Le monde complexe et mouvant des ARN. Troisième partie

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1 Le monde complexe et mouvant des ARN. Troisième partie J. Lamoril a,*, P. Bouizegarène b, M. Bogard c alaboratoire de génétique moléculaire, hôpital Bichat, Paris, France blaboratoire de biochimie et génétique moléculaire, hôpital Louis-Mourier, 178, Colombes, France claboratoire de biochimie et biologie moléculaire, centre hospitalier d Argenteuil, Argenteuil, France RÉSUMÉ Après avoir exploré dans les deux premières parties de cette série d articles, les ARNm, les ARNt, les ARNr, les petits ARNs et les microarns, cette troisième partie est consacrée à une autre série d ARNs intérférents, les piarns et les endo-siarns et à des ARNs encore mal connus, les lncarns. Le séquenc age de nouvelle génération (encore appelé séquenc age haut débit) a permis d en découvrir un certain nombre. Des études pointues continuent de les analyser mais la complexité du génome ainsi que la difficulté d identification de ces ARNs particuliers expliquent le faible nombre d études s y consacrant. Cet article souligne la complexité du métabolisme normal et pathologique de ces ARNs et démontre l implication majeure de ces derniers dans le maintien d un métabolisme cellulaire normal par une régulation fine et précise et dont le déséquilibre peut aboutir à de nombreuses pathologies. Nous assistons à une révolution biologique rendant obsolète le dogme enseigné jusqu au début des années 2000 qui affirmait que tout gène était codant (après sa transformation en ARNm [transcription], ce dernier était traduit en protéine). Les nouvelles technologies ont démontré l abondance des gènes non codants et le rôle fondamental joué par ceux-ci dans les métabolismes cellulaires normaux et pathologiques. Mots-Clés: PIWI; PiARN; Endo-siARN; LncARN; Tudor RIASSUNTO Il mondo complesso ed in evoluzione degli acidi ribonucleici (ARN): terza parte. Nelle prime due parti di questa serie di articoli sono stati descritti gli RNA messaggeri (mrna), gli RNA di trasporto (trna), gli RNA ribosomiali (rrna), i piccoli RNA (small RNAs) ed i micro RNA interferenti (interfering micro RNAS). Questa ultima parte è dedicata ad altri RNA interferenti: gli RNA interagenti con le proteine PIWI (PIWI interacting ARNs o piarns) e i piccoli RNA interferenti endogeni (endogenous small interfering ARN o endo-siarns) ed alcuni RNA ancora poco conosciuti: i lunghi RNA non codificanti (long non-coding RNA o lncarns). Il rilascio del sequenziamento completo del genoma ha reso disponibili una enorme quantità di informazioni riguardo queste sequenze di geni non codificanti e di particolari RNA cui, tuttavia, a causa della loro complessità e della loro difficoltà di identificazione sono stati dedicati ancora pochi studi. Questo articolo sottolinea il loro importante coinvolgimento nel mantenimento di un normale metabolismo cellulare con una regolazione fine e precisa e le conseguenze delle loro alterazioni nella fisiopatologia cellulare con la comparsa di numerose patologie. Grazie alle nuove generazioni di sequenziamenti stiamo assistendo ad una rivoluzione nel mondo della biologia. Viene oggi considerato obsoleto il dogma valido sino agli inizi degli anni 2000 secondo il quale ogni gene fosse codificante (ciascun gene dopo la sua trasformazione in un RNA trascrizione viene tradotto in una proteina). Le nuove tecnologie hanno dimostrato l abbondanza di geni non codificanti ed il loro ruolo fondamentale nei metabolismi cellulari normali e patologici. Parole chiave: PIWI; PiARN; Endo-SiARN; LncARN; Tudor ABSTRACT The RNA world, a complex and moving world. Third and last part. In the first two parts of this series, we have described mrna, trna, rrna, small RNAs and the interfering micrornas. This last part is dedicated to other interfering RNAs, pirnas and endo-sirnas and unfamiliar RNAs, lncrnas. Whole genome sequencing released a huge amount of information among which sequences of noncoding genes and special RNAs. However, due to its complexity, few studies are dedicated to these RNAs. This article underlines their important implication in the maintenance of a normal cellular metabolism and the consequences of their imbalance in cell physiopathology. Thanks to next generation sequencing, we are witnessing a revolution in the world of biology. The valid dogma until years 2000 which asserted that every gene was coding (a gene was transcribed in a mrna then translated in a protein) is now outmoded. The new technologies have brought to light the abundance of non-coding genes and the important place they take in the normal and pathological cellular metabolisms. Key words: PIWI; PiARN; Endo-siARN; LncARN; Tudor Riprodotto da Immunoanal Biol Spéc 2011;26: con l autorizzazione del direttore scientifico della rivista, Dott. M. Bogard 320 LigandAssay 17 (3) 2012

2 chez la drosophile. Parmi ces derniers, de petits ARNs interférents d environ 24 pb associés à des séquences répétées furent isolés et dénommés repeated-associated small interfering RNAs (rasirnas). Ils furent observés dans des régions du génome où se situaient des séquences répétées et des séquences de transposons 1. D autres études ont alors montré que ces ARNs de pb étaient abondamment présents dans les testicules chez les mammifères. De la même manière que pour les rasirnas, ces ARNs co-précipitaient avec des protéines appelées P-element induced wimpy testis (Piwi) (Tableau 1). Ils furent alors baptisés piarns (Tableau 2). Ces derniers semblent jouer un rôle important dans le développement de la lignée germinale et la maintenance de l intégrité du génome. En effet, les protéines PIWI appartiennent à la famille des protéines Argonautes (constituée des protéines AGO et PIWI) et contrairement aux autres membres de la famille AGO, sont exprimées essentiellement dans les cellules de la lignée germinale 2. Ainsi, les mutants PIWI chez la souris présentent des défauts de gamétogenèse mais se développent normalement 3. Les protéines PIWI possèdent deux domaines, un domaine PAZ se fixant sur la partie 3 des petits ARNs et un domaine PIWI de structure proche des RNases H qui peut couper une cible ARN complémentaire de l ARN guide auquel est fixé le domaine. Ainsi, bien que des miarns et des siarns soient aussi présents dans les cellules de la lignée germinale, les piarns y prédominent. Ces derniers ont été particulièrement étudiés chez la drosophile, le poisson, les nématodes (essentiellement chez Caenorhabditis elegans où ils sont appelés ARNs 21U) et la souris. Selon leur origine, les piarns peuvent être schématiquement groupés en deux classes: la classe I: les piarns sont ordonnés en groupes (clusters) possédant une uridine (U) en 5, des précurseurs dont la taille varie de 1 à 100 kb et pouvant donner une grande variété de piarns. On les retrouve surtout dans les spermatocytes et les spermatides lorsque la lignée germinale progresse au stade pachytène de la méïose; la classe II: ces piarns se retrouvent dans différentes localisations génomiques. En effet, ils sont complémentaires essentiellement de séquences répétées de transposons (et de rétrotransposons). Pour mémoire, les transposons sont des fragments d ADN mobiles s intégrant dans le génome par un phénomène comda Immuno-analyse & Biologie spécialisée INTRODUCTION Le séquenc age haut débit a révolutionné notre vision du génome et a permis en particulier d identifier de nombreuses régions contenant des gènes formant des ARNs non traduits en protéines (appelés