SOMMAIRE STRUCTURE D'ACCUEIL : LE CENTRE DE GENETIQUE MOLECULAIRE... 2

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1 SOMMAIRE INTRODUCTION... 1 STRUCTURE D'ACCUEIL : LE CENTRE DE GENETIQUE MOLECULAIRE LE C.N.R.S LE CENTRE DE GENETIQUE MOLECULAIRE Historique Moyens financiers Organisation scientifique, personnel et structure : L'Équipe de Monsieur COHEN... 3 DEFINITION ET SITUATION DE LA PROBLEMATIQUE : EXPRESSION ET PURIFICATION DE PROTEINES PARAMECIE Un organisme unicellulaire Particularités génétiques Modèle d'étude LA FUSION MEMBRANAIRE Généralités Les trichocystes : un modèle d exocytose régulée PURIFICATION DES PROTEINES Pour quoi faire? Les différentes stratégies... 7 MATERIEL ET METHODE LES OUTILS Tetrahymena thermophila «Tandem Affinity Purification Tag» LA STRATEGIE : TETRAHYMENA ND9 - TAPTag LES TECHNIQUES DNAzol La PCR... 11

2 3.3.3 La purification de protéines étiquetées avec le TAPTag Tampons Protocole RESULTATS SELECTION DES TETRAHYMENA THERMOPHILA TRANSFORMES PURIFICATION DE ND9 GRACE AU TAPTag Premier essais Vérification DISCUSSION SELECTION DES TETRAHYMENA THERMOPHILA FAIBLE QUANTITE DE PROTEINES APRES PURIFICATION TAPTag INTERET DU PROMOTEUR MTT CONCLUSION LEXIQUE ET ABREVIATIONS BIBLIOGRAPHIE... 25

3 INTRODUCTION - 1 -

4 CHAPITRE 1 STRUCTURE D'ACCUEIL : LE CENTRE DE GENETIQUE MOLECULAIRE 1.1 LE C.N.R.S. Le Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S.) a été créé en 1939, à la suite de la fusion du Conseil Supérieur de la Recherche Scientifique (C.S.R.S.), de la Caisse National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S.), et du Centre National de la Recherche Scientifique. Appliquée (C.N.R.S.A.). Sa mission première est de «produire du savoir» au service de la société. Le C.N.R.S., établissement public national à caractère scientifique et technologique (E.P.S.T.) est le premier organisme de recherche fondamentale en Europe. Il est placé sous la tutelle du Ministère français de la Jeunesse, de l Enseignement et de la Recherche. Avec personnes, un budget qui s'élève à 2457,342 millions d'euros TTC pour l'année 2001, une implantation sur l'ensemble du territoire national, le C.N.R.S. exerce son activité dans tous les champs de la connaissance en s'appuyant sur 1235 unités de recherche et de services gérés administrativement par 18 délégations. Le C.N.R.S. a un budget individualisé par rapport à son ministère de tutelle. Dans la pratique, cette autonomie financière se trouve limitée, car l'exécution du budget du C.N.R.S. est soumise à l'ensemble des règles de la comptabilité publique. Le C.N.R.S. est une entité distincte de l'etat, juridiquement autonome. Il peut prendre des engagements et conclure des contrats en son nom. Il peut défendre ses droits et son patrimoine en justice. L'établissement du C.N.R.S. est représenté en justice par le directeur général. Les personnels du CNRS sont des fonctionnaires depuis 1984, régis par le statut de la fonction public. La qualité de fonctionnaire confère un certain nombre de droit et de garanties. Les chercheurs sont évalués, selon leurs spécialités, par une section du Comité National qui a pour mission d évaluer et de conseiller la qualité des travaux réalisés par les équipes. De nombreux échanges et partenariats sont réalisés par le CNRS : avec les universités et les grandes écoles, avec les entreprises, avec l étranger Le CNRS est divisé en deux Instituts Nationaux, puis en département, comme celui des sciences de la vie. Ce dernier a pour mission de décrire et de comprendre le vivant, du simple au complexe. Ce département regroupe près de 5650 personnes (chercheurs, ITA, ) - 2 -

5 1.2 LE CENTRE DE GENETIQUE MOLECULAIRE Historique Le C.G.M., associé à l'université Pierre et Marie Curie depuis 1980 et affilié à linserm, est l'un des plus anciens laboratoires du C.N.R.S. Créé en 1946, il portait le nom de Génétique Physiologique. Il prit le nom de Centre Génétique Moléculaire en 1967 sous la direction de Monsieur Piotr Slonimski. La direction est assurée par Monsieur Aggerbeck (annexe 1) Moyens financiers Les ressources du laboratoire comprennent les attributions faites par le C.N.R.S. et les Universités, et des ressources propres attribuées dans le cadre de contrats ou de subventions. La dotation de soutien de base attribuée par la direction des Sciences de la Vie du C.N.R.S. est de 1,5 millions d'euros T.T.C. Elle distingue : les crédits alloués à chacun des départements ; les crédits affectés au Directeur pour l'animation scientifique ; les crédits affectés aux services communs (bibliothèques, acquisition et maintenance des équipements communs ) ; Les forfaits pour les dépenses d'infrastructure Organisation scientifique, personnel et structure : Le CGM regroupe 57 chercheurs, 26 enseignants chercheurs et 58 ITA ainsi que 60 doctorants, chercheurs en stage post-doctoral, visiteurs et stagiaires étudiants en 26 équipes formants 3 départements (Département ARN ; Département Développement et Département Génétique des fonctions cellulaires). La mission et l'orientation générale des recherches qui y sont poursuivies sont déterminées par le C.N.R.S. Elles sont triples : Génétique des fonctions cellulaires, Génétique du développement, Département ARN. Le «Conseil de Laboratoire», est composé de membres élus et des responsables des Départements. Le sous-directeur et la personne chargée des relations extérieures peuvent y prendre part. Ce conseil donne son avis sur les questions relatives à la vie des unités de recherche ( organisation, budget, condition de travail... ). Le «Conseil Scientifique» examine les programmes de recherche et la politique scientifique de l'unité. La «Commission des ITA» gère toutes les questions relatives à l'emploi, les conditions de travail, la formation du personnel... Le «Comité Hygiène et sécurité» étudie les questions relatives à la sécurité du travail et propose des mesures afin de les améliorer L'Équipe de Monsieur COHEN Cette équipe fait partie du Département Génétique des fonctions cellulaires. Le département a reçu euros pour l'année L'équipe de Monsieur Cohen a reçu euros pour l'année L'équipe se compose de 6 chercheurs, 3 ITA et d'étudiants

