CELLULAIRE. FORMATION pour le LBFA

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1 CYTOMÉTRIE TRIE EN FLUX ET MICROSCOPIE CONFOCALE: 2 TECHNIQUES COMPLÉMENTAIRES MENTAIRES POUR L EXPLORATION L DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE FORMATION pour le LBFA Cécile COTTET 2007

2 3 sessions : I- Pré requis communs aux 2 techniques - La fluorescence - Les sources lumineuses - Filtres et PMT - Fluorochromes II- Cytométrie en flux - Principe & Applications III- Microscopie confocale Bases de microscopie et principe du confocal

3 PLAN 1.Composants du microscope: -trajet de la lumière -oculaires, -condenseurs, -objectifs, 2. Généralités -résolution et PSF, -ouverture numérique, -indice de réfraction, - profondeur de champ, 3. Principe de la microscopie confocale

4 COMPOSANTS DU MICROSCOPE LAMPE HALLOGÈNE CONDENSEUR PLATINE OCULAIRES LAMPE FLUO OBJECTIFS ENTREE LASER MISE AU POINT

5 TRAJET DE LA LUMIÈRE Lampe blanche observateur échantillon filtres Lampe fluo

6 LES OCULAIRES Combinaisons de lentilles, Grossissement x10 (x6,3 si tube binoculaire grossit déjà x1,5) Rôle : ajuster la distance de la pupille à l objet, permet le réglage «personnalisé» du focus

7 LE CONDENSEUR source condenseur objectif Plan objet Rôles : - Réaliser une ouverture numérique voisine de celle de l objectif -Eclairer uniformément le champ d observation

8 DIFFÉRENTS MODES DE CONTRASTES Transmission Phase contrast Differential interference contrast (DIC/Nomarski) Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

9 MICROSCOPE À TRANSMISSION Eyepieces Objectives Sample Condenser Lamp Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

10 L ÉCLAIRAGE DE KÖHLERK Critical illumination Objective Köhler illumination Object plan Condenser Aperture diaphragm Lamp Field diaphragm Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

11 L ÉCLAIRAGE DE KÖHLERK Rendre le polygone net : hauteur du condenseur (diaphragmes d ouverture et de champ) Centrer (clés de centrage) Non réglé Rôle : Réglé Réduire la perte de contraste par illumination excessive

12 A. Jobart-Malfait

13 A. Jobart-Malfait

14 CONTRASTE DE PHASE Décrit par Fritz Zernike en 1934, prix Nobel en 1953 Technique qui permet d obtenir des images contrastées à partir d échantillons transparents : Transformer des différences de phase en différences d intensités Utilisé pour observer des cellules vivantes, micro-organismes, coupes de tissus, organites cellulaires A. Jobart-Malfait

15 CONTRASTE DE PHASE

16 A. Jobart-Malfait

17 A. Jobart-Malfait

18 A. Jobart-Malfait

19 A. Jobart-Malfait

20 A. Jobart-Malfait

21 DIC (Nomarski( Nomarski)

22 Contraste de Phase vs DIC (Nomarski)

23 LES CARACTÉRISTIQUES RISTIQUES DES OBJECTIFS - Sec ou Immersion (eau ou huile) - Grossissement - Ouverture numérique - Distance de travail PLAN-APO-60X 1.40 N.A. /0.17 Champ plat Grossissement Ouverture Apochromatique numérique Longueur de tube Epaisseur de la lamelle Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

24 Le grossissement n est pas suffisant! Résolution! Même grossissement! Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

25 Diffraction à travers une lentille Diffraction: Airy disc point source idéal Objectif light point Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

26 NOTION DE RÉSOLUTIONR PSF= Point Spread Function = fonction d étalement du point L Image d un point est une tâche (Tâche d Airy) résultant de l interférence entre les ondes diffractées Le diamètre de cette tâche dépend: - du système d observation - de la longueur d onde - de l indice de réfraction

27 LIMITE DE RÉSOLUTION R D UN D SYSTÈME OPTIQUE (CRITÈRE RE DE RAYLEIGH) énergie deux molécules ou billes brillantes plan lentille point source D après Usson & Sibarita, CNRS, Grenoble

28 RESOLUTION = Distance minimale requise entre deux objets pour qu ils apparaissent distincts. Dépend de l ouverture numérique de l objectif Critère de Rayleigh r xy = 0, 61λ n r z = λ 2 NA NA Confocal : R xy = 0,4 λ /N.A. Meilleure résolution en lumière violette qu en rouge Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