aussi gènes non codants). L analyse évolutive de ces ARNs particuliers tant par leur nature que par leur fonction démontre la complexité de notre génome. Cette troisième et dernière partie d une série de trois articles dédiés au monde complexe et mouvant des ARNs, est consacrée à des ARNs moins connus et encore insuffisamment explorés de cet univers étonnant et toujours peu compris de notre génome. Ce dernier parcours permettra au lecteur d appréhender un peu plus la révolution biologique à laquelle nous assistons. Nous nous consacrerons donc dans cette dernière partie aux piarns, aux siarns endogènes et aux lncarns. LA RÉPRESSION DES ARN (RNA SILENCING) La notion de répression par les ARNs, ce que les Anglo-Saxons appellent de manière générale le RNA silencing, se définit par la répression de l expression de gènes par des complexes associant essentiellement de petits ARNs de nucléotides et un complexe protéique contenant notamment des protéines de la famille Argonaute (AGO). Elle constitue un mécanisme général dénommé répression des ARNs. Ce mécanisme est impliqué dans de nombreux métabolismes cellulaires fondamentaux et physiopathologiques. Trois grandes classes constituent les petits ARNs répressifs (silencing) à savoir les microarns (miarns), les petits ARNs interférents (sirnas, small interfering RNAs) et les ARN interagissant avec les PIWI (piarns, PIWI interacting RNAs). De ces trois classes de petits ARNs, les piarns sont les moins étudiés et les plus mal connus. LES ARN INTERAGISSANT AVEC LES PROTÉINES PIWI (PIRNA) Qu est-ce qu un piarn? En étudiant de petits ARNs dont l action semblait différente de celle des microarn et des siarn, des chercheurs identifièrent de petits ARNs de nucléotides Tableau 1 Protéines PIWI [7]. Levure (Schizosaccharomyces pombe) Plante (Arabidopsis thaliana) Nématode (Caenorhabditis elegans) Mouche (Drosophila melanogaster) Souris Être humain Argonautes sous-famille PIWI Aucune Aucune ERGO-1 PRG-1 PRG-2 AGO3 PIWI AUB MILI (PIWIL2) MIWI (PIWIL1) MIWI2 (PIWIL4) HILI (PIWIL2) HIWI (PIWIL1) HIWI2 (PIWIL4) PIWIL3 (HIWIL3) PIWI : P-element induced wimpy testis ; AGO : Argonaute ; AUB : Aubergine ; ERGO : Endogenous-RNAi deficient argonaute ; PRG : Piwi (fruitfly) related gene ; MILI : mouse PIWI ; PIWIL : PIWI-like homolog (PIWIL1, omim ; PIWIL2, omim ; PIWIL3, omim ; PIWIL4, omim ). LigandAssay 17 (3)

3 Tableau 2 Caractéristiques des piarns (PIWI interacting ARNs). ARN de pb Absence de précurseur ARN double brin Ne nécessite pas la protéine Dicer pour sa production Associé aux protéines PIWI plexe de «copier/coller». Ils peuvent s intégrer n importe où dans le génome. La différence principale entre un transposon et un rétrotransposon est la présence d un intérmédiaire ARN dans le cas du rétrotransposon assurant sa mobilité intra/intergénomique. Parmi ces transposons, on retrouve des éléments long intersped nuclear elements (LINEs) et des short intersped nuclear elements (SINEs). Leur insertion aléatoire dans le génome peut être responsable de pathologies (formant des mutations par réarrangement génique). Dans cette classe II, certains piarns possèdent une uridine (U) en 5 (et sont antisens des séquences transposons) alors que d autres présentent une adénine (A) en position 10 et sont orientés sens comme les messagers transposons. Étonnamment, les piarns de classe II peuvent s apparier entre eux sur les dix premiers nucléotides de telle sorte que le U du piarn antisens puisse s apparier au A du piarn sens (pour rappel, les bases U s apparient aux bases A par deux liaisons hydrogène). Les piarns sont de petits ARNs légèrement plus longs que les siarns endogènes. Par exemple, chez la drosophile, les piarns mesurent de 24 à 30 pb et les endosiarns de 20 à 23 pb. Par ailleurs, contrairement aux miarns, l extrémité 3 des piarns contient un groupe 2 - O-méthyl dont le rôle est de stabiliser ces petits ARNs (sauf chez les plantes où cette méthylation n existe pas) 4. Les piarns sont dérivés essentiellement de séquences répétitives intergéniques incluant les transposons. Comme il a été décrit ci-dessus, les loci dans lesquels se trouve l ADN codant pour les piarns sont appelés des régions (clusters) piarns 5. Comme cela a déjà été mentionné, du fait de leur expression dominante dans les cellules de la lignée germinale et leur association particulière avec les protéines PIWI, il s agit d une classe particulière de petits ARNs. Leur biogenèse ne fait pas appel à la protéine DICER contrairement à celle des miarns et des siarns et ne se fait pas à partir de précurseurs ARN double brin. La synthèse des piarns est encore mal connue (Fig. 1). Selon les espèces, les piarns sont dérivés soit du brin sens, soit du brin antisens des transposons ou des rétrotransposons sur lesquels ils agissent. Cette synthèse se fait en partie par un mécanisme d amplification en boucle grâce à l activité de coupure des protéines PIWI à la dixième position en 5 du piarn ou moins fréquemment ailleurs en 5 du piarn. Ces propriétés ont amené à émettre l hypothèse que les piarns sont synthétisés par une boucle d auto-amplification (Fig. 1). Un piarn (sens) associé à une protéine PIWI clive le long transcrit antisens du transposon puis guide la formation de la partie 5 du brin antisens du piarn fixé à la protéine PIWI (et inversement). Dans ce mécanisme encore mal connu et qui concernerait uniquement les piarns de classe II (appelé aussi cycle ping-pong), le transposon est donc à la fois la source des piarns et sa cible (pour sa répression). Lorsque la partie coupée du transposon est obtenue, elle vient se charger d une protéine PIWI. Une activité nucléasique (mal connue à ce jour) permet alors de générer l extrémité 3 du piarn. Cette extrémité 3 semble donc être synthétisée à l aide d une protéine PIWI qui posséderait une empreinte de celle-ci. Ensuite, une 3 O-méthylation est effectuée sur le piarn. Ce mécanisme complexe est observé dans différentes espèces y compris chez les mammifères où il est observé au stade pachytène de la méïose au cours de la spermatogenèse 6. Il semblerait néanmoins que d autres mécanismes de synthèse des piarn existent notamment pour les piarn maternels (dans l ovocyte) 7. Ainsi, chez la souris, des trois protéines PIWI connues, MILI et MIWI2 fonctionnent par ce mécanisme d amplification ping-pong. Globalement, les détails précis pour la synthèse de piarns sont complexes et encore mal connus 3. Chez la souris, les trois protéines PIWI à savoir MILI, MIWI et MIWI2 sont toutes exprimées dans la lignée germinale mâle alors que chez la femelle, seule MILI semble exprimée. Dans les premiers stages de la spermatogenèse, MILI, MIWI2 et des piarn classe II sont exprimées et cela au cours de la mitose de la spermatogonie primaire. Lorsque les spermatocytes entrent en méïose pour devenir des spermatides, ils expriment aussi MIWI et des piarns de classe I, ces derniers étant abondamment exprimés dans le testicule. Sans rentrer plus en détail dans la complexité des piarns, tant chez la mouche que chez la souris ou le nématode, de nouvelles classes de piarns ont été différenciées. Ces piarns s expriment différemment selon les espèces dans la lignée mâle et femelle. Récemment, il a pu être démontré qu un certain nombre de piarns de classe I pouvaient aussi dérivés d ARNm et se localiseraient au niveau de régions 3 non codantes d ARNm, ce qui accroît encore le niveau de complexité de la régulation des gènes de la lignée germinale 8. IDENTIFICATION INFORMATIQUE DES PIARNS ET LOCALISATION GÉNOMIQUE À ce jour, il n existe pas de moyen simple d identifier dans le génome un piarn, aucun motif spécifique n ayant été détecté dans les séquences de ces derniers. La seule particularité observée est la présence prépondérante en position 1 d une uridine (U1) dont la raison n est d ailleurs pas identifiée. Par ailleurs, les piarns sont souvent localisées en groupe (clusters) dans certaines régions du génome (classe I), on parle de groupes de piarns dont la taille varie de plusieurs kilobases (kb) jusqu à 200 kb. Contrairement à ce qu on observe pour les siarns, les clusters de piarns peuvent se chevaucher entre eux. Par ailleurs, aucune structure secondaire remarquable (comme par exemple des séquences en boucle, stemloop, pour les précurseurs miarns) n a été observée. Enfin, ces clusters peuvent être trouvés sur le brin sens ou le brin antisens du génome, suggérant ainsi une transcription bidirectionnelle dans certains cas comme cela a pu être observé parfois chez la souris ou la drosophile. Par ailleurs, l analyse des piarns chez la drosophile a permis 322 LigandAssay 17 (3) 2012

