (Isolation, Séparation, Purification) Classification 1. Par objectif: - Sélection positive - Sélection négative 2. Par méthode: - Physique (centrifugation) - Immunologique (billes magnétiques; Paramètres d évaluation - Pureté - Rendement - Viabilité Tri par cytométrie en flux) - Biologique (adhésion; clonage; pharmaceutique)

8 L objectif de sélection: Sélection positive Sélection négative Cellule tumorale Cellules intéressantes Autres cellules Cellules intéressantes

9 Méthode de sélection

10 Méthode physique: - Centrifugation - Buffy-coat (Cobe Spectra) - Ficoll - Elutriation

11 Taille et densité des cellules sanguines Taille (µm) Densité (la masse volumique) Globules rouges 7 ( ) ( ) Vitesse de sédimentation Eosinophiles 12 (12-15) ( ) Neutrophiles 12 (12-15) ( ) Basophiles 9.5 (9-10) ( ) Monocytes 15 (15-20) ( ) Lymphocytes 9 (8-10) ( ) Plaquettes

12 Centrifugation - Le comportement d une particule dans un champ centrifuge peut être exprimé par l équation suivant: Fa = vol p * ρi * g Poussée d Archimède Force Centrifuge Fc = vol p * ρp * n * g Fnette = n. g. vol p. (ρp - ρi ) Vitesse de sédimentation Fnette Vol: volume (taille) d une particule ρp: densité de particule ρi: densité de milieu g: pesanteur n * g: accélération centrifuge [ n = 11,18 * r * (tpm / 100) ² ] ρp > ρi : V > 0 ρp = ρi : V = 0 ρp < ρi : V < 0

13 Taille et densité des cellules sanguines Taille (µm) Densité (la masse volumique) Globules rouges 7 ( ) ( ) Vitesse de sédimentation Eosinophiles 12 (12-15) ( ) Neutrophiles 12 (12-15) ( ) Basophiles 9.5 (9-10) ( ) Monocytes 15 (15-20) ( ) Lymphocytes 9 (8-10) ( ) Plaquettes

14 Buffy-Coat Centrifugation Centrifugation Buffy-coat Neutr; Mono; Lymph Globules rouges

15 MINIATURISATION: Congélation d une unité de Sang Placentaires Buffy Coat Globules rouges

16 COBE Spectra

17 Sortie hématies Sortie plasma Entrée du sang Sortie CMN

18 Spectra Optia Apheresis System Terumo-BCT

19 Ficoll Centrifugation Fnette = n. g. vol p ( ρp - ρi ) Milieu (PBS, ρi = 1.0) ρp > ρi; V > 0 ( pour toutes les cellules) ρp < ρi; V = 0 Milieu de séparation (ρi = 1.077) ( pour les cellules mononucléées) ρp > ρi; V > 0 ( pour les neutrophiles et GR)

20 Ficoll Sang Plasma Cellules mononucléées Milieu de séparation ρ = 1,077 GR

21 Elutriation

22

23 Centre de rotation Force de Flux Force Centrifuge La vitesse de pompe pour faire sortir une population cellulaire d: diamètre de cellule tour / min > C * d² *( 1000 ) C: coefficient constant (en fonction de type de la chambre de séparation) 2 Plaquette GR Lym Neutro Mono

24

25

26 Méthode Immunologique - Billes magnétiques (Dynal; Miltenyi) - Tri par cytométrie en flux

27 Billes Dynal (4,5 µm) Aimant Aimant Aimant Enzyme ou Peptide

28 Billes Miltenyi (50 nm) Bille

29

30 Internalisation (Pinocytose)

31 Sélection d une cellule productrice de cytokine

32 Méthode Immunologique: - Billes magnétiques (Dynal; Miltenyi) - Tri par cytométrie en flux

33 Cytomètre trieur Beckman-Coulter: MoFlo Astrios Vitèsse tri: 70,000 cellules / seconde 7 lasers, 6 voies

34 Méthode Biologique: - Adhésion - Clonage (dilution limite) - Pharmaceutique

35 Adhésion sur boite plastique Incubation 1h, à 37 C Déchets (cellules non adhérentes) Cellules adhérentes

36 Méthode Biologique: - Adhésion - Clonage (dilution limite) - Pharmaceutique

37 Amplification du clone Caractériser les clones

38 Méthode Biologique: - Adhésion - Clonage (dilution limite) - Sélection pharmaceutique

39 Sélection des cellules transtectées Promoteur Gène inséré Cellule non transfectée Cellule transfectée Gène de résistance à la Gentamycine Milieu de sélection (G418)

40 Médicaments de Thérapie Innovante (MTI) et PTC