ACE C18-PFP. A C18 bonded phase with unique selectivity. Guaranteed reproducibility. Exceptional bonded phase stability

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1 ACE C18-PFP A C18 bonded phase with unique selectivity Guaranteed reproducibility Exceptional bonded phase stability Hydrophobic and pentafluorophenyl mixed mode interaction HPLC Columns AIT FRANCE - Votre expert en chromatograghie

2 Découvrez les avantages de l ACE C18-PFP une colonne HPLC C18 unique avec une phase PFP (pentafluorophenyl) extra sélective Combine les mécanismes C18 et PFP pour des mélanges difficile à séparer avec les mêmes phases seules. Améliore la rétention des composés polaires basiques pour de meilleures séparations Silice ultra inerte et pure pour des pics extrêmement fins et reproductibles. Phases greffées exceptionnellement stables mêmes pour des températures élevées L ultra faible relargage de la phase garantit la compatibilité avec l UV et LC/ MS Dimensions de colonnes disponibles pour des analyses haut débit

3 L utilisation d une silice ultra inerte et pure a différents avantages, principalement une meilleure reproductibilité, une plus longue durée de vie et des performances chromatographiques améliorées. Cependant la pureté et l inertie de la silice ne suffisent pas forcément à la séparation, les colonnes C18 produites avec une silice très pure présentent des sélectivités identiques. C est pourquoi changer de fabriquant ne permet pas de résoudre significativement un problème de séparation. Pendant plusieurs années, des spécialistes en chromatographie ont cherché des phases avec les performances et la reproductibilité des colonnes C18 mais qui fournit en plus une alternative en termes de sélectivité pour certaines applications. Comment la colonne ACE C18-PFP se différencie-t-elle? Les phases C18 dominent actuellement le marché de l HPLC. Une étude récente montre qu elles représentent 50% à 60 % des colonnes HPLC vendues. Ces dernières années l utilisation de phases PentaFluoroPhényl a augmentée grâce à la sélectivité différente que celles-ci offraient. Cependant comparées aux phases C18, les phases PFP présentaient des inconvénients comme une hydrophobicité réduite, une faible stabilité et un relargage significatif. La phase ACE C18-PFP comporte un ligand spécialement développé combinant une chaine C18 et un groupe fonctionnel PFP. Elle possède ainsi les caractéristiques d une phase C18 (hydrophobicité, stabilité et faible relargage) mais aussi les caractéristiques de sélectivité unique de la phase PFP. Dans quel cas je devrais utiliser la colonne ACE C18-PFP? Présentant les mêmes caractéristiques hydrophobes que la phase C18, la colonne ACE C18-PFP peut être utilisée pour les mêmes applications que les colonnes C18. De part son groupe fonctionnel PFP, elle est recommandée aussi pour les séparations impliquant les composés aromatiques halogénés, les régioisomères et pour les analytes présentant des contraintes de formes. Comme le démontre les applications présentées dans la brochure, la colonne ACE C18-PFP peut être utilisée pour améliorer des séparations difficiles sur colonne C18. La phase ACE C18-PFP offre une alternative en termes de sélectivité mais conserve une séparation valide pour les méthodes dans lesquelles les colonnes C18 sont spécifiées. Souvent l utilisation de la colonne ACE C18-PFP permet d éviter le développement d une nouvelle méthode ou la C18 classique est peu appropriée.

4 Pour améliorer la Résolution Le but de la séparation en chromatographie est d obtenir la meilleure résolution avec un temps d élution le plus court possible. En général, on considère une séparation réussie pour une résolution de 1.5, bien que pour des méthodes ou la reproductibilité et la rigueur soient importantes on préfèrera une résolution comprise entre 1.8 et 2.0. Cette équation nous montre les variables qui influencent la résolution La résolution Rs augmente avec N, a ou k. Cependant comme le montre le graphique (fig. 1), les pentes représentant l augmentation de Rs en fonction de l augmentation de N ou k restent faibles. L efficacité N peut être amélioré soit en augmentant la longueur de la colonne et/ou en diminuant la taille des particules. Dans tous les cas la contre pression augmente avec N donc obtenir une séparation satisfaisante en augmentant N peut entrainer de haute pression. De même pour la rétention k, l augmentation de k au-delà d une valeur de 10 est généralement un mauvais compromis entre la résolution Rs et le temps d analyse. Peu d améliorations Rs sont réalisées avec des temps de rétention croissants. On peut aussi voir une représentation graphique de cet effet dans la Fig1 cidessous Alors que Rs n augmente que faiblement avec N ou k, elle augmente fortement avec a. Des modifications de la sélectivité n ont aucuns effets sur la pression mais influencent les temps de rétentions. C est pourquoi il est plus intéressant d optimiser a pour obtenir une résolution satisfaisante entre les différents pics, gardant ainsi des contre pression et des temps de rétentions acceptables.