4 Figure 1 Biosynthèse des piarns [6]. A. Chez la drosophile, le transcrit primaire (antisens) est synthétisé à partir d un transposon et/ou d un groupe (cluster) piarn par un mécanisme inconnu à ce jour. Ils sont ensuite associés à des protéines PIWI ou Aubergine (AUB). Les piarns issus du locus flamingo (flam) sont exclusivement associés à des PIWI car ce locus est actif uniquement dans le corps cellulaire de l ovaire (SOMA) où seuls les PIWI sont exprimés. Les complexes de répression induits par les PIWI, piriscs (PIWIinduced silencing complexes) produits grâce à cette voie métabolique agissent comme déclencheur de la boucle d amplification. B. Le mécanisme d amplification (appelé aussi cycle ping-pong) fait intervenir semble-t-il l activité RNase H (slicer) des protéines AUB et AGO3 (Argonaute 3) mais non les protéines PIWI. La protéine AUB associée au piarn antisens clive le précurseur piarn en sens. Cette activité détermine et permet la formation de l extrémité 5 du piarn, antisens du piarn initialement associé à AUB. L extrémité 3 du piarn est formée à l aide d une nucléase non identifiée, suivie d une méthylation 2 O en présence de HEN1. Le piarn provoquant cette amplification peut aussi venir de la mère. C. Au cours du cycle ping-pong durant la spermatogonie chez la souris, les piarns primaires sont synthétisés à partir de transcrits transposons (TE) et de transcrits issus de clusters. Ils sont alors associés à des protéines MILI2 (appelées aussi PIWI-like protein 2) présentes dans des granules intracytoplasmiques appelés corps pi. Ces piarns sens associés aux protéines MILI clivent les transcrits antisens générant alors des piarns secondaires qui s associent LigandAssay 17 (3)

5 de remarquer que, malgré la préservation de la localisation des clusters de piarns, leurs séquences évoluaient rapidement. Or, on estime qu environ 90 % des clusters de piarns sont complémentaires de séquences de transposons. La question qui se pose est de savoir si la séquence de ces groupes de piarns est modifiée régulièrement par intégration aléatoire de transposons ou si un mécanisme actif cible ces loci piarns 6. Les piarns peuvent aussi être générés à partir d ARNms issus de transposons actifs ou de gènes codant pour des protéines. Ainsi, chez la drosophile, au locus tj (trafic jam) où se trouvent de nombreux gènes codant, la plupart des piarns sont issus de la région 3 non codante (3 NC) 8. Néanmoins et plus généralement, un faible nombre de piarns est issu de régions 3 NC. Pour ces derniers, leur fonction est d ailleurs mal connue à ce jour. Il semble peu probable qu ils régulent l expression des gènes hôtes et n ont d ailleurs en général aucune séquence parfaitement complémentaire d une cible sauf dans certains cas comme au locus tj évoqué cidessus où la séquence est partiellement complémentaire et où ils modulent l expression de gènes 9. Ainsi, cette diversité de séquence, de localisation et de fonction ainsi que l évolutivité de ces ARNs n a pas permis jusqu à maintenant de définir un modèle informatique d identification des piarns dans le génome. Le contrôle spatial de la biosynthèse des piarns Les protéines PIWI sont localisées soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau de la cellule. Dans le cytoplasme chez la drosophile, les protéines PIWI avec d autres complexes protéiques (dont des protéines TUDOR) sont regroupées dans des formations aux contours flous et appelés nuages, structures périnucléaires denses, sans membranes, dans les cellules germinales. Dans celles-ci, une importante activité de transcription semble avoir lieu. Ces nuages pourraient être un site de biogenèse des piarns et/ou de destruction des piarns 6. Ces structures paraissent suffisantes pour induire la formation des cellules germinales primordiales chez l embryon en développement. Chez la souris, lors du développement des testicules, on retrouve des granules de structure proche des nuages observés chez la drosophile. On les appelle des corps chromatoïdes (CBs, chromatoïd bodies) ou ciment intermitochondrial (intermitochondrial cement) selon le stade de la spermatogenèse. Ces larges granules présents dans les spermatides haploïdes contiennent notamment les protéines MILI, MIWI et de nombreuses protéines possédant un domaine TUDOR. Il semblerait que ces CBs soient les lieux où les piarns du stade pachytène (en association avec les protéines MIWI et MILI) assurent leur fonction. Certaines protéines comme les MIWI2 et les MILI se retrouvent dans des granules spécifiques (en association avec d autres protéines). Les granules MIWI2 possèdent d ailleurs tous les composants des corps P (P-bodies, processing bodies), granules cytoplasmiques servant de réserve d ARNm et participant à leur dégradation dans les cellules somatiques. Pour cette raison, les MIWI2 ont été nommés corps pip (pip-bodies). Les MILI (et non les MIWI2 et les MIWI) sont exprimées dans la lignée germinale féminine où on les retrouve dans des granules cytoplasmiques des oocytes appelées aussi pib (pi-bodies). Il existe une inter-relation étroite entre les pip et pib. Il semblerait que certaines étapes clés de la biosynthèse des piarn se joue au niveau de ces corps particuliers encore mal connus. Les études ont montré que leur structure jouait un rôle majeur dans l inhibition de l expression des transposons 6. Chez la drosophile, la synthèse des piarns primaires et la répression des transposons prend place dans les cellules somatiques ovariennes. Or, dans ces cellules, les nuages précédemment évoqués n existent pas. Mais, comme dans les cellules germinales, la synthèse des piarns est associée à des granules particulières appelées corps Yb (dans lesquels se trouve la protéine PIWI), corps différents des corps P, le principal composant des corps Yb étant une protéine dénommée FS(1)YB. Les précurseurs piarn sont internalisés dans ces corps Yb et transformés en piarns matures en présence notamment de FS(1)YB. Des études complexes semblent indiquer que ces corps sont le lieu où est vérifiée la fonction RISC du complexe piarn/piwi avant la pénétration dans le noyau 6. Les protéines PIWI et le domaine Tudor Le domaine protéique Tudor est un motif se fixant symétriquement sur des arginines diméthylées (domaine sdma, symmetrically dimethylated arginines). Les protéines possédant des domaines Tudor ont un rôle majeur dans la gamétogenèse 6,10. Ces domaines DMA ont été retrouvés