6 CHAPITRE 2 DEFINITION ET SITUATION DE LA PROBLEMATIQUE : EXPRESSION ET PURIFICATION DE PROTEINES 2.1 PARAMECIE Un organisme unicellulaire La paramécie est un protozoaire cilié (environ 120 µm de long) commun dans les eaux douces stagnantes. Elle possède une organisation complexe pour un unicellulaire (figure 1). En effet, quand on décrit cet être vivant, on peut observer presque toutes les fonctions vitales présentes chez la plupart des animaux. On retrouve ainsi des vacuoles pulsatiles qui font office de rein. On voit un goulet suivi de vacuoles digestives, ainsi qu'un pore anal, comparable au tube digestif chez l'animal. Toutes ces fonctions sont au sein d une cellule unique. Figure 1 : représentation schématique de l organisation complexe d une paramécie Particularités génétiques Cet organisme est un modèle de choix pour ses particularités génétiques : il possède 2 types de noyaux, un micronoyau germinal diploïde et un macronoyau somatique très polyploïde dérivant du noyau germinal (800 n). De plus, au cours du temps, le macronoyau est remanié puisque, à chaque événement sexuel (autogamie et fécondation), il est détruit tandis qu un nouveau se développe. L'autre particularité génétique de la paramécie est son code génétique qui ne suit pas parfaitement la règle universelle de la traduction des codons. En effet, le génome de Paramecium est très riche en Adénosine et Thymidine. De plus il n'existe qu'un seul codon stop (UGA), car les deux autres - 4 -

7 sont utilisés comme des codons normaux et sont traduits en glutamine. UAA et UAG sont deux codons stop dans la grande majorité des organismes. UAA est fréquent dans le génome de paramécie (fréquence : 0,48), mais il est le codon le plus utilisé pour la glutamine (Gln ou Q) Modèle d'étude Au sein du Centre de Génétique Moléculaire, les études sur les paramécies portent sur différents aspects de sa biologie. Un des sujets concerne le cytosquelette et la duplication des corps basaux des cils. En effet, la morphogenèse cellulaire est déterminée par le patron spatio-temporel de duplication des corps basaux ciliaires, équivalent des centrioles des métazoaires. Après avoir récemment découvert un phénomène d'extinction génique dépendant de l homologie chez la paramécie, probablement analogue à l interférence à ARN, l équipe de Monsieur COHEN en étudies les mécanismes. Le laboratoire étudie aussi des phénomènes d hérédité non Mendélienne liés à la différenciation du macronoyau, notamment l hérédité du type sexuel et de certains défauts d exocytose des trichocystes. La voie de sécrétion régulée concerne de volumineux organites appelés trichocystes. Ils étudient, d une part, les étapes de biogenèse de ces granules de sécrétion et, d autre part, le mécanisme de fusion membranaire lors de leur exocytose en réponse à une stimulation externe. 2.2 LA FUSION MEMBRANAIRE Généralités La cellule est divisée en de très nombreux compartiments. Les compartiments ont des interactions directes ou indirectes entre eux. Beaucoup d échanges se font à l aide de fusions membranaires. Les cellules eucaryotes exportent les protéines dans le milieu extérieur par une voie dite de sécrétion qui comprend la synthèse des protéines au niveau du réticulum endoplasmique rugueux, leur transit et éventuelles modifications dans l'appareil de Golgi et leur migration à l'intérieur de vésicules ou de granules denses jusqu'à la membrane plasmique. Toutes les étapes de ce trafic impliquent des événements de bourgeonnement de vésicules à partir du compartiment donneur et de fusion de ces vésicules avec un compartiment accepteur. La dernière de ces fusions, avec la membrane plasmique, est appelée exocytose. L exocytose est une fusion membranaire particulière car elle consiste à mettre en contact une vésicule intérieure à la cellule avec sa membrane plasmique : c est un mouvement vésiculaire vers l extérieur de la cellule. Les mécanismes moléculaires de la fusion membranaire, tout particulièrement lors de l'exocytose, sont activement étudiés dans de nombreux systèmes et certaines protéines, appelées SNAREs (Soluble NSF Attachement Protein Receptors), semblent être des éléments clés dans la fusion membranaire (Rothman, 1994)1; (Weber et al, 1998)

8 2.2.2 Les trichocystes : un modèle d exocytose régulée Chez la Paramécie, les vésicules de sécrétion ou trichocystes, par leur nombre (environ 1 millier), leur grande taille (3 à 4 µm) et la complexité de leur organisation, offrent un excellent modèle pour l'étude de la sécrétion régulée. La biogenèse de ces trichocystes implique une conversion protéolytique de molécules précurseurs et la cristallisation des produits à l'intérieur des vésicules en cours de maturation. Une étude antérieure de plusieurs mutants présentant une cristallisation incomplète a montré qu'une étroite coordination entre le trafic membranaire et le processus de maturation est nécessaire pour aboutir à la formation d'un trichocyste fonctionnel (Gautier et al., 1994) 3. De plus, ces granules denses appelés trichocystes, servant à la défense contre les prédateurs, sont ancrés sous la membrane plasmique en état de pré-fusion membranaire. Sous l'impulsion d'un stimulus externe, la membrane du trichocyste fusionne avec la membrane plasmique et le contenu du trichocyste est expulsé en quelques millisecondes. Il s'agit donc d'exocytose "régulée". Cette exocytose n'est pas vitale pour la cellule, ce qui fait que des mutants peuvent être obtenus (figure 2). Grâce à ces mutants, par complémentation, par croisement on a pu bien mettre en place un modèle du phénomène de l exocytose régulé des trichocystes. Une des protéines essentielles pour que le trichocyste soit fonctionnel quand il s ancre à la membrane cellulaire est la protéine nd9. Figure 2 : schéma synthétisant la biogenèse des trichocystes, ainsi que leur exocytose régulée