29 NUMERICAL APERTURE N.A. = n sin(µ) n : refraction index µ : half-angle of the illumination cone = cône de lumière entre le foyer et la lentille Détermine la résolution spatiale et axiale ainsi que la luminosité de l image

30 NUMERICAL APERTURE 0.12 Low resolution N.A High resolution Plus N.A est grande, meilleure est la résolution Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

31 PROFONDEUR DE CHAMP - Correspond à la distance D qui sépare, en suivant l axe optique, les parties extrêmes de l objet, nettes sans variation mécanique de la mise au point = distance de 2 points de l axe tels que leurs images soient toutes deux acceptables -Dépend de l ouverture numérique + NA grande, + D petite = meilleur sectionnement optique meilleure résolution D = Raxial + 0,34 n / M x N.A. (M : grossissement)

32 INDICE DE RÉFRACTIONR n = c/v C= vitesse de la lumière dans le vide V= vitesse de la lumière dans le matériau

33 INDICE DE RÉFRACTIONR Incident Beam θ i θ r Reflected Beam Transmitted (refracted)beam θ t Loi de Snell: l angle de réflection (Ø r ) est égal à l angle d incidence (Ø i ) quelle que soit la nature du matériau de surface L angle du rayon transmis (Ø t ) dépend, lui, de la nature du matériau n 1 sin Ø i = n 2 sin Ø t

34 INDICE DE RÉFRACTIONR

35 INDICE DE RÉFRACTIONR cytoplasme 1.37 polystyrène

36 À SAVOIR - N.A. est donnée pour une lentille dans son milieu ; -n varie en fonction de la température, définis pour 21 C (importance de la clim) et avec la longueur d onde (problèmes de chromatisme) - Objectifs conçus avec distance de travail précise, épaisseur de lamelle donnée (0,17mm) indices de réfraction précis; ± milieu d immersion avec n proche Si ces conditions ne sont pas respectées, la pile de sections Optiques apparaîtra soit étirée, soit tassée selon l axe Z.

37 MICROSCOPIE ÉPI-FLUORESCENCE vs MICROSCOPIE CONFOCALE

38 FONCTIONNEMENT D UN D MICROSCOPE À ÉPIFLUORESCENCE

39 Microscope Confocal à Balayage Laser Photomultiplicateur «Pinhole» Miroir dichroïque Laser Objectif z Plan focal adapté de F. Waharte Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/susanne Bolte IFR87

40 M. Fallet cours de microscopie confocale 2005 INTÉRÊT T DU PINHOLE

41 AVANTAGES DE LA MICROSCOPIE CONFOCALE Réduit le flou dû à la lumière hors focus Augmente la résolution Améliore le rapport signal/bruit Permet l observation d échantillons épais Permet un balayage en Z, et un sectionnement optique

42 Création d une d image 2D avec l aide l des galvanomètres X : mouvement continu Laser Galvanomètres Y : mouvement par ligne y X x Emission de fluorescence Numérisation adapté de F. Waharte Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/susanne Bolte IFR87

43 L image 2D se forme ligne par ligne fluorescence ~2 ns (pixel = picture element) ~2 µs 512 pixel ligne ~1 ms image ~1 s y Echantillon 512 pixel x Image numérique adapté de F. Waharte Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/susanne Bolte IFR87

44 Comment se fait une série d images en z Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/susanne Bolte IFR87

45 Création d une image 3D à l aide d un galvanomètre au niveau de l objectif ou de la platine Objectif X y X x Z Platine Le résultat de ces mouvements adapté de F. Waharte Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/susanne Bolte IFR87

46 Acquisition d une série de sections optiques dans l axe vertical Z z y x Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/susanne Bolte IFR87

47 Projection des données tridimensionnelles d une cellule z «Logiciel» y x Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/susanne Bolte IFR87

48 Filtre Long Pass Miroir dichroïque 510 LP Dichroic Filter/Mirror à 45 deg Lumière source Lumière transmise Lumière réfléchie % Transmission 0 UV block pas s Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif IR

49 LEICA TCS SP2 AOBS Sp prism Sp detector PMT 4 PMT 2 PMT 3 PMT 1 AOBS PMT TRANS AOTF

50 LASERS ET AOTF : Acoustico Optical Tuneable Filter

51 The cross-talk problem Lasers 488 and UV Laser 488 then UV Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

52 AOBS : Acoustico Optical Beam Splitter

53 PRISM SPECTROPHOTOMETER DETECTOR PMT lentille Fluorescence provenant du spécimen pinhole Prisme «spectral» Fente motorisée Sélectionnant bande spectrale Détectée par PMT