sur des protéines MILI, MIWI, AUB, AGO3 et PIWI 11. L interaction des protéines TUDOR et de protéines PIWI semble jouer un rôle majeur dans la localisation des complexes PIWI/piARNs au niveau des oocytes et des cellules spermatiques sans que leur rôle précis ne soit encore élucidé. Chez la souris et la mouche, l absence d expression de gènes Tudor aboutit à une réduction de la synthèse de piarns et une diminution de la stabilité des protéines PIWI. Par ailleurs, les protéines TUDOR jouent aussi un rôle important dans le cycle ping-pong en interaction avec d autres complexes protéiques. Il existe donc une interaction complexe entre les protéines PIWI et TUDOR. Cependant, les protéines ayant un domaine TUDOR restent encore à explorer 6. Fonction des piarns Développement de la lignée germinale Les piarns jouent un rôle important dans le dévelop- à des protéines MIWI2 (appelées aussi PIWI-like protein 4). MIWI à son tour clive les transcrits sens et génère de nouveau transcrits piarn sens qui s associent alors aux protéines MILI. La protéine MIWI2 est localisée dans des corps cellulaires intracytoplasmiques qui contiennent aussi des composants des corps P. Ils sont alors appelés des corps pip. La protéine MIWI2 et ses partenaires passent ensuite dans le noyau de la cellule où ils participent à la méthylation de novo de séquences transposons (TE). 3 OMe: méthylation 2 O des extrémités 3 des piarns. 324 LigandAssay 17 (3) 2012

6 pement de la lignée germinale. Chez la drosophile et la souris, l absence d expression des protéines PIWI aboutit à une dérepression des transposons et à des anomalies de la gamétogenèse 12. De nombreuses études ont été faites sur les piarns notamment chez la mouche Drosophila melanogaster. Chez l être humain, il est difficile de savoir si le rôle des piarns est similaire ou non bien qu il y ait de forts arguments pour penser que c est le cas, les piarns étant des ARNs retrouvés dans l ensemble du monde vivant. Chez la souris, lors de la gamétogenèse, les piarns (de classe II) apparaissent dès le dixième jour après la naissance avant la première méïose. Les piarns de classe I apparaissent après le début de la méïose et deviennent les piarns dominants à la fin du stade spermatocyte et au stade spermatide. Les piarns jouent un rôle majeur dans la fertilité masculine (des souris KO pour les gènes codant les protéines MIWI, MILI ou MIWI2 possèdent de petits testicules et ont une spermatogenèse grandement déficiente). Il en est de même pour la fertilité de la femelle chez la souris. Maintenance de l intégrité du génome L étude des plantes a permis de confirmer cette hypothèse 13,14. Pour contrôler les transposons, notamment dans les cellules de la lignée germinale, le rôle des piarns est fondamental. Bien que des inconnues sur le mécanisme précis demeurent, les piarns en interaction avec les protéines PIWI reconnaissent les transposons dont ils sont complémentaires puis les clivent et les dégradent. On estime que chez les vertébrés, 18 à 34 % des piarns sont complémentaires de transposons 15. Par exemple, la délétion du groupe piarn flamenco (flam) localisé sur le chromosome X provoque une dérepression de transposons tels que gypsy, ZAM et Idefix. Le groupe flam donne en effet naissance à des piarns complémentaires de ces transposons 16. Ces études et d autres ont ainsi démontré le rôle majeur des protéines PIWI et des piarns dans la répression (silencing) des transposons. En sus de cette activité, les piarns semblent au moins en partie contrôler la transcription et agir au niveau posttranscriptionnel. Les piarns de classe II en association avec des protéines telles que MILI et MIWI2 agissent sur leur état de méthylation au moins chez la souris et les plantes 15. Par ailleurs, il n est pas exclu que les piarns en association avec les protéines PIWI agissent aussi au niveau de la chromatine. Des études complémentaires sont néanmoins nécessaires pour le confirmer 6. Autres fonctions des piarns D après certaines études, d autres rôles pourraient être attribuer à ces ARNs tels que la régulation d ARNm et de manière plus large, le contrôle de l expression de certains gènes dans la lignée germinale 17. Ainsi, il a été démontré (notamment chez la drosophile) que des piarns pouvaient aussi réprimer des gènes codant pour des protéines. Par exemple, des piarn du groupe suppressor of stellate et du groupe tj répriment l expression de gènes codant pour les protéines Stellate (protéine formant des cristaux dans les spermatocytes primaires de la drosophile) et fascicline 3 (Fas3, molécule d adhésion cellulaire et protéine contrôlant la fasciculation de certains axones dans le système nerveux central de l embryon de la drosophile) 18. Le transcrit de Fas3 serait réprimé par les piarns dans les cellules germinales ovariennes. Cette régulation par les piarns permet d éviter la surexpression de Fas3 qui aboutirait à un trouble de l oogenèse 6. Une autre étude non confirmée a montré que la région 3 non codante de certains ARNm pourrait être transformée en piarns en présence de protéines PIWI, l ARNm étant alors un précurseur d un piarn 8. Ces différentes fonctions additionnelles semblent limitées et nécessitent confirmation avant de pouvoir affirmer le rôle des piarn sur des cibles différentes des transposons. Par ailleurs, récemment, un rôle des piarns dans l empreinte génomique a été évoqué 19. Pour rappel, l empreinte génomique est l expression mono-allélique spécifique d un des deux parents (le père ou la mère), l autre allèle étant inactivé, le mécanisme principal de ce phénomène étant la méthylation différentielle de l ADN dans la lignée germinale au niveau d une région génomique appelée région méthylée différemment (DMR, differentially methylated region). Le choix de l origine parentale de l inactivation par méthylation reste à élucider. Cette empreinte est établie dans la lignée germinale parentale puis transmise au zygote et maintenue ensuite dans les cellules somatiques. Au cours du développement du testicule dans le foetus, la région DMR est déméthylée complètement (empreinte effacée) dans les cellules primordiales germinales puis de nouveau méthylée au cours de la spermatogonie. Une étude a récemment montré que le rétablissement et le maintien de la méthylation et donc de l empreinte parentale du site DMR Rasgrf1 chez la souris nécessitaient entre autres l intervention de piarns dans la lignée germinale mâle 19. La régulation des piarns Au niveau des gonades, devant la grande diversité des petits ARNs qui s y trouvent, beaucoup d études restent à réaliser afin de comprendre la complexité de l ensemble. Ainsi, comment se déroule la transcription des miarns, siarns et piarns au niveau des gonades? Les promoteurs de gènes codant pour ces petits ARNs ne sont pas encore clairement définis. De même, les ARN polymérases assurant la transcription des piarns ne sont pas identifiés. Comment se fait la régulation des régions (clusters) de piarns dont on sait qu elle est différente chez l adulte et lors du développement? Et bien d autres interrogations encore. La biogenèse des piarns reste encore un domaine mal connu. Que retenir des piarn? Les piarns en association avec les protéines PIWI forment un complexe de répression comme les autres systèmes de répression (miarns et siarns) dont le mécanisme et la fonction sont différentes. Il s agit d un système complexe de protection de la lignée germinale et somatique contre une potentielle et dangereuse expression des transposons. Les piarns pourraient aussi jouer un rôle de régulation de l expression des gènes codant pour des protéines. Mais, ce dernier rôle reste encore à confirmer. Par ailleurs, les piarns pourraient aussi jouer un rôle d intermédiaire dans la méthylation de novo des séquences de transposons dans la lignée germinale des cellules de mammifères. Si cela se confirmait, un lien entre deux modes de régulation épigénétique de l expression des LigandAssay 17 (3)

