Titre de l atelier : Nouvelles approches pour l étude des interactions moléculaires. Intervenant(s) : Lauranne Paillard; Virginie Goubert

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1 Titre de l atelier : Nouvelles approches pour l étude des interactions moléculaires Intervenant(s) : Lauranne Paillard; Virginie Goubert

2 Atelier protéomique fonctionnelle : Nouvelles approches pour l étude des interactions moléculaires

3 Nouvelles approches pour l étude des interactions moléculaires Partie 1 Présentation de la plate forme Lauranne Paillard-Laurance Ingénieure Partie 2 Présentation des technologies Alpha et Label free Virginie Goubert Drug discovery application specialist Partie 3 Applications et exemples réalisés sur la plate forme Lauranne Paillard-Laurance Ingénieure

4 Interactions Moléculaires Puces ACTivités L. Paillard-Laurance Gen2Bio 3 avril 2014 Saint-Malo

5 Le réseau Biogenouest 6 axes technologiques : Génomique Protéomique Exploration fonctionnelle Bio-imagerie Analyse structurale et métabolomique Bio-informatique 4 domaines d'activité 29 plates-formes technologiques Plus de 70 unités de recherche Mer Santé Agro Bio-informatique

6 Axe Protéomique Animateur : Charles Pineau & P. Weigel Identification Caractérisation à haut débit Charles Pineau Rennes Nantes Interactions moléculaires puces activités (IMPACT) Yannick Jacques et Pierre Weigel

7 Protéomique Caractérisation des PROTEines exprimées par un génome dans un système biologique déterminé. Etude des protéines à grande échelle par des méthodes de biochimie et de biologie structurale en relation avec les données du génome Trois domaines: Cartographie et identification des protéines Analyse des interactions / recherche de partenaires Structure / Fonctions

8 Interactomique Etude de l ensemble des interactions entre les protéines d un organisme Objectifs Connaître la liste des gènes et des protéines d un organisme Savoir comment ces éléments interagissent En pratique Déterminer quelles protéines interagissent avec quelles autres Dans un milieu dynamique (cellule vivante) Innombrables réactions chimiques à chaque seconde Dans un système biologique donné Solutions 1. Etudier le contenu (cartographie) 2. Etudier les interactions dans leur contexte cellulaire naturel 3. Etudier dans le détail chaque interaction

9 Les 3 activités de la plateforme Impact 1. Activité de services 1. Aide méthodologique 2. Projets collaboratifs 2. Activité de R&D 50 % de projets en interne 50% de projets externes 3. Activité de formation Démarche qualité certification Iso 9001 à court terme

10 Pourquoi venir sur la plate forme Impact?

11 Activité niche en protéomique fonctionnelle Expertise : Profiling de l expression protéique Criblage d activités biologiques Caractérisation / Validation des interactions Applications dans les domaines de la santé et des biotechnologies

12 Profiling Criblage Caractérisati on Validation Contrôle qualité Expertise actuelle Etude du profil d expression de protéines Analyse de la modulation des modifications post-traductionnelles de protéines : phosphorylation, ubiquitination, SUMOylation glycosylation Criblage modèle dédiés à l étude de la fonctionnalité de récepteurs membranaires Criblage de chimiothèques sur la base de modèles Validation de l interaction protéine/ligand Détermination de l affinité Etude des paramètres thermodynamiques Analyse de l'intégrité structurale ou de la fonctionnalité Evaluation de la pureté de protéines Technologies Puces à protéines SPR imaging SPR BRET FRET SPR itc Fluorescence Bioanalyzer Dichroisme circulaire itc

13 Equipements de la plate forme Impact SPRiplex II Biacore 2000 / 3000 Technologies Alpha et Label Free EnSpire Puces à protéines sciflexarrayer S3 (Scienion) Profiling Criblage Caractérisation Contrôle HTRF / BRET / FRET / AF Mithras LB940 Fluorescence/anisotropie fluorescence Spectrofluorimètre FP-6500 Photomètre de polarisation de fluorescence FP-715 Dichroïsme Circulaire et linéaire Spectropolarimètre J-810 Microcalorimètre Auto itc200