54 30 70 Spectral acquisition of a lambda series

55 415 nm Z Intensity 695 nm 415 emission wavelength 695 Spectral acquisition of a lambda series Plate-forme de microscopie, ISV, CNRS, Gif

56 -voir classeur vert RÉALISATION D ACQUISITIONSD Procédures d allumaged PRÉCAUTIONS D EMPLOI Lasers : 1 fois allumés: durée min d utilisation : 1h à l extinction : durée min de refroidissement : 2 heures Lampe fluo: 1 fois allumée: durée mini d utilisation : 30 min à l extinction: durée mini de refroidissement:30 min à 1h Inscrire sans le classeur ou sur la feuille près de la lampe l heure d allumage et d extinction

57 RÉALISATION D ACQUISITIONSD Le LEICA TCS SP2 AOBS du LBFA/CERMO/CERMAV Objectifs disponibles x40oil NA 1,25 WD 100µm R xy 156,2 nm R z 334,4 nm Coverglass 0,17mm x63water NA 1,20 WD 220µm R xy 162,7 nm R z 290,3nm x63oil NA 1,40 WD 100µm R xy 139,4 nm R z 235,8 nm Coverglass 0,17mm X10 sec NA 0,30 WD 11000µm R xy 650,7 nm R z 4767,6 nm

58 RÉALISATION D ACQUISITIONSD Le LEICA TCS SP2 AOBS du LBFA/CERMO/CERMAV Filtres disponibles sur le microscope 1 : pour l UV: l DAPI, Hoechst 3: I3: Exc BP 475/20 em BP 510/23 FITC,, GFP 4: Scan! 2 : N2.1: Exc BP em LP 590 Rhodamine, Texas red

59 RÉALISATION D ACQUISITIONSD Le LEICA TCS SP2 AOBS du LBFA/CERMO/CERMAV Lasers disponibles UV Argon AOTF(multi-raies) He/Ne AOTF Ne/Ne AOTF Excitation (nm)

60 RÉALISATION D ACQUISITIONSD Procédure standard de saisie d imagesd 1- observation au microscope -choisir un objectif, - choisir et centrer un champ, - faire la mise au point, alignement Köhler, DIC -vérifier présence de marquage fluo et spécificité

61 RÉALISATION D ACQUISITIONSD 2- Observation en mode confocal -choix des différents paramètres (mode, format,laser, bandes spectrales et PMT) -réglage de l intensité du(des) lasers : % AOTF et PMT(s) : gain/offset Série Z -déterminer épaisseur de l échantillon : positions z begin et end - choix du moyennage (Li.A ou Aver ) - choix du nombre de coupes et intervalles (ex 40 coupes de 0,2µm entre 0 et+8µm dans la cellule)

62 RÉALISATION D ACQUISITIONSD Série Z suite -choix du mode xyz : coupes optiques dans 1 couleur ou xyλz: coupes optiques dans plusieurs canaux (séquentiel) ou xyzt : 3D en fonction du temps Série λ -déterminer λ begin et λ end - pas de moyennage nécessaire, pas de séquentiel possible - choix du spectre et intervalles (ex 40 images entre 520nm et 620 nm avec bandes de 10nm) Série t -déterminer temps total et intervalle de temps entre chaque image - choix moyennage - séquentiel possible

63 RÉALISATION D ACQUISITIONSD Conditions optimales pour obtenir une bonne image en fluorescence - Grande N.A. - Champ d illumination le plus petit possible - Système optique limitant la contribution des objets situés hors plan de mise au point Contraintes de préparation paration - absence de mouvement des cellules -absence de compression lors de la mise au point - absence de bruit de fond -Préservation de la structure 3D -Addition d anti-fadding

64 SAUVEGARDE DES DONNÉES A faire à la fin de chaque manip La + fiable = CD ou DVD!!! LBFA : transfert réseau vers station d analyse immédiatement à la fin de la manip! Autres : CD Le stockage données fortement déconseillé sur le confocal: Encombrement mémoire, risque de perte! Ménage régulier du disque D

65 TRAITEMENT DES DONNÉES Station d analyse d d imaged Poste informatique dédid dié : logiciel LCS Lite, Image J, Volocity Amélioration image : bruit de fond, contraste luminosité.. Quantification : spectres, courbes intensité de fluo au cours du temps Reconstruction 3D, projections, mesure de distances, Combinaison d images ou séries Séparations d images ou séries

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