9 2.3 PURIFICATION DES PROTEINES Pour quoi faire? Pour bien comprendre un mécanisme cellulaire, il est important de connaître les protéines qui le constituent. Pour ces raisons, la génétique classique isole, tout d abord, des mutants sur le mécanisme étudié, puis à l aide de la biologie moléculaire, on recherche la mutation génétique et donc le gène cible. Enfin, la protéine qui est traduite peut-être, à son tour, étudiée pour comprendre son rôle et ses interactions. Mais pour cela, il faut extraire cette dernière d où la nécessaire purification. Quand la protéine est bien purifiée, il est possible de l étudier biologiquement à savoir s il s agit d une enzyme ou non, de l étudier physiquement comme par cristallographie En bref, la protéine isolée ou le complexe pourra être étudié grâce aux biotechnologies disponibles à l heure actuelle Les différentes stratégies Pour pouvoir étudier et isoler les protéines de paramécie, il est fréquent d utiliser un système hétérologue, et faire sur-exprimer la protéine choisie. Plusieurs stratégies ont déjà été testées pour exprimer des protéines de paramécie chez E. coli. Ainsi, la mutagenèse dirigée a été utilisée afin de remplacer les codons gênants pour la traduction de la séquence (Linder et al. 2000) 4. Une autre stratégie consiste à insérer le gène chez E. coli et à supprimer la lecture des codons stop (Cohen et al. 1990) 5. Une dernière stratégie est de faire des gènes de synthèse par PCR en retirant ainsi tous problèmes de codons stop (Vayssie et al. 2000) 6. La stratégie que nous avons choisie est celle d'utiliser un organisme appartenant à la famille des ciliés, qui fonctionne comme Paramecium. Pour pouvoir purifier la protéine désirée (Nd9) on utilise les caractéristiques du TAPTag. L objectif final est d insérer devant la protéine de fusion Nd9-TAPTag, le promoteur MTT de Tetrahymena thermophila (SHANG et al. 2002) 7 qui est inductible au cadmium et qui exprime fortement le gène qu il régule, soit 30 fois plus que le promoteur tubuline qu il le régule actuellement. Quand le plasmide contenant ce promoteur est arrivé au CGM, sa séquence n était pas complètement connue : il a fallu en premier lieu le séquencer pour pouvoir l utiliser

10 CHAPITRE 3 MATERIEL ET METHODE 3.1 LES OUTILS Tetrahymena thermophila Tetrahymena thermophila est un organisme très proche de la paramécie. Tetrahymena est bien étudié, ce qui, en fait un outil facile car les conditions de culture sont assez simples et maîtrisées (ASAI & FORNEY, 2000) 8. Tetrahymena est de choix pour notre stratégie car il possède le même code génétique que la paramécie. Contrairement à cette dernière, il ne fait pas d autogamie, ce qui permet d'isoler des clones et de stabiliser une lignée de transformant. Comme Paramecium, Tetrahymena possède un micronoyau et un macronoyau. Ce dernier est 20 fois la copie du micronoyau (40n). A chaque événement sexuel, le macronoyau est détruit puis reconstruit. La culture de Tetrahymena permet un grand nombre de cellules proche de Cellules.mL -1, ce qui est très largement supérieur aux rendements obtenus avec les paramécies pour un même volume de culture, bien que ces dernières soient 10 fois plus grosses. En effet, pour 1 litre de culture de Tetrahymena, nous obtenons près de 8 ml de culot Pour le même volume de culture, nous aurions près de 400 µl de culot. T. thermophila est donc de choix car on peut obtenir simplement une grande quantité de protéines sans avoir à gérer les problèmes traductions spécifiques à la famille des protozoaires ciliés «Tandem Affinity Purification Tag» Le «Tandem Affinity Purification Tag» (TAPTag) est une méthode de purification protéique (Puig et al. 2001) 9. Le TAPTag est une séquence protéique qui est traduite en fusion avec la protéine initiale. Cette séquence possède trois régions misent côte à côte, ici en C terminale de la protéine, et ayant chacune une particularité utile à la purification (Figure 3). CBP Tag site Protein A ATG 5 TEV 3 Figure 3 : Les trois parties du TAPTag sont : un site de fixation à la calmoduline (CBP Tag : calmodulin binding protein Tag) en présence de calcium (Ca2+) suivit d un site de clivage TEV (site TEV), et enfin une protéine A

11 La protéine A est très affine de la partie constante des immunoglobulines G (IgG). Le site TEV est une séquence particulière de 7 acides aminés que la protéase TEV reconnaît et coupe, libérant ainsi deux segments protéiques : ici, la protéine A d un coté et la protéine cible avec le site pour la calmoduline de l autre. Ce dernier site d affinité se fixe à la calmoduline en présence de calcium. En effet, si on chélate le Ca 2+ par de l EGTA, la protéine se sépare de la calmoduline. 3.2 LA STRATEGIE : TETRAHYMENA ND9 - TAPTag Le projet de transformer Tetrahymena thermophila avec nd9 faisant partie des travaux de l équipe, la construction nd9-taptag a été faite. Ensuite, pour pouvoir transformer Tetrahymena, il a fallut envoyer cette construction aux Etats-Unis, afin qu un laboratoire ayant le matériel de biolystique, puisse bombarder et transformer quelques cellules. Le laboratoire de Gif-sur-Yvette a donc reçu quelques clones transformés qui étaient sous pression taxol. La cellule comporte deux isoformes de β tubulines (BTU1 et BTU2) qui codent pour des protéines identiques. La transformation a été faite sur une souche de T. thermophila sélectionnée : Cu 522. Cette souche a été sélectionnée car la β tubuline 1 (BTU1) possède une mutation qui rend la souche résistante au Nocodazole et sensible au Taxol, qui sont deux drogues antagonistes (figure 4). Le taxol est un cytostatique efficace car il renforce la formation et la polymérisation de microtubules qui immobilise et tue la cellule. WT BTU1 BTU2 Cu 522 BTU1 BTU2 Taxol sensible Figure 4 : Dans la souche sauvage deux gènes codent pour la même protéine de β tubuline (BTU1 & BTU2). la mutation présente sur le gène BTU1 de la souche Cu 522 la rend sensible au taxol et résistante au nocodazole. La transformation se fait sur la souche Cu 522 et la sélection des transformants se fait par la récupération du phénotype sauvage qui est dû à la distruction du gène muté et par l intégration de la construction. La construction est nd9-taptag dans le gène BTU1 de Tetrahymena. Quand cette séquence remplace le gène initial de β tubuline, T. thermophila devient résistant au taxol. En effet, si on supprime l expression de ce gène, BTU1, le taxol a un effet moindre sur la polymérisation des β tubulines et les cellules peuvent ainsi survivrent grâce à BTU2, ce qui donne un phénotype sauvage aux cellules transformées. Sachant que la division nucléaire de Tetrahymena n est pas toujours équitable au niveau de la division du macronoyau, il est possible que certains clones reçoivent plus de gène transformé que d autres. Ainsi, la cellule fille possédant moins de gène BTU1 modifié est plus sensible à la toxicité du taxol. Afin de sélectionner les cellules comportant le maximum de gène transformé au sein du macronoyau, il suffit d augmenter la concentration de taxol dans le milieu. Ainsi, au fur et à mesure du temps, on augmente la pression taxol pour pouvoir isoler des clones transformés à 100 %