14 Equipements de la plate forme Impact Technologies Alpha et Label Free EnSpire

15 15 Alpha Technology

16 Alpha : Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay Bead-based - Donor and Acceptor Beads Homogeneous - no wash steps Versatility - Detects virtually any molecule from large endogenous protein complexes to very small peptides Works in a variety of sample types including serum, plasma, cell lysates and cell supernatant High sensitivity (fmol) - Amplified signal Low background - Emission wavelength is lower than Excitation

17 Alpha Toolbox for Assay Development Donor Beads Unconjugated Ni 2+ chelate Glutathione (GSH) Protein A Anti-FLAG Anti-mouse IgG Anti-Rabbit IgG Strep-Tactin Optimization kits TruHits Omnibeads AlphaLISA Acceptor Beads Protein A Protein G Protein L Anti-human IgG Anti-rabbit IgG Anti-mouse IgG Anti-mouse IgM Anti-rat IgG Anti-goat IgG Anti-sheep IgG Anti-chicken IgY Streptavidin Nickel chelate Glutathione (GSH) Anti-FLAG Anti-GST Anti-c-myc Anti-DIG Anti-FITC Anti-V5 Anti-GFP Anti-MBP Strep-Tactin

18 Alpha: A broad assay platform >120 Biomarker kits (immunoassays ELISA conversion) 86 SureFire kits for protein phosphorylation >20 reagents to measure the activity of epigenetic enzymes > 10 kits for cell-based epigenetics assays camp, cgmp determination Biotherapeutics analysis: PK, PD, ADA assays (immunoassays), clone screening, isotyping, functional testing, Hostcell contaminants, Toolbox: Even more flexibility to develop: Other biomarkers, all the above but as custom kits,... Protein-protein interactions, Protein-DNA interaction, Protein-RNA interaction, Protein-small molecule interaction, Cellular markers or signaling, Biochemical Binding Assays..ie. Receptor + Ligand/Mab Virtually any assay can be developed, as long as you can bring the beads together Homogeneous assays: Few steps, faster data generation Improved CV compared to wash assays Reduced consumption of sample Compatible with multiple types of samples

19 AlphaScreen Signal (cps) AlphaScreen Signal (cps) Low affinity protein-protein interaction:p53/hdm2 (µm range) Total Non Specific [GST-HDM2] (nm) p53 peptide anti GST log [p53 peptide] (M) [GST-HDM2] (nm) IC 50 ( m M)

20 Cellular assay for measuring p65-ikba interaction 20

21 AlphaLISA comparison to ELISA AlphaLISA How does AlphaLISA compare to traditional ELISA? AlphaLISA is bead based, technically different but similar in functionality (sandwich assay in solution) No wash vs wash (time consuming) Scalable (from 96-well to 1536-well) Very wide dynamic range ELISA 2-incubation step protocol for most assays: Just 4 steps to results Add standard or sample Add mix: biotinylated Ab & acc beads 60 min incubation Add donor beads 60 min incubation Read 21

22 Alpha Molecular Weight Range for Targets AlphaLISA can cover a wide range of sizes: - Giant particles (100MDa+) ex. M13 phages - Huge proteo-glycans (1MDa+) ex. chondroitine - Large proteins (150kDa+) ex. higg - Medium protein (50kDa+) ex. trimeric TNFa - Small protein (5kDa+) ex. insulin - Large peptides (30aa+) ex. Aß42 - Small peptides (5-30aa) ex. Angiotensin I - Small molecules ex. camp 22

23 Detection of phospho-kinases in Cell lysates with SureFire kits Homogeneous Cell-based assay Highly sensitive: Over-expressed and endogenous receptors Receptor-mediated signaling modulation: GPCRs, Receptors Tyr Kinases, Cytokine Receptors, Inflammatory responses Intracellular kinase signaling cascade modulation: monitor a single target or multiple targets Use in many different cell lines, incl. Primary Cells 23

24 Stimulation of Endogenous Bombesin Receptors % Activation Measurement of ERK phosphorylation in Swiss 3T3 cells AlphaScreen SureFire Cellular ERK assay Log [Bombesin] (M) perk1/2 Western blot 40 pm [Bombesin] 10 µm 24 GPCR Activation