7 gènes pourrait être proposé: la répression post-transcriptionnelle des petits ARNs et celle de la structure chromatinienne locale. Néanmoins, par rapport aux autres mécanismes de répression par les petits ARNs, l étude des piarns est moins importante notamment du fait de sa localisation principale dans la lignée germinale. Beaucoup d études sont donc nécessaires avant d obtenir une vision claire du rôle des piarns. LES ENDO-SIARNS Qu est-ce qu un endo-siarn? Différents des siarns exogènes (small interfering ARNs) que nous ne traiterons pas dans cet article, les endo-siarns (endogenous small interfering ARNs) se retrouvent comme les piarns dans les cellules germinales. La mise en évidence de ces petits ARNs remontent à la découverte des microarns (miarns) chez les nématodes (Caenorrhabditis elegans). En 1999, des travaux ont découvert que des mutants de nématodes appelés mutators présentaient un taux élevé de transposons actifs. L injection d ARN double brin ne provoquait pas de réponse ARN interférents (ARNi) alors que d autres souches mutantes dépourvues de certains ARNi (souches rde, RNAi deficient) mobilisaient de nombreux transposons actifs 20. Dans une autre approche, une équipe isola un mutant dans ce même nématode dont l oogenèse était défectueuse, la mutation étant sur un gène (ego-1), homologue d une ARN polymérase ARN dépendante des plantes (RdRP, RNA dependent RNA polymerase). Or les gènes RdRP sont indispensables pour monter une réponse ARNi-dépendante contre les virus chez les plantes et les champignons alors que chez le nématode, ego-1 est indispensable pour une méïose et une mitose normales mais aussi pour initier la synthèse d ARNi en réponse à un ARN double brin 21. D autres homologues de RdRP ont été aussi trouvés. Des mutations dans ces gènes similaires à des gènes RdRP diminuaient la réponse «répression». Plusieurs articles en partant de l étude d analogues de RdRP découvrirent des gènes qui inhibaient ou stimulaient des réponses ARNi dans les cellules somatiques et pouvaient provoquer des anomalies au niveau de la lignée germinale 11. Progressivement, d autres études portant sur les ARN interférents ont montré l existence d ARNi dont certains jouaient un rôle dans la formation des lignées germinales. Ainsi, alors que certains ARNi répondaient à la présence d ARN exogènes double brin dans les cellules somatiques, ces mêmes ARNi étaient freinés par d autres ARNi dans les cellules germinales. Ces derniers ont été dénommés petits ARN interférents endogènes (endo-siarns). La découverte des endosiarns a donc été plus tardive que celle des miarn 22. L explication de cette découverte plus tardive est liée à la structure des endo-siarns dont l extrémité 5 est constituée de 5 -guanosines, ces derniers n étant pas capturés par les techniques de clonage. Les nouvelles techniques de séquenc age ont permis leur identification plus précise dans les lignées germinales. Deux classes d endo-siarns ont ainsi pu être décrites, les ARNs 26G et 22G différenciés par leur taille, les facteurs permettant leur synthèse et les protéines AGO auxquelles ils s associent. Leur synthèse nécessite une RdRP chez les nématodes. Chez la souris, ces petits ARNs ont été étudiés dans les oocytes notamment à l aide des séquenceurs de nouvelle génération. Outre des miarns et des piarns, des endo-siarns ont donc été détectés. Ces derniers présentent plusieurs caractéristiques, une taille de pb, une localisation génomique dans les transposons, plus rarement dans des pseudogènes (notamment ceux contenant de grandes séquences répétées inversées ou de fortes analogies aux gènes endogènes). Pour rappel, un pseudogène est une séquence génomique de structure proche d un gène connu mais qui possède la propriété générale de ne pas être fonctionnelle. Il semblerait que les endo-siarns produisent des ARN double brins précurseurs, traités par Dicer pour générer les endo-siarns matures, ces derniers intégrant le complexe Argonaute-2 (Ago-2) 23. Ces siarns clivent ensuite les ARNm cible 24. Ces petits ARNs ont aussi été beaucoup étudiés chez la mouche D. melanogaster où ils ont été retrouvés dans les cellules somatiques. Étonnamment, de nombreux endo-siarns tant dans les cellules germinales que somatiques ont été localisés au niveau de séquences de transposons ciblées par des piarns. La cartographie des si-endoarns retrouve une complémentarité au niveau de la cartographie de celles des groupes (clusters) piarns (en miroir) avec néanmoins un degré de magnitude en moins pour les endo-siarns. On ne sait pas encore s il s agit d endosiarns dérivés de ces piarns. Parmi les autres sources d endo-siarns chez les mammifères et la drosophile, des études ont montré que des précurseurs ARN double brin pouvaient être produits non seulement de transposons mais aussi au niveau de pseudogènes, de transcrits codant pour des protéines, de transcrits de séquences répétées inversées (en épingle à cheveux), d ARNm autocomplémentaires et de transcrits sens, antisens ou bidirectionnels 24. Rôle des endo-siarns Les endo-siarns jouent un rôle dans la répression des transposons. Cela a pu être démontré chez la drosophile dont on avait supprimé la voie piarn. Ce rôle a aussi été démontré dans la lignée germinale femelle de la souris. Endo-siARNs et pseudogènes Dans le génome des mammifères, on retrouve de nombreux pseudogènes normalement non fonctionnels. L étude par clonage de petits ARNs à partir des oocytes de souris a montré la présence inattendue de pseudogènes fonctionnels, source de formation d endo-siarns par un mécanisme complexe 22. Endo-siARNs et développement de la lignée germinale Outre les miarns, les endo-siarns jouent un rôle important dans le développement des cellules de la lignée germinale. Néanmoins, chez les mammifères, il est difficile expérimentalement de différencier l action de l une ou l au- 326 LigandAssay 17 (3) 2012

8 tre classe d ARN dans le développement de la lignée germinale (une seule protéine Dicer est utilisée pour produire les miarns et les endo-siarns, ce qui n est pas le cas chez la mouche par exemple). Cependant, chez les nématodes, certaines protéines participant à la formation des endo-siarns pouvant être inactivées, on observe alors un certain degré de stérilité ou un défaut de gamétogenèse 25. Inactivation des transposons Dans la lignée germinale, il s agit du rôle principal des piarns. Cette fonction est conservée dans toutes les espèces animales 6. Bien que les siarns soient aussi capable d exercer cette action, les piarns y jouent un rôle prépondérant. FRONTIÈRE ENTRE PIARN, ENDO-SIARN ET MIARN Les trois classes de petits ARNs miarn, piarn et endo-siarns se distinguent par leur biosynthèse et leur rôle au niveau cellulaire (Fig. 2). Ainsi, de nombreuses études ont démontré la participation des piarns et des siarns à la défense contre les séquences génomiques parasites (par exemple, répression des transposons). De plus, tous deux peuvent être originaires de transposons, de gènes codant ou de pseudogènes, les piarns s exprimant dans les cellules germinales et les endo-siarns