5 Améliore la résolution - Sélectivité ou efficacité? La sélectivité a est contrôlée principalement par la phase mobile, la température et la phase stationnaire. Ces différentes variables sont explorées pour développer la plupart des méthodes. Si la résolution n est pas suffisante avec une phase C18 3µm «standard», il est recommandé d optimiser la sélectivité(a) de la séparation plutôt que l efficacité (N) comme l illustre la figure 2 ci-dessous. En changeant simplement la phase stationnaire par une phase présentant une alternative en termes de sélectivité, on peut obtenir la résolution souhaitée sur un système HPLC sans recourir à un système UHPLC. La composition complexe de la phase mobile, les conditions de températures élevées et de PH agressif peuvent ainsi être évitées. Réduire la taille de particule de 3µm à 2µm en conservant la même phase C18 n améliore pas significativement la séparation et ajoute de fortes contraintes de pression. La colonne ACE C18-PFP offre une meilleure sélectivité pour les 3 pics non-résolus et par conséquent une séparation bien supérieure à celle obtenue en réduisant la taille de particule.

6 Mécanismes de séparations PFP La phase ACE C18-PFP offre de multiple mécanismes de rétention, des interactions hydrophobes, Pi-Pi, dipôle-dipôle, des liaisons hydrogènes et des phénomènes de sélectivité stérique. La force relative des interactions est présentée dans le tableau ci-dessous, cependant la prédominance de chaque mécanisme de rétention dépend des propriétés physico-chimiques du soluté, de sa structure et des conditions chromatographiques employées. Interactions Pi-Pi Des interactions Pi-Pi sont possibles grâce au noyau aromatique du PFP. Les phases PFP sont différentes des phases phényl. Les atomes de Fluor très électronégatifs appauvrissent le cycle en électrons. Le noyau aromatique PFP agit alors comme un acide de Lewis capable d interagir avec les donneurs d électrons (base de Lewis). Au contraire les phases Phényl qui contiennent un cycle riche en électrons (car sans groupes attracteurs) agissent comme des bases de Lewis. Interactions Dipôle-Dipôle et liaisons Hydrogènes. Les liaisons Carbone-Fluor du cycle PFP sont extrêmement polarisées. C est pourquoi les phases PFP permettent des interactions Dipôle-Dipôle et des liaisons Hydrogènes entre l analyte et l atome de fluor électronégatif. Ces différentes interactions améliorent la rétention. Les phénomènes de sélectivité stérique Le cycle aromatique rigide du PFP, combiné aux différents mécanismes de rétentions, confère des phénomènes de sélectivité stérique remarquables. La phase ACE C18-PFP conserve les multiples mécanismes de rétention de la phase PFP, que les analystes peuvent exploités pour des mélanges complexes très difficiles voir impossibles à séparer sur une phase C18 classique (utilisant seulement des interactions hydrophobes).

7 Application n 1 : Des isomères methoxybenzène substitués - C18 L exemple ci-dessus met en évidence le fait que les phases C18 ont la même sélectivité et qu elles ne permettent pas de séparer les isomères di-et monomethoxybenzène. Les différences de temps de rétentions (Illustrées par le marqueur de référence) sont dues aux effets hydrophobes liés aux caractéristiques de la silice (surface spécifique). La phase C18-PFP montre une excellente résolution pour tous les composés grâce aux mécanismes de rétentions apportés par le groupement PFP.