25 25 Label-Free Technology

26 PKI + Epic = EnSpire Label-Free EnSpire Multimode Reader Epic Generation 2 Label-free Reader + = The First Multimode Bench-top Instrument With Label-free Capability For Both Cell-based & Biochemical Assays! 26

27 PerkinElmer Label-free Enabled Microplates Body Split Grating Sensor 27 High Quality Label-free Microplates Incorporate Patented Epic Biosensor Technology

28 Le principe de lecture Mesure du changement d indice de réfraction de la zone voisine du bio-détecteur (150 nm) La majeure partie de la lumière est transmise Fenêtre de détection 150 nm Source lumineuse à large spectre Longueur d onde réfléchie Mesurée par le lecteur 28

29 Applicable aux tests biochimiques ET Cellulaires Test biochimiques Tests cellulaires Protéine Ligand Fenêtre de détection Cellule Redistribution de masse Liaison de molécules Changement de masse Changement d indice de réfraction Modification de longueur d onde réfléchie Redistribution dynamique de masse Changement d indice de réfraction Modification de longueur d onde réfléchie 29

30 Quelques exemples d applications: 30 Biochemical Applications Assay Development Aggregation Direct Binding Assay With Nuclear Receptors Fragment Screening Functional Enzyme Assays HTS Kinases & Proteases Microarray Protein-Oligo (DNA / RNA) Interactions Protein:Protein Receptor Antibody Binding Antibody Antibody Binding Small Molecule Binding Antibodies / Biologics Cell-Based Applications Antibodies / Biologics Cells: Endogenous & Recombinant Primary & Stem Adherent & Suspension Freshly Cultured & Frozen Patient Samples Cell Adhesion Chemotaxis Cytotoxicity GPCRs GPCR Heterodimerization Ion channels Nuclear Hormone Receptors Phagocytosis Receptor Tyrosine Kinases Toll-like Receptors (TLRs) Transient Transfections Viral infection

31 Particularité des plaques pour tests biochimiques: L autoréférençage Deux zones dans chaque puits : référençage interne Zone Signal : liaison covalente de protéines par couplage amine Zone Référence : pas de liaison possible Compense l impact de facteurs influençant l indice de réfraction (DMSO, tampon, température, etc) Lecture de chaque zone sig ref = réponse mesurée < delta > Avantages pour le criblage de petites molécules & fragments: Zone Référence Zone Signal Pas de puits sacrifiés pour les contrôles négatifs. 31 Facteur Z plus performant qu en utilisant des puits contrôles adjacents

32 Principe de base du système Epic : tests biochimiques Mesure (pm) Lecture de la Ajout Ajout de la du protéine Lavage composé Lecture cible finale ligne de base Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Signal de base Signal post liaison Zone Signal Zone Réf Réponse = Liaison Tampon Composé Longueur d onde réfléchie Zone Signal Zone Référence 32

33 Test de liaison de petites molécules à l anhydrase carbonique Response (pm) Response (pm) Response (pm) [drug] = 5uM Buffer = 1xPBS/0.1% DMSO N = Dansylamide (250 Da) Literature K D : 760 nm K D = 795 nm R 2 = Dansylamide (nm) Sulpiride (341 Da) Literature K D : 186 um buffer benzenesa CBS acetazolamide danslyamide furosemide sulpiride 157 Da 201 Da 222 Da 250Da 331 Da 341 Da Kd ~ 850nM Kd ~ 900nM Kd ~ 20nM Kd ~ 760nM Kd ~ 500nM Kd ~ 180uM * CBS = 4-carboxybenzenesulfonamide K D = 127 um R 2 = Sulpiride (mm) 33

34 Label-free détection d activité cellulaire: 34

35 Principe de base de la technolgie Epic: tests cellulaires Fenêtre de Détection 150 nm Surface Guide d onde Substrat Cellule Liaison du ligand au récepteur Redistribution de masse dans la cellule et/ou modifications morphologiques Changement de l indice de réfraction 35 Source lumineuse large spectre Longueur d onde réfléchie Lecture finale de la Λf ligne de base delta λi en pm signe la réponse cellulaire