dans les cellules somatiques. Par ailleurs, il est difficile de différencier les miarns des siarns, ceux-ci étant essentiellement distingués en fonction de leur origine et plus rarement selon leur taille ou leur fonction. Pour certains, les endo-siarns seraient des intermédiaires dans l évolu- Figure 2 Synthèse des petits ARNs (siarn, miarn et piarn). A. Synthèse des siarns. Les transcrits des siarns peuvent former des ARN double brin ou des structures en épingle à cheveu et constituent les précurseurs endo-siarns. Les pseudogènes transcrits en orientation antisens produisent des ARNs qui s apparient aux ARNm des gènes correspondants ou à des transcrits issus de séquences répétées du génome (telles que les transposons). Après exportation dans le noyau, ces siarns sont traités par la protéine Dicer et les protéines se fixant sur celles-ci (Dicer binding proteins). Après maturation, ces endo-siarns (21 pb) sont chargés sur des protéines de la famille argonaute (AGO2). Les siarns exogènes (exo-siarns) sont issus d ARN double brin exogènes et sont aussi traités par Dicer et des protéines associées puis sont chargées sur des protéines de la famille Argonaute (AGO1, 2, 3 et 4). Néanmoins, seuls les ARN fixés à AGO2 ont une activité d interférence, les autres protéines AGO n ayant pas d activité de coupure. B. Synthèse des miarns. Les transcrits de gènes miarns (par l ARN polymérase II) sont des précurseurs pri-miarns. Ces derniers sont traités par le complexe protéique formé notamment de Drosha et de DGCR8 pour former un précurseur de structure en épingle à cheveux de pb, le pré-miarn. L exportation dans le cytoplasme se fait par l intermédiaire d une exportine 5 (processus actif). Le pré-miarn est alors transformé par Dicer et un complexe protéique en un duplex miarn de 22 pb. Un des deux brins est éliminé et le miarn mature est alors chargé sur les protéines argonautes AGO1, 2, 3 et 4. C. Synthèse des piarns. Les gènes piarns sont constitués en groupe (clusters) sur des séquences répétées intergéniques du génome. Les transcrits précurseurs de piarn sont exportés dans le cytoplasme et ne nécessitent pas le complexe Dicer (contrairement aux miarns et siarns) et ne semblent pas nécessiter le complexe Drosha. Dans le cytoplasme, les piarns précurseurs subissent un premier traitement par les protéines PIWI puis sont amplifiés par le cycle ping-pong qui nécessite l activité Dicer (coupure) des protéines PIWI. Les piarns matures s associent ensuite dans le noyau avec la protéine MIWI2 (appelée aussi PIWI-like protein 4) afin d exercer son activité de répression. DGCR8 : DiGeorge syndrome critical region 8. LigandAssay 17 (3)

9 tion dont l adaptation aurait abouti à la formation des miarns 7. Les longs ARN non codants (lncarn) Le monde complexe des ARNs n a pas fini de nous étonner par son importance et sa complexité. Seulement 2 % du génome des mammifères codent pour des protéines (environ gènes) et de nombreuses études ont montré que plus de la moitié du génome des mammifères étaient codants. L apparition des séquenceurs de nouvelles générations a joué un rôle majeur dans leur découverte. Grâce à ces nouvelles technologies et le séquenc age de transcrits à grande échelle (appelé aussi RNAseq), l analyse de ceux-ci permet de découvrir de nouvelles fonctions de ces derniers. C est par exemple, le cas des longs ARN non codants (lncrna, long non-coding RNA) dont la taille est supérieure à 200 pb, découverts concomitamment aux miarns et autres ARNs interférents mais que l analyse du transcriptome par ces nouvelles technologies a permis de différencier et caractériser. C est le cas par exemple de l ARN dénommé HOTAIR, transcrit ARN épissé de 2,2 kb intervenant dans la modification de la chromatine et la répression des gènes de la famille HOX, ceux-ci régulant le développement 26 ou d autres tel que le premier identifié en 1990, H19 (dont le rôle est majeur dans l empreinte parentale) ou quelques années après, XIST (X inactive specific transcript) dont le rôle dans l inactivation du chromosome X est fondamental 27. D autres lncarns ont été découverts et leur mode d action est complexe et toujours mal connu. Schématiquement, il semblerait que ces transcrits jouent un rôle majeur dans la régulation de l expression de nombreux gènes comme semble l indiquer des études de répression des gènes codant pour ces lncarns 28. Ces derniers représentent donc une nouvelle classe de gènes non codants dont le rôle commence seulement à être compris notamment leur rôle dans la régulation de l expression des gènes (au moins 900 lncarns sont répertoriés à ce jour dont 103 chez l être humain, site web: lncrnadb.com) 29. De nombreuses bases de données sont disponibles sur internet et sont régulièrement mises à jour (Tableau 3). Il s agit d ARN complexes dont l origine multiple explique la difficulté d analyse et de caractérisation. En effet, les gènes dont sont issus ces transcrits ARNs peuvent être intergéniques, intragéniques (introniques), transcrits sur le brin sens ou antisens (et même être bidirectionnels), issus d isoformes non codantes issus d épissage alternatif de gènes codants ou même d ARNm dont certains peuvent aussi être non codants (en parallèle du même ARNm codant). Par ailleurs, ces ARNs dont la taille varie de 100 pb à 100 kb peuvent être ou non épissés, polyadénylés ou non, présents soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau et sont en général transcrits par une ARN polymérase II ou III 29. L une des nombreuses difficultés d identification de ces lncarns constitue à trouver des transcrits fonctionnels parmi les nombreux transcrits identifiés. Certains d entre eux sont en effet des produits non fonctionnels, équivalent de résidus «bruit de fond» sans signification. Par ailleurs, il est encore difficile de borner avec précision un gène codant pour un lncarn. Des études fonctionnelles difficiles sont nécessaires. LncARN et pathologie Les lncarns participent à de nombreux processus biologiques 30. Sans rentrer dans les détails complexes de leurs actions, ces lncarns agissent dans plusieurs mécanismes biologiques. La régulation épigénétique Au locus INK4 comprenant les gènes codant pour CDKN2A, CDKN2B et ARF impliqués dans la régulation du cycle cellulaire, se trouve une séquence codant pour un transcrit lncarn dénommé ANRIL (antisenses lncrna of the INK4 locus), antisense de CDKN2B et dont l expression est corrélée à la répression épigénétique de CDKN2A. Le mécanisme est complexe et fait intervenir de nombreuses protéines. La répression épigénétique liée à une augmentation de la quantité d ANRIL aboutit à une dérégulation du cycle cellulaire et participe ainsi à l initiation de l oncogenèse comme cela a été observé dans le cancer de la prostate, le mécanisme précis provoquant l augmentation d ANRIL n étant pas élucidé 30. L augmentation d expression d ANRIL a été retrouvée dans d autres pathologies (maladies cardiovasculaires, Tableau 3 Bases de données (non exhaustives) sur les longs ARNs non codants [27]. Nom de la base de donnée Adresse internet LncRNa Database ncrnaimprint Functional RNAdb NONCODE RFAM NRED Ncode (InVitrogen) NcRNA Database T-UCRs (ultra conserved jill/ultra.html elements) NPinter La définition des longs ARNs non codants est variable selon les auteurs. Certains incluent les lincarns, les T-UCRs, les transcrits issus d intron, les transcrits ARN antisens, les ARNs non codants similaires aux ARNm et les pseudogènes transcrits dans les lncarns. 328 LigandAssay 17 (3) 2012