8 Application n 2 : Des isomères methoxybenzène substitués - PFP La traditionnelle phase PFP offre une alternative en termes de sélectivité mais provoque aussi une diminution importante de l hydrophobicité, compromettant la séparation. La phase ACE C18-PFP conserve les caractéristiques hydrophobes de la phase C18 et offre aussi une meilleure séparation qui peut être optimisée pour réduire les temps de rétentions.

9 Application n 3 : Des isomères dinitrobenzène substitués Ce test, avec des isomères dinitrobenzéniques, en condition d élution isocratique, montre que les 3 phases ont des hydrophobicités similaire. La phase C18-PFP affiche une sélectivité différente par rapport aux phases C18 pour ces isomères via des interactions dipôle-dipôle. Alors que dans ces conditions les deux phases C18 ne parviennent pas à séparer les isomères, la phase C18-PFP réussit à les séparer grâce aux mécanismes de rétention de son groupe PFP.

10 Application n 4 : Des analytes pharmaceutiques L application ci-dessus présente la séparation de plusieurs analytes pharmaceutiques connus sur une colonne ACE C18 et désigne 2 pics non-résolus. Cette séparation sur ACE C18 correspond globalement aux séparations obtenues sur les autres marques C18 ; elles ont une sélectivité identique due aux mêmes mécanismes de rétentions (principalement l hydrophobicité). Changer pour une phase PFP, modifie la sélectivité mais provoque aussi la formation de nouveaux pics nonrésolus. Dans les mêmes conditions d analyse, l utilisation d une phase ACE C18-PFP permet de séparer les 17 composants dont les analytes co-élués contrairement aux phases C18 et PFP.

11 Application n 5 : Des analytes structurellement différents Constituée de silice ultra inerte et pure comme la phase ACE C18, la phase unique ACE C18-PFP offre une sélectivité particulière. Elle permet ainsi la résolution des 13 analytes structurellement différents, évitant le développement d une nouvelle méthode.

12 Application n 6 : Des analytes acides Les mécanismes de rétention de la phase ACE C18-PFP entrainent une sélectivité chromatographique différente comparée à la phase C18 classique et un renversement de l ordre d élution de certains analytes. Application n 7 : Des catécholamines La séparation des catécholamines illustrée ci-dessus montre l importance des interactions hydrophobes de la phase ACE C18-PFP. Elles permettent la séparation de la levodopa et de l épinephrine, non résolues sur phase PFP.

13 Comparaison et tests d inertie des colonnes Conclusion En analysant la pyridine, petite molécule très basique, on peut observer des différences significatives en termes d efficacité, de forme de pics et de sélectivité. Une augmentation de la dispersion et de la rétention sont les indicateurs d interactions secondaires indésirables entre la pyridine et la phase stationnaire. Ces interactions peuvent indiquer une faible reproductibilité de la colonne. Les colonnes ACE C18 avaient été testées auparavant. Elles correspondaient aux colonnes les plus efficaces et les plus inertes disponibles. La nouvelle colonne ACE C18-PFP conserve ces excellentes performances. Les tests complets de stabilité sont inclus dans le catalogue actuel «ACE HPLC column». Un guide comparatif des colonnes C18 est aussi disponible. Il détaille les caractéristiques de plus de 50 marques de colonnes HPLC et compare leurs performances grâce à différents tests. N hésitez pas à contacter votre distributeur local pour réclamer vos exemplaires.

14 Excellente stabilité A faible PH, la détérioration de la colonne est causée par hydrolyse de la phase greffée. On observe alors une diminution de la rétention. La nature de la phase greffée, la pureté de la silice et la densité de greffage sont des paramètres essentiels. L utilisation d une silice de faible pureté, d une faible densité de greffage et des ligands plus courts accélère le clivage et réduit la durée de vie de la colonne. Etude accélérée de la stabilité - 80 C à PH 1.9 Le test de stabilité est effectué dans des conditions particulières afin d accélérer la dégradation de la colonne. La phase ACE C18-PFP subit une faible perte de rétention. Sa durée de vie est équivalente à celle de la phase ACE C18 connue pour son extrême robustesse. Elle semble donc appropriée pour des applications, ou la colonne PFP typique présentait une durée de vie réduite. Comme prévu les colonnes constituées de silice de moyenne (Zorbax SB-C18 ) et faible pureté (Waters Sphérisorb ODS2) montrent des durées de vie significativement réduites.