12 Pour contrôler la totale transformation des clones isolés sous pression taxol, on vérifie la présence ou non des gènes cibles. Pour cela, après culture, on fait des PCR sur le gène transformé (BTU1 avec au milieu nd9-taptag) ainsi que le gène non transformé (BTU1). L expression du gène nd9-taptag est régulée par le promoteur tubuline qui est un promoteur constitutif. On peut donc, après contrôle de la parfaite transformation des T. thermophila, faire une culture en masse de ces derniers. On aura donc la production du TAPTag. Quand la culture en masse arrive à une grande concentration de cellules ( Cellules par ml de culture), on les récupère et en extrait les protéines. Comme nd9 est une protéine soluble et que le TAPTag aussi, l extraction protéique est assez simple : TRITON et potter. Finalement, la protéine nd9 est isolée en deux colonnes successives en utilisant les caractéristiques de la séquence TAPTag. 3.3 LES TECHNIQUES DNAzol Pour pouvoir effectuer une PCR sur le génome des Tetrahymena thermophila transformés, il est important, en premier lieu, d extraire l ADN. Pour cela, on utilise le DNAzol de Life Technologies. Ce très simple kit permet de précipiter très efficacement l ADN, puisque contrairement à la méthode classique, on évite le phénol et donc une perte significative d acide nucléique. On prélève 100 µl de milieu de culture avec une forte concentration de cellules dans un eppendorf, dans lequel on rajoute 1 ml DNAzol. Ensuite on vortex bien l ensemble avant de les mettre dans la centrifugeuse à g pendant 10 minutes à 4 C. Après cette première centrifugation, où les protéines ont été précipitées, on prélève le surnageant que l on met dans un nouvel eppendorf avec 0,5 ml d'éthanol 100 %. A nouveau, on mélange bien avant de mettre les tubes à g pendant 10 minutes à 4 C. Pour nettoyer l ADN précipité et ainsi enlever les contaminant, on élimine délicatement le surnageant sans perdre le culot et on rajoute 1 ml d'éthanol 70 %. Puis on met les tubes dans la centrifugeuse à g pendant 10 minutes à 4 C. Afin que l ADN soit le plus propre possible, on réalise cette opération deux fois de suite. Finalement, on sèche le culot en vidant le surnageant délicatement et en mettant les eppendorf à 37 C. Quand le tube est bien sec et que l on devine à peine le culot presque transparent, on reprend l'adn dans 100 µl d'h2o. On peut mesurer la concentration exacte que contiennent ces tubes de deux façons. La plus simple étant d observer la densité optique de 2µL d ADN dans 100 µl d H 2 O dans un spectrophotomètre, qui nous donnera directement sa concentration finale. L autre méthode consiste à faire migrer un aliquote bien défini d ADN sur gel d agarose en parallèle avec une «échelle» de marqueurs de poids moléculaires dont les bandes ont des concentrations différentes et bien connues auxquelles notre dépôt sera comparé

13 3.3.2 La PCR La «Polymerase chain reaction» (PCR) nous est très utile pour vérifier la complète transformation des Tetrahymena thermophila par la construction nd9-taptag. Les oligonucléotides utilisés (figure 5) sont Btu1 (5 CAGAGCTATCTTGATGGAC 3 ), Nd9 (5 GAACATTGAAGCCTTCCTC 3 ) et pbich3 (5 TATTACAACAACAGTAAGATGC 3 ). Le couple d amorces PCR pour voir si le clone est transformé est Nd9 avec pbich3. Tandis que le couple d amorces PCR pour savoir si le clone n est pas transformé est BTU1 avec pbich3. Btu1 5 BTU1 3 gène non transformé Nd9 pbich BTU1 Nd9 TAPTag 3 BTU1 3 gène transformé pbich 3 Figure 5: schéma représentant la position des oligonucléotides sur le gène présent dans les T. thermophila transformés on non. Les oligonucléotides sont utilisés pour rechercher si les cellules sont bien transformées, et cela complètement ou non. Les réactions dans 100 µl contiennent 10 mm de chaque dntp, 10 pmol de chacun des oligonucléotides du couple d amorces PCR, et d 1 unité de Taq DNA polymérase dans le tampon qui lui est approprié. Le programme PCR commence par 3 minutes à 95 C. Puis il continue par 30 cycles de dénaturation à 92 C pendant 30 secondes, d hybridation à 50 C pendant 15 secondes, et de polymérisation à 72 C pendant 1 minute. Enfin, il se termine par 2 minutes à 72 C. Le produit PCR est ensuite déposé sur gel à 1% d agarose avec BET. Après migration à 100V, il est révélé grâce aux UV La purification de protéines étiquetées avec le TAPTag Tampons Pour cette manipulation de purification TAPTag, quatre tampons sont nécessaires (Rigaut et al. 1999) 10. Le premier est l «IPP 150» qui est le tampon utilisé pour la fixation des protéines cibles, en fusion avec la protéine A, aux IgG. L IPP 150 est constitué de 10 mm de Tris-Cl à ph 8.0 (ajusté à l HCl fumant), de 150 mm de NaCl, de 0.1 % de NP40, le tout dans de l H 2 O déminéralisée. Le second tampon est le «TEV cleavage buffer». Comme son nom l indique, cette solution est le tampon dans laquelle la protéase TEV peut cliver les protéines ayant son site spécifique. Le TEV cleavage buffer est composé par 10 mm de Tris-Cl à ph 8.0, par 150 mm de NaCl, par 0.1 % de NP40, par 0.5 mm d EDTA, ainsi que par 1 mm de DTT (fait juste avant l utilisation), le tout dans de l H 2 O déminéralisée