10 diabète de type 2 et d autres cancers). Il semblerait que des variants de séquences (SNPs, single nucleotide polymorphisms) sur ANRIL joueraient un rôle sur la fonction de cet ARN (polymorphismes fonctionnels). Le lncarn HOTAIR précédemment décrit par son action de remodelage du paysage chromatinien, jouerait aussi un rôle dans les cancers. Il a ainsi été observé une augmentation d expression d HOTAIR dans les cancers du sein. Son augmentation est alors corrélée à un mauvais pronostic et une dissémination des métastases 30. Schématiquement, HOTAIR interagit avec des protéines telles que par exemple polycomb repressive complex 2 (PRC2), histone methyltransférase agissant sur l ouverture de la chromatine (en pratique, en la réprimant) et par conséquent sur l expression des gènes. L altération du niveau d HOTAIR interagissant avec ces complexes protéiques sur la chromatine peut aboutir à une répression de gènes suppresseurs de tumeur et donc favoriser la progression du cancer. Ainsi, de manière simplifiée, HOTAIR et ANRIL sont des lncarns agissant comme molécules intermédiaires favorisant l association de complexes protéiques qui agissent sur le remodelage chromatinien et donc sur l expression des gènes. Leur sur-expression modifie le paysage chromatinien en le dérégulant, favorisant alors l initiation d un cancer puis sa progression. La régulation de l épissage Le lncarn MALAT-1 (metastasis-associated in lung adenocarcinoma transcript) a été identifié au cours de l étude d adénocarcinomes du poumon. Il a été démontré que ce lncarn modulait l épissage alternatif en agissant sur des protéines du spliceosome (complexe protéique permettant l épissage au cours de la maturation des ARNm), plus précisément sur des protéines de la famille SR (serine/arginine rich nuclear phosphoprotein) 31. Or cette famille de protéines SR est impliquée dans la régulation de l épissage alternatif de nombreux pré-arnm. Son action doit donc être finement modulée pour que la fragile balance des épissages alternatifs des ARNm dans les tissus soit assurée. Il a donc été suggéré que MALAT-1 jouait probablement le rôle de régulateur modulant l action des protéines SR. Par exemple, MALAT-1 est retrouvé abondamment dans les neurones où il joue un rôle dans la synaptogenèse (formation et mise en réseau des synapses) en modulant les protéines SR à ce niveau. On le retrouve dans les cancers du poumon non à petites cellules où son expression est augmentée et corrélée à un mauvais pronostic. Par ailleurs, son rôle dans l expression correcte de nombreux gènes paraît important. MALAT-1 semble jouer ce rôle en servant de molécule intermédiaire dans l assemblage de protéines participant à l épissage (en plus des protéines SR) 31. De nombreuses inconnues demeurent cependant sur son mode d action. Le contrôle de la transcription Le lncarn BACE1-AS (Beta-site amyloid precursor protein [APP]-cleaving enzyme) est un transcrit antisens du gène BACE1, protéase clivant les précurseurs amyloïdes au site bêta des protéines et produisant des peptides bêtaamyloïdes (Aβ). Une altération de l expression de BACE1 a été détectée chez les sujets atteints de maladie d Alzheimer. Or BACE1 est nécessaire à une fonction cérébrale normale. Elle est finement régulée par le transcrit antisens BACE1-AS qui agit sur l ARNm de BACE1. L association de l ARNm et du lncarn forme un duplex stabilisant l ARNm BACE1. Il a été suggéré qu une altération de l expression de BACE1-AS provoquerait un déséquilibre d expression de BACE1 et entraînerait une cascade d altération en amont dans le métabolisme du neurone et notamment un stress cellulaire avec augmentation de peptides Aβ dont l accumulation aboutirait à une toxicité locale et la formation de plaques Aβ 32. La régulation du contrôle cellulaire et de l apoptose Le lncarn Gas5 (growth arrest specific 5) sensibilise la cellule à l apoptose en régulant l action des glucocorticoïdes au déficit de métabolites (par exemple, en condition de stress cellulaire). Dans ces conditions, on observe une augmentation d expression de Gas5. Ce dernier vient alors se fixer sur la séquence ADN, domaine de fixation du récepteur aux glucocorticoïdes (GR) où il joue le rôle de leurre empêchant ainsi la fixation du récepteur aux glucocorticoïdes. En conditions normales, Gas5 cible des gènes impliqués dans l inhibition de l apoptose tel que le gène cellular inhibitor of apoptosis 2 (ciap2) et inhibe des gènes pro-apoptose tels que ceux des caspases 3, 7 et 9. Il a pu être démontré que Gas5 agit en interaction avec la protéine GR à laquelle il s associe 33. Le locus du gène Gas5 est associé à la susceptibilité aux maladies auto-immunes et notamment au lupus chez la souris (souche BXSB). Or les glucocorticoïdes sont de puissants immunosuppresseurs. Il a été suggéré qu une augmentation de Gas5 dans les cellules de l immunité pourrait réprimer l activité transcriptionnelle induite par les GR et favoriser ainsi le développement de maladies autoimmunes. Néanmoins, et pour compliquer ces observations, les introns de Gas5 codent de multiples ARNsno intervenant dans la biogenèse des ARNr ce qui rend plus difficile les études d association à ce locus 34. Ce lncarn est également associé au cancer du sein, son taux d expression étant diminué dans ce cas. Il agirait comme un suppresseur de tumeur. Son action sur les caspases étant diminuée, une réponse apoptotique inappropriée en résulterait. Par ailleurs, dans certains cancers (mélanome, lymphome B, prostate, sein), une translocation au locus 1q25 incluant ce gène a été détectée 35. LncARN en pathologie Comme il a été dit plus haut, le rôle des lncarns dans la régulation de l expression des gènes (transcription et empreinte génomique, notamment) a naturellement amené les chercheurs à les étudier dans les cancers. Comme indiqué ci-dessus, un certain nombre d entre eux sont associés à des cancers variés (tels que le cancer du sein, du foie, de la prostate, du cerveau, du côlon, dans les lymphomes...) 27. Dans le cancer de la prostate, l étude de certains lncarns a amené des industriels à développer un kit. Il s agit de la quantification du lncarn DD3 (dénommé aussi PCA3 et considéré à tort dans certains articles comme un ARNm) dont la transcription est augmentée dans le cancer de la prostate. Parmi les méthodes décrites pour le quantifier, on peut citer la RT-PCR, la nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), commercialisé par DiagnoCure (kit upm3 TM ), et la transcription-mediated amplification (TMA), commercialisée par Gen-Probe (kit Progensa ou Aptima PCA3 Assay) 36,37. Ce marqueur (test urinaire PCA3) serait LigandAssay 17 (3)