36 Le label-free peut mesurer différentes activités cellulaires Response Response (unit) (pm) GPCR Ion Channels Effect of anti-egfr(528) on 32nMEGF-induced response of quiescent A431cells Receptor Tyrosine Kinases Toll-Like Receptors dose-dependant activation of TLR3 in A549 EGF in A431 cells 36.2nM 18.1nM Control 9.06nM 4.53nM 2.27nM 32 nm EGF 1.13nM 0.57nM min Time (s) Viral Infection Cytotoxicity Emetidine-induced toxicity on Cardiomyocytes HeLa cells Courtesy of Len Kaczmarek, Yale University Courtesy of Moonsoo Jin, Cornell University 36 Cell-based applications

37 En résumé La technologie Label-Free EnSpire - Est basée sur les propriétés d un détecteur optique mesurant des changements d indice de réfraction (technologie Epic de Corning) - Permet de réaliser des tests biochimiques et cellulaires sans marquage - Est une méthode de lecture non invasive permettant de générer des profils cinétiques riches en information - Permet d éviter les faux positifs dûs à l autofluorescence de composés ou aux molécules de marquage elles-même - Est un système de haute sensibilité 37

38 Activité niche en protéomique fonctionnelle L apport de l EnSpire Augmentation de la flexibilité/valeur ajoutée: Biopuces en formats lames et microplaques Plus grand choix du support en fonction du nombre d échantillon à traiter Approches complémentaires au SPRI et aux puces à protéines Renforcement de l expertise : Profiling de l expression protéique AlphaLISA/AlphaScreen Criblage d activités biologiques AlphaLISA/AlphaScreen et label free Caractérisation / Validation des interactions label free 38

39 Activité niche en protéomique fonctionnelle Renforcement de l expertise : Profiling de l expression protéique AlphaLISA/AlphaScreen Criblage d activités biologiques AlphaLISA/AlphaScreen et label free Caractérisation / Validation des interactions label free Exemples d applications dans les domaines de la santé et des biotechnologies 39

40 AlphaScreen Surefire : exemples Taux de phosphorylation basal de STAT5 lorsque les cellules sont résistantes à un traitement Cellules sensibles au traitement Cellules résistantes au traitement 40

41 AlphaScreen Surefire : exemples Phosphorylation de STAT5 sur 2 lignées cellulaires stimulées par différentes cytokines Kit Dβ Cytokine 1 Cytokine 1 Cytokine 2 Cytokine 3 Cytokine 1 Cytokine 2 Cytokine 3 41

42 AlphaScreen Surefire : exemples Suivi du taux de STAT5 phosphorylé suivant le temps de stimulation par différents agonistes Composé 1 Composé 2 Composé 3 42

43 Response (pm) Response (pm) Label free : test biochimique Interaction de Rad51 avec l ADN Avec ATP WT wt mutant Y54 1 mutant Y315 2 mutant Y ADN biot streptavidine Rad Sans ATP WT wt mutant Y54 1 mutant Y315 2 mutant Y Coating Streptavidine 2 Fixation ADN biot Protein [µm] 3 Lecture ligne de base 4 Ajout Rad Lecture

44 Label free : test biochimique Binding d un composé chimique sur une protéine Composé chimique 500 Da Protéine 25 KDa 1 Coating protéine 2 Lecture ligne de base 3 Ajout composé 4 Lecture 44

45 Faculté des sciences Pierre Weigel UMR CNRS UFIP/ Université de Nantes Organigramme Responsables scientifiques IRS Yannick Jacques, UMR INSERM U892 CNRS 6299 Institut de Recherche en Santé de l'université de Nantes (IRS-UN) Responsable technique Cathy Charlier, IE Université Tel cathy.charlier@univ-nantes.fr Responsable technique Mike Maillasson, IE INSERM Tel mike.maillasson@univ-nantes.fr Puce à protéine Microcalorimétrie Enspire Label free Lauranne Paillard IE BRET/FRET-HTF Fabien Gautier CR Biacore - SPRi Enspire Technologie alpha Lauranne Paillard IE Dichroïsme circulaire, Fluorescence et anisotropie de fluorescence Fabrice Fleury Technical approaches for BioManufacturing, Biomarker & Drug Discovery services Ingénieur Qualité Lauranne Paillard IE