14 Le troisième est l «IPP 150 Calmodulin binding buffer» qui, comme son nom l indique, est le tampon dans lequel les protéines cibles ayant le site d affinité à la calmoduline, pourront venir se fixer. L IPP 150 Calmodulin binding buffer est compose de 10 mm de β-mercaptoethanol, de 10 mm de Tris-Cl à ph 8.0, de 150 mm de NaCl, 1 mm de Mg-acétate, de 1 mm d imidazole, de 2 mm de CaCl 2 et de 0.1 % NP40, le tout dans de l H 2 O déminéralisée. Le dernier est l «IPP 150 Calmodulin elution buffer» qui est utilisé pour l élution des protéines restées fixées à la calmoduline en présence de calcium. En effet, grâce à l EGTA, on chélate l ion Ca 2+ et on décroche ainsi les protéines. Ce tampon est composé par 10 mm de β-mercaptoethanol, par du 10 mm de Tris-Cl à ph 8.0, par 150 mm de NaCl, par 1 mm de Mg-acétate, par 1 mm d imidazole, par 2 mm d EGTA, par 0.1 % de NP40, le tout dans de l H 2 O déminéralisée Protocole Tout d abord, on casse les cellules soit à l aide d un potter, soit avec du Triton X-100 ou du NP40 qui sont des détergents rompant les membranes. Comme on ne désire garder que les protéines solubilisées, on centrifuge fortement le broyat de cellules à g pendant une heure sous vide à 4 C. On en récupère que le surnageant, sur lequel on va effectuer la purification (figure 6). On prépare une mini-colonne (e.g., Econocolumn, Bio-Rad) avec au moins 200 µl de billes d IgG de type IgG agarose bead suspension (SIGMA A 2909) ou d IgG sepharose (PHARMACIA ). On tamponne la colonne en faisant passer 5 ml d IPP 150. Pour 10 ml d extrait cellulaire, qui correspond approximativement à 1,5 L de culture de Tetrahymena thermophila, on rajoute 5 µl.ml -1 de Tris-Cl ph8.0 à 2M, ainsi que 20 µl.ml -1 de NaCl et 10 µl.ml -1 de NP4O 10%. On met cette solution dans la colonne préalablement préparée, comme cidessus avec les immunoglobulines G, et fermée en haut et en bas. Finalement, le tout est mis à tourner sur une roue pendant 2 heures à 4 C. La colonne est ensuite vidée par gravité la débouchant de part et d autre. Il est important de garder tout ou partie de cette solution pour bien vérifier, en déposant sur gel, que toute la protéine cible se soit bien fixée aux IgG. On lave la colonne avec 30 ml d IPP 150 tout d abord, puis avec 10 ml de TEV cleavage buffer. Quand la colonne est bien rincée, on bouge le bas de la colonne et on y rajoute 1 ml de TEV cleavage buffer avec approximativement 100 unités de protéase TEV. On ferme le haut de la colonne et la met à tournée pendant 2 heures à 16 C. Pendant que la colonne tourne, on prépare la colonne suivante qui contient 200 µl de suspension de billes de calmoduline (STRATAGENE #214303). On lave cette colonne avec 5 ml d IPP 150 calmodulin binding buffer. Quand les 2 heures se sont écoulées, on débouche la colonne et on récupère bien l élution qui en sort par gravité. On peut faire le volume mort de la colonne en l éluant avec 200 µl de TEV cleavage buffer. On garde un aliquote de cet éluat pour le faire migrer et ainsi vérifier la présence de la protéine cible. On prépare l élution (1 ml) avec 3 volumes de calmoduline binding buffer (3 ml), et 3 µl de CaCl 2 1M. On transfert ce mélange dans la colonne contenant les billes de calmoduline préalablement lavées. Après avoir fermé la colonne, on la met à tourner pendant 1 heures à 4 C

15 Après la fixation, on vide la colonne par gravité, et on en récupère un aliquote pour le déposer sur gel et ainsi vérifier que toute la protéine cible a bien été retenue par les billes. On lave ces dernière avec 30 ml d IPP 150 calmodilune binding buffer. Finalement on détache la protéine en 5 fractions de 200 µl avec l IPP 150 calmoduline elution buffer. On révèle la présence de la protéine cible, ici nd9, par western blot. Pour cela, on fait migrer les protéines sur gel d acrilamide / bis-acrilamide avec un pourcentage en fonction du poids de la protéine. Comme nd9 est une protéine d environ 100 kda, le pourcentage d acrylamide choisit est de 10 %. Le gel de migration est composé de 4 ml de glycérol 50%, de 5 ml d acrilamide (40 : 1), dans du tampon Tris, avec 15 µl d APS et 5 µl de TEMED. Le gel de concentration est à 3 % d acrilamide. La migration se fait à 20 ma par gel. Après migration des protéines, on les transfert sur membrane pendant 2 heures à 35 mv. Finalement on révèle la présence de la protéine cible à l aide d anticorps. Figure 6 : schéma résumant le principe du TAPTag (Puig et al. 2001)

16 CHAPITRE 4 RESULTATS 4.1 SELECTION DES TETRAHYMENA THERMOPHILA TRANSFORMES La pression taxol pour sélectionner les T. thermophila transformés utilisée est 50 µg par ml de culture. On a pu ainsi cultiver 3 clones sous pression taxol et obtenir des Tetrahymena ayant 100% des copies du gène BTU1 dans le macronoyau ayant intégré le nd9-taptag. Pour vérifier que les clones soient à 100 % nd9-taptag, pour pouvoir les cultiver en masse sans pression taxol, il faut que seule la PCR avec le couple d oligonucléotides nd9 pbich3 fonctionne. Car si la PCR avec les amorces utilisant la partie délétée du gène BTU1 après transformation fonctionne, cela signifie que toutes les copies du macronoyau ne sont pas transformées. Le risque essentiel de cette transformation partielle est que si on enlève la pression taxol, les T. thermophila peuvent perdre, après un certain temps, leur transformation. En effet, la culture en masse se fait sans taxol et ce grand nombre de division peut agir à l inverse de la pression taxol. Grâce à la PCR, il a été possible de vérifier la sélection des souches ayant pour caractéristique : la présence du gène nd9-taptag (Figure 7), et la perte du gène de tubuline (Figure 8). PCR : Nd9 pbich3 Ladder pb Cu H 2 O Ladder pb 1500 pb produit PCR 1000 pb 200 pb Figure 7 : gel à 1% d agarose sur lequel ont été déposés les produits PCR caractérisant la présence du gène nd9-taptag, à l aide des oligonucléotides Nd9 et pbich3. Les clones testés sont les numéros 2 ; 3.1 ; 3.2 ; 3.3 et 5. Cu est un clone de T. thermophila non transformé (Cu 522) : témoin négatif. H 2 O est aussi un témoin négatif. Le plasmide utilisé pour transformer les cellules est utilisé comme témoin positif (pb). Enfin, les ladders, de part et d autre, sont les marqueurs de poids moléculaire des ADN déposés

