Etude de la fonction de protéines de type Dirigent dans l adaptation du riz à la salinité

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1 Rapport Final Décembre 08 Action n Prog D-92RR607 Etude de la fonction de protéines de type Dirigent dans l adaptation du riz à la salinité Entre CIRAD, Département BIOS, UMR DAP 1098, TA40/03, Avenue Agropolis, F Montpellier cedex 05, France Et Institut Polytechnique de Hanoi, département de Biochimie et de Biologie Moléculaire, 1, Dai Co Viet, Hanoi, Vietnam Rappel du contexte et des objectifs du projet : Dans le cadre d une première collaboration entre nos deux institutions (thèse de doctorat soutenue en partie par l AUF), la technologie SSH (pour Suppression Subtractive Hybridization) couplée à des microarrays d ADNc a permis d identifier de nombreux gènes exprimés de façon différentielle dans les racines, gaines et limbes en réponse à un stress salin adaptatif modéré, proches des conditions naturelles au champ chez une variété tolérante et une variété sensible de riz (Hoa et al., 04). L étude de la fonction putative des gènes induits différentiellement entre les variétés sensible et tolérante a révélé leur implication dans la synthèse des parois cellulaires et surtout dans le processus de lignification. Des observations histologiques ont révélé que les racines de la variété tolérante sont plus différenciées que celles de la variété sensible IR31785 dans les conditions de stress salin avec la formation complète de l épiderme et de l exoderme. Ces résultats suggèrent fortement que la lignification des racines et des gaines chez la variété tolérante permettrait de bloquer l entrée de Na+ dans les parties aériennes via la voie apoplastique en conditions de stress salin. Parmi les gènes candidats identifiés, nous portons une attention particulière à deux gènes codant les protéines de type dirigent en raison de leur induction durable après 3 jours de stress. Des études antérieures ont suggéré que ces protéines sont impliquées dans le couplage initial des monolignols permettant le dépôt de lignine à travers tout le paroi de la cellule (Davin et al., 1997 ; Burlat et al., 01). Les résultats des analyses de RT-QPCR ont confirmé l induction spécifique par le stress salin de ces deux gènes chez la variété tolérante. Il reste à savoir quels sont les rôles exacts de ces deux gènes dans l adaptation du riz à la salinité. L objectif du projet collaboratif de deux ans (06-07) qui s est également poursuivi en 08 était donc de réaliser une validation de ces gènes par une inactivation de leur expression (interférence de l ARN). La production des lignées transgéniques devait être suivie d une analyse physiologique fine (teneurs en Na+ et K+ des plantes par la spectrométrie d absorption atomique, détermination du transport apoplastique par le traceur fluorescent PTS, étude de la lignification dans les racines des transformants par des observations histologiques et évaluation de la tolérance des plantes à la salinité). 1

2 Résultats obtenus : Une première étape de la validation des gènes est d inactiver leur expression. Des lignées d insertion pour les deux gènes codant pour des protéines de type dirigent n étant pas disponibles dans les collections internationales, notre stratégie a consisté en une inactivation par RNAi médiée par le transfert d une cassette ADN-T conduisant à la formation d ARN en épingle à cheveu. Deux variétés ont été utilisées pour la transformation : la variété japonica Nipponbare sensible à la salinité qui est également la variété modèle pour la génomique du riz et la variété indica Nona Bokra, cultivar traditionnel tolérant à la salinité. Ces deux cultivars avaient été utilisés pour constituer les banques SSH. Choix des gènes et préparation de vecteurs RNAi Les deux gènes codant pour des protéines de type dirigent Dirigent1 et 2 (Os10g188 et Os12g26380), induits par les stress biotiques et abiotiques interviennent dans les étapes terminales de synthèse de la lignine ( Davin et Lewis 05, Curr Opin Biotechnol. 05 Aug;16(4):407-15). On sait que la majeure partie de la différence de tolérance entre variétés tolérantes/sensibles à la salinité chez le riz vient de la fuite apoplastique (passage dans l apoplaste des sels+eau). L hypothèse conduisant cette recherche est donc qu une augmentation de la lignification en réponse au stress salin pourrait limiter cette fuite apoplastique. L inactivation de ces gènes doit donc conduire à une sensibilité accrue à la salinité en conditions salines, qui peut être accompagnée d autres altérations morpho physiologiques. Comme un des deux gènes codant pour la protéine dirigent n a pu être amplifié, trois autres gènes ont été utilisés : Un gène ASR1 (Os11g067), dont la fonction encore sujette à discussion (Facteur de transcription), mais dont la surexpression chez certaines espèces conduisent à une tolérance au stress hydrique/salin (Kalifa et al 04, Biochem J. 15 :381, ; Goldgur et al 07 Plant Physiol 143(2): ). Une plus grande sensibilité est attendue chez les plantes RNAi. Le gène RAV1 (Os01g ) qui est un membre de la famille des facteurs de transcription AP2/ERF, qui est supposé être un régulateur négatif de la réponse au stress abiotique, sous exprimé en condition de stress (Yamasaki et al 04 Plant Cell 16: ). Une augmentation de la tolérance est attendue chez les plantes RNAi. Le gène CHAC (Os02g26700), de fonction inconnue mais qui est supposé être associé a un antiporteur Ca2+/H+ qui intervient dans la tolérance au Na+ (E. coli) ou au Ca2+ quand il est sur-exprimé ( Ivey DM et al 1993 J Biol Chem. 268(15): ). Une plus grande sensibilité est attendue chez les plantes RNAi. Des amplicons de pb ont été amplifiés à partir de ces 4 gènes et introduits en orientation répétée inversée dans le vecteur pbios738 (fourni par W. Paul, Biogemma, France) par recombinaison Gateway. La conformité de la cassette RNAi est vérifiée par séquençage avant d être transférée dans la souche d Agrobacterium EHA105. La cassette vide ADN-T a également été introduite pour servir de témoin négatif de transformation. Production de transformants primaires (T0) Les 5 construits ADN-T ont été introduits dans des cals embryogènes de scutellum d embryons matures des variétés Nipponbare et Nona Bokra selon la méthode décrite par Sallaud et al 03 Theor Appl Genet 106 : Aucune différence dans l efficacité de transformation n a été notée entre traitements et construits. Le nombre d événements de transformation indépendants conservés figure dans le tableau ci-dessous : 2