46 Contacts Cathy Charlier Faculté des sciences 2 rue de la Houssinière Nantes CEDEX 3 Tel cathy.charlier@univ-nantes.fr Mike Maillasson Institut de Recherche Scientifique Centre de Recherche en Cancérologie (CRCNA) 8, Quai Moncousu NANTES Cedex1 Tel mike.maillasson@univ-nantes.fr 46

47 The End

48 Back up slides

49 AlphaLISA Kits

50 AlphaScreen SureFire : 45 biomarkers Immunity Stat-1 (Y701) Stat-3 (Y705) Stat-5 (Y694/699) Caspase 9 (S196) Cancer Chk1 (S345) Chk2 (T68) c-jun (S63, S73) MKK3/6 (S189 or S207) P38 MAPK (T180/Y182) 4EBP1 (T70 and T37/46) RPS6 (S235/236, S240/244) MEK-1 (S217/221) ERK 1/2 (T202/Y204) Total ERK ½ Elk-1 (S383) eif4e (Ser209) Total ALK ALK (Y1586) ALK (Y1604) IkBα (S32/36) IKKα (S176/180) IKKß (S177/181) NFkB p65 (S536) Total Akt1 Total Akt 1/2/(3) Akt 1/2/3 (T308) Akt 1/2/3 (S473) Akt1 (T308) Akt1 (S473) mtor (S2481, S2448) p70s6k (T229, T389, T421/S424) PDK-1 (S241) Smad 2 (S465/467) Smad3 (S423/425) IGF-1 receptor β (Y1135/1136) Insulin receptor β (Y1150/1151) EGF receptor (Y1068) ErbB2 (Y1221/1222) VEGF receptor 2 (Y1175) Inflammation JNK1/3 (T183/Y185) BAD (S112) BAD (S136) CNS & Neuro-degeneration GSK3α (S21) GSK3ß (S9) Diabetes Internal Standard total GAPDH 50

51 Alpha Beads Characteristics Alpha Beads Made of polysterene Ø ~250 nm: very stable colloidal suspension Beads Density = : very slow sedimentation in water! Dextran polymer coating - prevent NS interaction (aggregation) - reactive aldehyde groups (raw beads) Strepatividin coated Donor beads SA/bead = nm SA Antibody coated Acceptor beads Ab/bead = 2-3 nm Ab 1 µg beads = 2 x10 8 beads 51 1 bead = g = 0, nanograms!

52 AlphaLISA: New Europium Acceptor Beads TAR beads (AlphaScreen) Eu-based beads (AlphaLISA) N N N S 1D g O 2 S O O S O O O O O nm energy transfer S O N 1D g O 2 S O O O N S O O O N nm nm energy transfer Eu Rubrene emission : nm Detection: nm Eu emission : nm Detection: nm 52

53 Relative Fluorescence units (%) AlphaLISA Acceptor Beads Normalized AlphaScreen vs AlphaLISA Emission Spectra AlphaScreen Emission AlphaLISA Emission nm Stronger signal with AlphaLISA Acceptor beads Less prone to matrix interferences (Hemoglobin) Optimized for serum and plasma samples Minimal inner filter effects in plasma/serum 53

54 Hemoglobin interference Hb.O 2 absorbance e (cm -1 /M) Hb.O 2 absorbance Rubrene emission e (cm -1 /M) Rubrene emission nm wavelength of lanthanide chelates emission wavelength of lanthanide chelates excitation nm 54 hemoglobin has a broad and intense absorbance spectrum up to 600 nm AlphaLISA Beads emit out of this area.

55 AlphaScreen Working Range : Affinities 1 highest biological interaction 2 biotin-streptavidin 3 very high affinity ab, receptor ligands 4 most antibodies of good quality 5 most protein-protein interactions 6 lectins am fm pm nm µm mm AlphaScreen Filtration assays, FP ELISA-like TR-FRET 55

56 Why can we detect very low affinity interactions with Alpha? Ni2+ chelate Donor beads 6His-Protein GST-Protein Anti-GST (or GSH) Acceptor beads nm concentrations of binding partners can generate high local concentrations of protein complexes reaching mm levels between beads AVIDITY effect 56