11 plus spécifique que le PSA classiquement dosé 38. Selon de nombreuses études, ce kit serait utile. Il n est cependant pas encore intégré dans les prescriptions au cours de cette pathologie et sa place dans l arsenal diagnostique n est pas encore clairement établie. Quant à l utilisation thérapeutique des lncarns, cette voie d exploration n en est qu à ses débuts, ces derniers étant trop mal connus 27. De manière plus générale, l identification de lncarn impliqués en pathologie humaine n est pas aisée. Il est déjà difficile de les identifier. L analyse du génome humain a démontré que certes des mutations existaient dans les régions codantes mais elles existent aussi dans les régions non codantes du génome et dans les régions intergéniques. Il est facile de relier une anomalie génétique (mutation qu elle soit ponctuelle, une délétion, insertion, duplication, translocation, etc.) à une pathologie quand il s agit d un gène codant. Il en est autrement pour un ARN non codant. Des mutations soit de grande taille (translocations) ou de petites tailles (SNPs) dans des lncarns ont été rapportées dans littérature. Ces mutations sont impliquées dans de nombreuses pathologies fonction du lncarn ciblé (par exemple, la schizophrénie, le mélanome, l ataxie cérebelleuse, etc.) 30. De nombreuses inconnues demeurent cependant et plusieurs questions se posent à ce jour: existent-ils des motifs spécifiques (séquences ayant une fonction déterminée) sur certains lncarns? Chaque motif d un lncarn est-il indépendant? Comment s échafaude la structure secondaire d un transcrit lncarn? Existe-t-il un cadre de lecture ouverte (ORF, open reading frame) dans la séquence d un lncarn, c est-àdire l ordre des motifs présents sur le lncarn obéissent-ils à la règle de transcription de 5 vers 3? En résumé, «la grammaire» du lncarn présente encore de nombreux mystères à élucider 30. Les gènes codant pour les ARNs: matière noire du génome? L arrivée des séquenceurs de nouvelle génération a révolutionné notre connaissance du génome. Ces technologies ont permis notamment de découvrir des régions codant pour des ARN (gènes non codants) y compris dans des zones considérées comme des «déserts» géniques. Le séquenc age des produits de transcription (les ARNs) a démontré l importance quantitative majeure des ARNs non codants et bien entendu, l extraordinaire richesse et complexité des transcrits dans les cellules (Fig. 3). Une étude récente a montré que les ARN non codants (excluant les ARN ribosomaux et mitochondriaux) représenteraient en moyenne % des ARN transcrits que ce soit dans les tissus normaux ou cancéreux 39. Ces auteurs estiment qu il s agit probablement d un nombre sous-estimé du fait des limites de la technologie utilisée (zones limitées aux régions non exoniques à l aide d un séquenceur de troisième génération). Cette étude a par ailleurs démontré que des déserts géniques, non référencées dans les bases génomiques possédaient des séquences ARN transcrites et probablement non codantes de plusieurs kilobases. La signification et l importance de ces longs ARN non codants restent à éclaircir 39. LA NOMENCLATURE DES ARN Le monde des ARNs bouge et grandit chaque jour (Tableau 4). Afin de systématiser et classer les ARNs dont les structures sont complexes et dont le nombre croît régulièrement, le comité HUGO (Human Genome Organisation - a établi une classification officielle facilitant ainsi le travail des chercheurs (Tableau 5) 40. Figure 3 Représentation quantitative des gènes d ARN non codant parmi les gènes identifiés dans le génome humain. 330 LigandAssay 17 (3) 2012

12 Tableau 4 Principaux ARNs non codants chez les êtres humains [27]. Type Sous-classes Symboles Petits ARNs non codants (de 18 à 200 pb) Longs ARNs non codants (de 200 pb à > 100 kb) ARNs de transfert ARNt MicroARNs miarns ARNs ribosomaux 5S et 5.8S ARNr ARN interagissant avec les protéines PIWI piarn Petits ARNs d initiation de la transcription tiarn Petits ARNs intérférents siarn Petits ARNs associés au promoteur PASRs Petits ARNs associés aux extrémités terminales TASRs Petits ARNs associés aux extrêmités terminales antisens atasrs Petits ARNs nucléolaires snoarns ARNs antisens du site d initiation de la transcription TSSa-ARNs Petits ARNs nucléaires snarns ARNs dérivés des rétrotransposons RE-ARNs ARN dérivés de la région 3 non codante uaarns ARN non codant x x-ncarns ARN humain Y hy ARN Petits ARNs inhabituels usarns Petits ARNs associés à NF90 snars ARN en arceau («vault») vtarns ARNs ribosaumaux 18S et 28S ARNr Longs (ou larges) ARNs non codants intergéniques lincarns Régions transcrites ultraconservées T-UCRs Pseudogènes / ARNs contenant des séquences répétées GAA GRC-ARNs Longs ARNs introniques non codants / ARNs antisens aarns Longs ARNs associés aux promoteurs PALRs Transcrits en amont du promoteur PROMPTS ARNs stables issus d introns / Longs transcrits non codants induits par le stress LSINCTs Tableau 5 Classification des ARN non codants (HGNC, Hugo Gene Nomenclature Committee ; org/genefamily/rna.php). ARN non codants Liens utiles ARN de transferts Cytoplasmiques Genomic trna Database : Mitochondriaux mirbase : Petits ARNs nucléolaires Non coding RNA database : Boîtes C/D (SNORD) pirna bank : Boîtes H/ACA (SNORA) snorna bank : Petits ARNs spécifiques des corps de Cajal (SCARNA) Rfam : Petits ARNs nucléaires et cytoplasmiques RNAdb : Petits ARNs nucléaires Petits ARNs cytoplasmiques Petits ARNs divers MicroARNs MIR : ARNs PIWI PIRC : Longs ARNs non codants ARN pseudogènes Répartition sur le génome : stats.pl. LigandAssay 17 (3)

13 CONCLUSION Le dogme central énoncé dès 1961 et enseigné jusqu au début des années 2000 affirmait que l information génétique était stockée dans des gènes codant pour des protéines et que les ARN n étaient que des intérmédiaires entre la séquence d ADN sur le génome et la protéine codée par un gène. Les découvertes de ces 15 dernières années ont bouleversé ce dogme désormais obsolète. Comme l ont montré de manière simplifiée les trois articles consacrés aux ARNs, ces molécules peuvent transporter une information, interagir avec de l ADN ou de l ARN, former des structures complexes (duplexes, triplexes), servir de socle pour des protéines avec lesquelles elles peuvent interagir et possède une spécificité de séquence. Les ARNs dans leur globalité sont donc des molécules, véritables chefs d orchestre majeurs dans les réseaux métaboliques et en biologie en général. Par ailleurs, l analyse de génomes humains (projet 1000 génomes) bouleverse notre vision du génome et de la génétique en générale. Il y a encore 20 ans, on pensait que notre génome contenait gènes et était d une richesse infiniment supérieure aux autres organismes vivants. En 2003, on constate qu il n en est rien et que notre génome contient environ 20,000 gènes et ne contient pas plus de gènes que celui de... C. elegans, un simple ver de terre! Le chimpanzé possède 29 % de gènes strictement identiques aux nôtres et la plupart des autres protéines ne sont différentes que... de deux acides aminés! Et pourtant, il y a bien une différence entre un être humain et un chimpanzé! Les gènes codant pour des protéines ne représentent que 2 % de notre génome. La différence observée est donc probablement liée au reste du génome considéré il y a encore 15 ans comme de l ADN «poubelle» (junk DNA). Actuellement, on pense que les gènes non codants transcrits en ARN non codants constituent l explication à ces différences entre un être humain et un ver de terre ou un chimpanzé. Comme nous avons essayé de vous le montrer de manière simplifiée au cours de ces trois articles décrivant le monde complexe et mouvant des ARNs, les ARN non codants jouent un rôle majeur dans la régulation des gènes codants et dans l action des protéines intervenant dans les métabolismes cellulaires et tissulaires. Il est fort probable que dans les dix années à venir, grâce notamment aux travaux sur ces ARNs, un nouveau modèle métabolique sera élaboré changeant notre vision de la physiologie et la physiopathologie et dont les conséquences sur la prévention, le traitement et la prédiction des maladies seront considérables. À suivre donc... SITES INTERNET Base de données de piarns: DÉCLARATION D INTÉRÊTS Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d intérêts en relation avec cet article. RÉFÉRENCES 1. 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