3 Construit Cultivar Nipponbare Nona Bokra pbios pbioslr15 (Dirigent2) pbioslr (CHAC) pbioslr1 (ASR1) 21 pbioslr6 (RAV1/2) Tous les événements de transformation présentaient une morphologie et une fertilité non affectées par rapport au témoin de transformation pbios738. Des échantillons foliaires de tous les événements ont été prélevés et l ADN génomique isolé pour une analyse de type PCR ou Southern ultérieure. Première évaluation des lignées T1. 5 événements de transformation ont été sélectionnés au hasard par construit (5) et par génotype (2). 30 grains de chacun de ces événements ont été inoculés en boite de Petri carrée (xcm, contenant du milieu MS additionné de 100mM de NaCl, ou du milieu MS additionné de 100mM Mannitol (10 grains par condition). Les traitements appliqués sont de stringence moyenne pour essayer de détecter des cas d hypersensibilité attendus pour la plupart des gènes étudiés si l inactivation est effective. Les croissances sous stress des tiges et des racines ont été évaluées. Les données sont en cours de traitement mais aucune hypersensibilité létale n a été observée sur l ensemble des construits, génotypes et conditions de croissance testés. Les plantes ayant subi le criblage ont été transférées en serre. Des altérations morphophysiologiques en ségrégation ont été observées dans les lignées ayant intégré le construit pbioslr15 (Dirigent2) : Chez la variété Nona Bokra, la lignée pbioslr présentait des descendants nains et stériles (6 plantes sur 30) tandis que la lignée pbioslr présentait des plantes fertiles mais dont les feuilles présentaient une chlorose s accentuant avec le développement de la plante (2 plantes sur 30). Chez la variété Nipponbare, une lignée pbioslr15 présentait un port semi nain avec développement de groupes de talles à partir des bourgeons nodaux (3 plantes sur 30). Concernant les autres construits, pour pbios LR1 (ASR1) un événement de la variété Nona Bokra présentait un port rampant (3 plantes sur 30) et pour pbios LR (CHAC), un événement de la variété Nipponbare présentait des talles surnuméraires à partir de quelques entre nœuds (1 plante sur 30) Le fait que ces altérations apparaissent avec un ratio évoquant une récessivité, n aient pas été observées dès la génération T0 et ne sont pas convergentes suggère qu elles ne sont pas dues à l expression du construit RNAi, mais plutôt à une variation/mutation induite par la culture in vitro ou l intégration de l ADN-T. Les autres plantes et les autres événements présentaient une morphologie et une fertilité normales non différente du témoin de transformation. Ces résultats suggèrent que les différences à rechercher au sein de ces lignées d inactivation sont sans doute des modifications physiologiques plus discrètes et/ou doivent être mises en évidence dans des conditions et à un stade de développement se rapprochant plus du stress agronomique. Perspectives : Les étapes suivantes devraient donc être conduites dans les prochains mois : En France : Exploitation statistique des premiers résultats de croissance in vitro sous stress Vérification de l intégrité des construits par analyse de type Southern et de l inactivation des gènes cibles (sous régulation des gènes Q-RT-PCR et éventuellement formation de sirna spécifiques) pour sélectionner les lignées. Au Vietnam : Analyse physiologique fine des lignées où l inactivation est démontrée : détermination des teneurs en Na+ et K+ des plantes par la spectrométrie d absorption atomique, détermination du transport apoplastique par le traceur fluorescent PTS, dosage de la lignification dans les racines des transformants et évaluation de la tolérance des plantes à la salinité en conditions hydroponiques plus proches des conditions agronomiques. Les lignées RNAi sont en cours de transfert au partenaire Vietnamien. 3