17 PCR : Btu1 pbich3 Ladder Cu pb H 2 O pb 1500 pb 1000 pb produit PCR 200 pb Figure 8 : gel à 1% d agarose sur lequel ont été déposés les produits PCR caractérisant la présence du gène Nd9-TAPTag, à l aide des oligonucléotides Btu1 et pbich3. Les clones testés sont les numéros 2 ; 3.1 ; 3.2 ; 3.3 et 5. Cu est un clone de T. thermophila non transformé Cu 522 : témoin positif. Le plasmide utilisé pour transformer les cellules est utilisé comme témoin négatif (pb). H 2 O est aussi un témoin négatif. Enfin, les ladders, de part et d autre, sont les marqueurs de poids moléculaires des ADN déposés. On observe en fin de gel, des bandes de faibles poids moléculaires qui doivent être des dimères d oligonucléotides qui ont pu être amplifier. Sur la figure 8, on a bien la bande attendue d environ 1300 pb. On peut dire que tous les clones transformés et sélectionnés au taxol (2 ; 3 ; 5) ont intégré le gène nd9-taptag dans leur macronoyau. Leur résistance acquise contre le taxol est sûrement due à cette intégration dans le gène BTU1. Par contre, on remarque que le clone 2 est positif aux deux PCR : gène transformé et gène natif. En effet, le clone 2 a une bande comme le témoin positif (Cu) à la taille attendue d environ 1200 pb. On ne l utilise donc pas pour faire des cultures en masse car sa transformation n est pas totale et il y a risque de perdre à moyen terme cette transformation. Les clones 3 et 5, eux, ne sont positifs qu à la PCR ayant pour cible la transformation. Pour cela on peut les considérer comme parfaitement transformés. On utilise donc le clone numéro 3 pour faire des cultures en masse afin de purifier la protéine de fusion Nd9-TAPTag. 4.2 PURIFICATION DE ND9 GRACE AU TAPTag Premier essais Après s être assuré de la complète transformation du clone 3 de T. thermophila, et fait une culture en masse, on casse les cellules et extrait les protéines. Comme Nd9 est une protéine soluble et que le TAPTag est aussi soluble, on centrifuge les broyats cellulaires. La protéine cible de fusion possédant le TAPTag, on suit le protocole utilisant les différentes caractéristiques de cette séquence. On a pu ainsi purifier la protéine Nd9 sur gel (figure 9), mais aussi faire un western blot (figure 6) avec différents sérums de lapin dirigé contre des peptides de Nd

18 Post fixation éluat colonne Standard Eluat (1) Eluat (2) Eluat (3) Eluat (4) Eluat (5) micro IgG TEV calmoduline 5µL 10 µl 5µL 10 µl 5µL 10 µl 5µL 10 µl 5µL 10 µl 200 kda 116 kda 92 kda 31 kda Figure 9 : Migration de protéines purifiées au cours des différentes étapes de la purification de Nd9 grâce à son extrémité C terminale TAPTag. Gel coloré à l argent (*1,2). Après avoir centrifugé le broyat cellulaire, on dépose un aliquote de surnageant post-microsomal (Post micro). Ce surnageant est ensuite mis en contact avec des IgG puis éliminé de la colonne, un aliquote est déposé (fixation IgG). La colonne lavée, la TEV protéase y est ajouté ; ce qui en est éluée montre l efficacité de la première purification (éluat TEV). Enfin, cette solution est mise en contact avec la colonne contenant les billes de calmoduline, puis éliminé (colonne calmoduline). Finalement, la protéine cible est décroché de la colonne en chélatant le Ca 2+ en 5 fois d où les 5 éluats déposés à des volumes différentes (5 et 10 µl). La protéine Nd9 fait environ 100 kda, donc on a une bande à la taille attendue. Par contre, avant la purification, la protéine cible a son TAPTag au complet, ce qui lui rajoute près de 20 kda, pour finalement avoir une masse moléculaire d environ 120 kda. On ne peut observer cette bande car elle se situe dans la multitude de protéine que contient le dépôt issu du surnageant post-microsomal. Mais cette bande n est visible que sur western blot. Dans les éluats 1, 2 et 3, on peut voir une bande qui est d environ 100 kda, c est la taille attendue pour la protéine Nd9. Cette bande est peu intense, puisqu il a fallut révéler le gel à l argent pour bien l observer. En effet, au bleu de comassi, la révélation de la présence des protéines dans le gel est moins efficace. On conclut donc, que la quantité purifiée de protéine cible à l aide du TAPTag est, ici, de faible concentration. On a fait migrer puis transférer sur membranes de nylon, des protéines issues des différentes étapes de purification de la protéine Nd9 grâce à son extrémité C terminale TAPTag. A l aide de sérum de lapins immunisés contre un peptide de protéine Nd9, on a pu révéler ces westerns blot. Deux sérums de lapins ont été testés : un sérum de lapin immunisé avec un peptide de la région C terminale de la protéine Nd9 et un sérum de lapin immunisé avec un peptide de la région N terminale de cette même protéine. La révélation montre des divergences de résultats significatives (figure 10)

19 Serum R773 (1/1000) C Terminal Serum lapin 87 (1/200) N Terminal Post Ig G TEV Eluat 2 Eluat 3 Standard Post Ig G TEV Eluat 2 Eluat 3 Standard Micro micro 200 kda 116 kda 92 kda 31 kda A. 200 kda 116 kda 92 kda 31 kda B. Figure 10 : A. Migration de protéines des différentes étapes de la purification de Nd9 grâce à son extrémité C terminale TAPTag. Western Blot (*1,2) avec 2 anticorps différents : grâce à un peptide issu de l extrémité C terminal ou N terminal de la protéine nd9. On dépose un aliquote de surnageant post-microsomal (Post micro). Est déposé un aliquote de produit mis en contact avec les IgG (IgG). On dépose un aliquote de la purification après l action de la TEV protéase (TEV) ; d ailleurs dans ce puits avec le premier sérum on observe une bande de faible poids moléculaire qui est proche de la taille de la TEV protéase, soit près de 32 kda. B. Il s agit d exactement du même western blot, mais pour faire ressortir la bande, on a forcé sur le contraste. On peut ainsi bien voir dans les colonnes des éluats révélés par le sérum R773 une bande qui normalement est bien visible à l œil nu, à 100 kda. Ces westerns blot sont très différents, alors qu il s agit d un seul gel qui, après transfert, a été révélé différemment. Avec le premier sérum, on observe des bandes qui sont faibles en intensité mais à la taille attendue. Ainsi, dans les 2 premiers puits, on a une bande plus haute que le marqueur de poids moléculaire de 116 kda, soit une bande proche de 120 kda comme la protéine de fusion Nd9-TAPTag. Par contre, dans les puits des éluats 2 surtout, 3 et celui de la TEV, une très faible bande proche de 110 kda est visible sur le blot : c est la taille attendue de la protéine cible