15 Reproductibilité garantie et totalement transposable La reproductibilité de la phase ACE C18-PFP est excellente. Les variations entre les différents lots de phase stationnaire sont souvent la cause de préoccupations clients. Les Phases stationnaires ACE ne présentent pratiquement aucun effet négatif imprévisible des silanols sur les séparations HPLC car ACE effectue un contrôle strict du procédé de fabrication et établit un cahier des charges précis pour la pureté, la sélectivité, la rétention, l efficacité et l asymétrie. Donc, comme démontré dans la figure ci-dessous, on garantit la reproductibilité de colonne-à-colonne pour toutes les colonnes ACE C18-PFP. Les chromatogrammes ci-dessus démontrent que la reproductibilité est excellente quelque soit le lot de silice ou de silane utilisé et quelque soit la taille de particule ou le diamètre de colonne choisi.

16 Faible dégreffage en UV et compatibilité LC/MS De nombreuses phases libèrent des artéfacts de la phase greffée. On observe souvent ce phénomène dans des conditions de gradient quand la ligne de base est affectée. La plupart des phases C18 ultra pure présente un faible relargage, il était donc important de s assurer que le groupement PFP greffé ne gênerait pas l analyse aux longueurs d onde UV basses ou en LC/MS. Notez que le relargage dépend de différents facteurs et peut varier d un jour à l autre et d un système à l autre. C est pourquoi il est important de comparer le dégreffage dans des conditions précises et contrôlées. Cet exemple compare les caractéristiques de dégreffage de la colonne ultra pure ACE C18 (faible relargage) avec celles de la colonne ACE PFP (fort relargage). La colonne ACE C18-PFP montre un faible relargage comparable à la colonne ACE C18, malgré la présence du groupement PFP. Comparaison du relargage en UV L analyse d une large gamme de colonne est effectuée dans les mêmes conditions. Elle confirme que les différentes marques de colonnes C18 de haute qualité présentent aussi de faibles dégreffage. Cependant l évaluation des phases comportant un greffon sélectif différent (phenyl, groupement polaire, PFP) révèle que ces colonnes non C18 présentent un fort relargage. ACE C18-PFP combine un faible relargage (comme les C18 de haute pureté) avec les avantages sélectifs qu offrent le groupement PFP.

17 Faible dégreffage en UV et compatibilité LC/MS L utilisation de phases non-c18 pour la détection MS présente un réel défi pour l analyste. Dans des cas extrêmes, le dégreffage peut inonder le signal du détecteur et masquer l analyte d intérêt. Dans l exemple suivant, le dégreffage de la colonne est contrôlée pendant les 8 à 10 min de gradient effectué. Le % de solvant organique est alors à son maximum entrainant normalement le relargage le plus important de la colonne. Le Spectre MS, série de gauche, donne les fragments m/z du relargage détecté pendant ces 10 minutes. Quant à la série de droite, le chromatogramme d ion total, il illustre le relargage obtenu pendant ces mêmes 10 minutes. Les TIC et les spectres MS pour les phases greffées polaires non C18 confirment les tests précédents, elles montrent un relargage important de ces colonnes. Le spectre MS du blanc (effectué sans colonne) permet de quantifié le relargage de fond du système. Les colonnes de type C18 et la colonne ACE C18-PFP affichent un relargage faible et négligeable. Conclusion Contrairement aux phases polaires greffées non C18, la phase ACE C18-PFP offre une sélectivité différente des C18 classiques et conserve un dégreffage faible et compatible LC/ MS.

18 Caractéristiques Colonnes ACE 3µm ACE 3µm C18-PFP ACE 3µm C18 Colonnes ACE 5µm ACE 5µm C18-PFP ACE 3µm C18

19 Colonnes ACE 10µm ACE 10µm C18-PFP ACE 10µm C18 Kits pour validation de méthode Les phases ACE sont reconnues pour offrir une reproductibilité remarquable. Pour aider la validation de méthode, un kit pratique est disponible. Il contient trois colonnes de même phase et de mêmes dimensions, comportant trois lots différents de silice. Les kits de Développement de Méthode sont disponibles pour toutes les phases et pour toutes les dimensions de colonne. Sont présentés ci-dessous les kits les plus communs.

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