4 Echanges scientifiques réalisés: Une mission d expertise a été conduite du 4 au 14 Décembre 06 par Donaldo Meynard et Christophe Périn (UMR DAP). Elle a permis : -De rencontrer plusieurs responsables au sein de l IPH, Mme le Professeur Nguyen Thi Xuan Sam, chef du Département de Biochimie et de biologie moléculaire, Mme le Professeur To Kim Anh, vice-directrice de l institut de Biotechnologies et de technologies Alimentaires à l institut polytechnique de Hanoi. Les discussions ont porté sur la poursuite du projet AUF mais également sur la mise en place de futures collaborations et échanges d étudiants. Nous avons ainsi identifié une possibilité de collaboration complémentaire au projet AUF dans le domaine de la bioinformatique. L IPH ne bénéficie d aucun appui dans ce domaine et il serait souhaitable de former un ou deux étudiants dans le cadre d un master Bioinformatique en France, qui pourront à la suite former des étudiants et apporter un appui à l IPH. -De transférer le protocole de transformation génétique du riz dans le laboratoire du Dr Le Quang Hoa par la formation de plusieurs étudiants accueillis dans le laboratoire du Dr Le Quang Hoa : Va Kim Dung, Etudiante en 5eme année à l IPH Nguyen Mang Hung, Etudiant en Master 2eme année à l IPH Nguyen Van Duy Etudiant en thèse première année -De transférer des ressources moléculaires : deux vecteurs pour l analyse fonctionnelle des gènes du riz (sur-expression et RNAi) et un vecteur contrôle qui permet d exprimer constitutivement le gène rapporteur GUS afin de contrôler l efficacité de transformation au laboratoire. Une mission d expertise de 10 jours a été réalisée par le Pr Pascal Gantet en Avril 07. Durant cette visite Pascal Gantet a rencontré le Pr Le Quang Hoa et visité l Université Polytechnique de Hanoi, dispensé des cours en biotechnologies végétales et en français scientifique et présenté UM2 et le Cirad. Les perspectives de collaboration ont été discutées avec le service des relations internationales de l Université. Des contacts ont été également noués avec le Pr Vinh de la faculté d agronomie. Ces contacts ont permis de déboucher sur un programme Hoa Sen Lotus qui a été accepté. D autre part le Pr Gantet a encadré et analysé les résultats des étudiants et techniciens vietnamiens impliqués sur le projet AUF et d autres projets. Une visite du Pr Le Quang Hoa de jours a été réalisée en décembre 07 pour faire le point sur l avancée du projet et préparer les amorces nécessaires à la réalisation de Q-RT-PCR Valorisation scientifique : Le travail a fait l objet d une présentation aux rencontres AUF Biotechnologies végétales qui se sont tenues à Rennes du 30 juin au 3 juillet 08. Un article sera préparé quand les données de validation fonctionnelle seront complètes Equipement acheté chez le partenaire vietnamien : Le projet AUF a permis d équiper le laboratoire du Dr Le Quang Hoa d une hotte à flux laminaire, nécessaire à la culture in vitro végétale et d une chambre climatique pour tester la réponse en conditions contrôlées de plants de riz à un stress salin. Le premier équipement était indispensable pour réaliser des transformations génétiques, le deuxième équipement était requis pour évaluer l effet de la salinité sur les plantes transgéniques afin de conclure sur le rôle des Dirigent dans la tolérance à la salinité. En seconde année des consommables ont été achetés. Coordonnées des agents ayant participé au projet côté français: 4

5 Emmanuel Guiderdoni, directeur de recherches Christophe Périn, Chercheur Donaldo Meynard, Ingénieur Pascal Gantet, Professeur UMR DAP CIRAD TAA 96/ Montpellier cedex 5 France guiderdoni@cirad.fr perin@cirad.fr meynard@cirad.fr pgantet@univ-montp2.fr 5