20 Par contre, le second sérum reconnaît bien quelques protéines, mais ces dernières ne sont pas aux tailles attendues. En effet, dans les éluats, on observe de fortes bandes parasites qui sont largement inférieurs 100 kda qui est taille attendue de la protéine Nd9. Cette protéine parasite est purifiée en même temps que la protéine cible, puisque la bande est intensifiée suivant les aliquotes dans l ordre de la purification. Comme la protéine que l on pense parasite est purifiée, il est possible qu il s agisse de la protéine qui aurait subit une dégradation. Il est aussi possible, comme il s agit d un sérum, que le peptide injecté au lapin soit accompagné de protéines parasites que l on retrouve ici. Sur le western blot révélé par le sérum R773, on remarque que la bande attendue de 120 kda dans le premier puits se retrouve dans le puits suivant. Cela signifie que la première purification n a pas été efficace et pourrait expliquer la faible concentration de protéine cible en fin de processus de purification TAPTag Vérification Pour vérifier si la protéine Nd9 est restée dans la solution et ne se serait pas fixée sur les Immunoglobulines G, on refait un cycle de purification TAPTag avec cette solution. De même, pour vérifier si la protéine Nd9 n est pas restée accrochée aux membranes de la cellule et donc coincée dans le culot de très haute centrifugation, on y rajoute du Triton, qui est un détergent, et on en dépose quelques µl. Finalement, on fait un nouveau western blot comprenant des extraits de la première purification ainsi que les culots et les nouveaux passages sur colonnes (figure 11). Post Ig G (2) culot 2 Culot 1 surnageant 1 1 Standard Eluat micro 200 kda 116 kda 92 kda 31 kda Figure 11 : Western Blot (*1,3), des différentes étapes de la purification de Nd9 grâce à son extrémité C terminale TAPTag, issu de la première extraction avec le sérum R773. Les témoins positifs sont les aliquotes du surnageant post-microsomal (post micro), du passage dans la colonne contenant les IgG (IgG) et enfin l éluat 2 (2) qui était le plus visible sur le western blot précédent. Le culot 2 (culot 2) est traité au triton puis centrifugé pour donner le culot 1 (culot 1 ) qui lui aussi est déposé, aussi son surnageant est déposé (surnageant 1 ) ainsi qu une suspension de 1 (1 ). Finalement on dépose les éluats finaux de la purification TAPTag de la précédente colonne contenant les IgG

21 Sur ce western blot, on n observe pas les bandes attendues à 120kDa pour les culots ou à 100 kda pour les éluats. Il est important de noter qu entre la fin de la manipulation et le dépôt des différents échantillons sur le gel de migration, les tubes contenants les protéines ont été conservées à 20 C, ce qui aurait pu dégrader la protéine cible, et pourrait ainsi expliquer l absence de protéine à ce niveau. Sinon, on pourrait penser que la protéine de fusion est absente des culots et des surnagents testés, alors qu une bande au bon poids moléculaires se trouve dans les trois premiers puits qui sont nos témoins positifs, bien que très faible pour l éluat (2)

22 CHAPITRE 5 DISCUSSION 5.1 SELECTION DES TETRAHYMENA THERMOPHILA La sélection des Tetrahymena thermophila transformés par la séquence de fusion Nd9-TAPTag se fait en deux étapes. La première est après la transformation par biolystique à l aide des caractéristiques de la souche transformées Cu 522. En effet, cette souche possède une mutation sur le gène de la β tubuline 1 qui la rend sensible au taxol et résistante à son antagoniste la nocodazole. C est grâce au nocodazole que cette souche Cu 522 a été sélectionnée. La transformation désirée distructe le gène muté (BTU1) et rend donc au clone transformé, le phénotype sauvage de résistance au taxol qu avait perdu Cu 522. Le gène muté (BTU1) est remplacé par transformation par la construction Nd9- TAPTag dans ce gène non muté. Ainsi toutes les cellules transformées ayant perdu la mutation sur le gène BTU1 sont sélectionnées par la pression au taxol. Mais toutes les transformations ne nous intéresse pas. En effet, seule les cellules ayant intégrées la séquence de fusion Nd9-TAPTag nous intéresse puisque qu il s agit de la protéine Nd9 que l on désire purifier. En effet, si seulement un bout de la séquence est intégrée ou une autre partie du plasmide vecteur dans le génome des T. thermophila transformés, la distruction de BTU1 muté existe tout de même, mais Nd9 ne sera pas produit pas ces clones. C est pourquoi il est important de vérifier la complète transformation des cellules à l aide de l outil PCR. On observe ainsi le génomes des Tetrahymena ayant intégré, au moins jusqu au site où l oligonucléotide s hybride, tout ou partie de la construction Nd9-TAPTag. Les PCR faites nous donnent deux renseignements importants : la taille de l insertion ou du gène initial entre les deux oligonucléotides de la PCR, ainsi que la présence du gène initial ou de la transformation. En effet, si entre les deux amorces PCR choisies, la séquence n est complètement intégrée ou à l inverse plus d ADN est intégrée, la taille observée de l amplification serait différente de celle attendue. Finalement, on n observe pas, par chance, cela dans nos résultats. Par contre, la pression taxol que l on impose aux Tetrahymena thermophila transformés a un second rôle en plus de la sélection positive de leur transformation par rapport aux Cu 522 : en augmentant la pression, on augmente le nombre de copies transformées dans le macronoyau (40 n). Le but final de cette sélection est d obtenir des clones ayant 100 % des copies, du gène BTU1 ayant la construction Nd9-TAPTag, dans le macronoyau. Pour cela, on recherche, grâce à la PCR, les clones ayant uniquement une réponse positive à l amplification du gène Nd9-TAPTag et une réponse négative pour le gène initial. On a ainsi pu sélectionner le clone numéro 3 qui a ces caractéristiques. En effet, si on prenait le clone numéro 2, qui est positif aux deux PCR, le risque majeur est qu en le cultivant sans taxol en culture de masse, les T. thermophila possédant moins de gène transformé soient défavorisés dans leur développement et que l on perde ainsi la sélection désirée

23 5.2 FAIBLE QUANTITE DE PROTEINES APRES PURIFICATION TAPTag Suite à la pression taxol et à la vérification par PCR de la complète transformation des T. thermophila avec la construction Nd9-TAPTag, on fait une culture en masse de ce clone pour pouvoir purifier cette protéine de fusion. La manipulation de purification des Tetrahymena transformés par la construction contenant le Nd9-TAPTag nous donne une très faible concentration finale de la protéine de fusion Nd9 avec le reste de son Tag. Pour expliquer cette faible concentration finale de protéine Nd9, plusieurs hypothèses sont possibles. La première hypothèse est que la transformation ne soit pas totale : une PCR positive est claire et intransigeante, c est à dire que la séquence amplifiée est belle et bien présente. A l inverse, une réponse négative de la réaction PCR n est pas toujours significative. Donc, l absence de bande sur le gel de migration des produits PCR amplifiant le gène de β tubuline 1 et la présence de celle ci pour l amplification de la séquence Nd9-TAPTag, n est peut-être pas assez significative pour pouvoir dire que les T. thermophila sont transformés à 100 %. La plus improbable mais potentielle serait que les tampons utilisés pour purifier ne soient pas adaptés aux Tetrahymena. Cette hypothèse est quelques peu improbable car des protéines sont, quel que soient l organisme utilisé, des protéines et le TAPTag a ces propriétés. Par contre, dans cette hypothèse de la purification à l aide du TAPTag pas encore assez maîtrisée, il est important de signaler la présence de bande dans la révélation du western blot dont le puits contient un aliquote de la solution ayant passée dans la colonne avec les IgG. Il est donc probable que la quantité de billes d Immunoglobuline G soit trop faible et n ai pas fixé la totalité des protéines cibles. Il est même probable que des protéines synthétisées par T. thermophila, possédant la capacité de se fixer aux IgG, leurs ont pris la place, les déplaçant ainsi dans la solution au lieu de rester fixer aux billes. Finalement, cette hypothèse est extrapolable à la seconde colonne dans laquelle la protéine ayant le TAPTag se fixe aux billes de calmoduline en présence de calcium. En effet, si les billes sont saturées et donc ne sont pas en assez grande quantité, la perte de protéines cibles est significative. A l inverse, dans ces deux dernières colonnes, il est possible que l élément permettant de décrocher les protéines fixées ne soit pas assez efficace. Toutes ces remarques liées à la purification de la protéine possédant les caractéristiques du TAPTag sont essentielles et nécessitent une grande attention afin de maîtriser parfaitement cette technique. Finalement, une dernière hypothèse pouvant expliquer cette faible concentration finale de protéine Nd9 serait sa faible expression dans Tetrahymena. En effet, l expression de Nd9-TAPTag est régulée par le promoteur de la β tubuline. La β tubuline est une protéine constitutive de T. thermophila, il est donc normal que ce promoteur soit constitutif. Donc la synthèse de la protéine de fusion régulée par ce promoteur devrait donc être constitutive. Peut-être que cette production constitutive de protéines n est pas assez forte pour pouvoir en purifier une grande quantité comme on l espérait

24 5.3 INTERET DU PROMOTEUR MTT Le grand intérêt de ce promoteur est qu'il est inductible, mais surtout, après activation, l'expression du gène est près de 30 fois supérieures à celle du promoteur tubuline. MTT est l'abréviation de metallothionéine, qui est une famille de protéines qui ont pour propriété de fixer les métaux lourds. Cette particularité a pour but de maintenir l'homéostasie ionique ou des métaux lourds à l'intérieur de la cellule surtout, comme par exemple le zinc. Le gène MTT1 a été cloné à partir de Tetrahymena thermophila (SHANG et al., 2002) 11. L'expression de MTT1 est inductible par le cadmium (Cd 2+ ) qui est un métal lourd. Ce dernier semble surtout se fixer sur le promoteur situé en 5' du gène et active ainsi son expression. Ce promoteur MTT de T. thermophila, quand il est activé, réagit très vite au Cd 2+ car son expression est visible de 10 à 30 minutes et elle est proportionnelle à la concentration de cadmium présent. Il serait donc intéressant de réguler l expression de Nd9-TAPTag par le promoteur MTT

25 CONCLUSION

26 LEXIQUE ET ABREVIATIONS ADN : Acide DésoxyriboNucléique BET : Bromhydrate d Ethydium, intercalant révélant la présence d ADN par fluorescence aux UV BTU1 : nom du gène de la β tubuline 1 Chélateur : Corps qui peut fixer des cations métalliques en formant un complexe stable. EDTA : Ethylene Diamin Tetraacetic Acid, Chélateur d ions EGTA : Ethylene Glycol - Tetraacetic Acid, Chélateur d ions Gène : Unité constituée d A.D.N., qui, portée par les chromosomes, conserve et transmet les propriétés héréditaires des êtres vivants IgG : Immunoglobulines G, aussi nommés anticorps MTT : metallothionéine, protéine qui chélate des métaux lourds PCR : «Polymerase Chain Reaction», Réaction d amplification de l ADN TAPTag : Tandem Affinity Purification Tag

27 BIBLIOGRAPHIE 1 ROTHMAN, 1994, Nature 372, WEBER T, ZEMELMAN BV, MCNEW JA, WESTERMANN B, GMACHL M, PARLATI F, SOLLNER TH. & ROTHMAN JE. 1998, SNAREpins : minimal machinery for membrane fusion. Cell 92, GAUTIER, M.C., GARREAU DE LOUBRESSE, N., MADEDDU, L. & SPERLING, L. (1994). Evidence for defects in membrane traffic in Paramecium secretory mutants unable to produce functional storage granules. J. Cell Biol. 124, LINDER, T. HOFFMANN, U. KURZ & J. E. SCHUKTZ, 2000, A Guanylyl Cyclase from Paramecium with 22 Transmembrane Spans. J. Biol. Chemistry. 275, COHEN, P. DUPUIS & B. VIGUÈS, 1990, Expression of a Ciliate Gene in Escherichia coli Using a Suppressor trna to Read the UAA and UAG Glutamine Codons. J. Mol. Biol. 216, VAYSSIE, N. GARREAU de LOUBRESSE & L. SPERLING, 2000, Growth and form of secretory granules involves stepwise assembly but not differential sorting of a family of secretory proteins in Paramecium, Journal of Cell Science. 114, SHANG, X. SONG, J. BOWEN, R. CORSTANJE, Y. GAO, J. GAERTIG & A. GOROVSKY, A robust inducible-repressible promoter greatly facilitates gene knockouts, conditional expression, and overexpression of homologous and heterologous genes in Tetrahymena thermophila. PNAS. 99, ASAI & J. D.FORNEY, 2000, Methods in Cell Biology Volume 62 Tetrahymena thermophila, Academic Press. 9 PUIG, F.CASPARY, G. RIGAUT, B. RUTZ, E. BOUVERET, E. BRAGADO-NILSON, M. WILM & B. SERAPHIN, 2001, The Tandem Affinity Purification (TAP) Method : A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24, RIGAUT, A. SHEVCHENKO, B. RUTZ, M. WILM, M. MANN & B. SERAPHIN, 1999, A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotech. 17, SHANG, X. SONG, J. BOWEN, R. CORSTANJE, Y. GAO, J. GAERTIG & A. GOROVSKY, A robust inducible-repressible promoter greatly facilitates gene knockouts, conditional expression, and overexpression of homologous and heterologous genes in Tetrahymena thermophila. PNAS. 99,