Dosage des Macrolides dans la viande par LC-MS/MS. Table des matières
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- Anne-Laure St-Cyr
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1 SOP 22/117/F P. : 1/2 Table des matières 1 OBJET ET DOMAINE D APPLICATION DEFINITIONS ET ABREVIATIONS PRINCIPE DE LA MÉTHODE Principe MRLs dans la viande...5 SÉCURITÉ PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS RÉCEPTION, STOCKAGE ET DISTRIBUTION DES ÉCHANTILLONS PARTIE EXPÉRIMENTALE Produits chimiques, solvants et réactifs Solutions pour l analyse Tampon d extraction TRIS (.1 M ; ph 1.5) Tungstate de sodium dihydraté (.15 M) Solution de rinçage pour SPE : MeOH / H 2 O (5 :5, v/v) Solution d élution pour SPE : MeOH / ammoniaque 28 (5 :5, v/v) Solution tampon acétate d ammonium 1 mm Solution tampon acétate d ammonium 1 mm/acn : 8/2 (v/v) Phase mobile A = ACN pur Phase mobile B = H 2 O +.5 TFA Solutions étalons Solutions stocks individuelles à ± 1 mg/ml ACN Solution intermédiaire mixte des 6 macros à * MRL (ACN) Solution intermédiaire mixte des 6 macros à 1 * MRL (eau) Solution intermédiaire IS à µg/ml (ACN) Solution intermédiaire IS à µg/ml (eau) Solutions de travail Matériel Extraction et purification des échantillons Echantillons inconnus Blanc réactifs Echantillon de contrôle QC à 1 x MRL Blanc matrice Echantillon pour la droite d étalonnage en matrice Conditions expérimentales Conditions chromatographiques Conditions MS Programmes de mesures Evaluation des mesures...16 CALIBRATION ET CALCUL VALIDATION...17
2 SOP 22/117/F P. : 2/2 11 RAPPORT CONTROLE DE QUALITE Normes et références...18
3 SOP 22/117/F P. : 3/2 1 OBJET ET DOMAINE D APPLICATION Analyse destinée à identifier (screening) et/ou confirmer (identification et quantification) la présence des macrolides (Tylosine, Tilmicosine, Josamycine, Erythromycine, Spiramycine et Néospiramycine) dans la viande par rapport à leurs MRL respectives, et en utilisant la Roxithromycine comme standard interne. 2 DEFINITIONS ET ABREVIATIONS Les macrolides sont des antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire pour lutter contre les infections ORL, pulmonaires et cutanées, ainsi que sur certains parasites comme celui à l origine de la toxoplasmose. La structure chimique est constituée d un macrocycle lactonique à 1, 15 ou 16 atomes, sur lequel viennent se greffer plusieurs sucres. La structure des différents macrolides est reprise ci-dessous : Tylosine Tilmicosine Josamycine
4 SOP 22/117/F P. : /2 Erythromycine Spiramycine Néospiramycine Roxithromycine (IS)
5 SOP 22/117/F P. : 5/2 Liste des abréviations: ISP = Institut Scientifique de Santé Publique SOP = Standard Operating Procedure HPLC = high performance liquid chromatography LC-MS/MS = chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem MRL = Maximum Residue Limit LOQ = limit of quantification SPE = solid phase extraction ppb = µg/kg ou ng/g IS = Internal Standard tpm = tours par minute RT = Retention Time RRT = Relative Retention Time TIC = Total Ion Current ESI = ionisation par mode electrospray 3 PRINCIPE DE LA MÉTHODE 3.1 Principe Les macrolides sont extraits de la matrice à l aide d un tampon TRIS. Après centrifugation, le surnageant est déprotéinisé à l aide de tungstate de sodium, puis filtré sur filtre en papier, avant d être purifié par SPE sur des cartouches contenant une phase mixte (OASIS HLB). Les macrolides sont élués à l aide d un mélange méthanol/ammoniaque, puis l éluat récolté est évaporé à sec et repris dans un mélange tampon acétate d ammonium/acn. La séparation chromatographique se fait sur une colonne Symmetry C 18 en utilisant un gradient constitué d acétonitrile et d eau acidifiée par.5 TFA. La détection des analytes se fait en mode électrospray positif, en comparant les échantillons inconnus avec un échantillon de contrôle et en quantifiant leur teneur avec une droite de standards. Les critères de confirmation dont il faut tenir compte dans le cas où un échantillon s avère non conforme sont le temps de rétention relatif, l abondance relative des différents ions diagnostiques (par comparaison avec un standard en matrice ou un échantillon de contrôle) et le rapport signal-bruit. 3.2 MRLs dans la viande Les MRLs pour les macrolides dans la viande, telles que décrites dans l ANNEXE (Table 1) du règlement (UE) N 37/21 de la Commission du 22 décembre 2, sont reprises dans le tableau ci-dessous:
6 SOP 22/117/F P. : 6/2 Substance Espèce animale Résidus marqueur Matrice(s) cible(s) MRL (µg/kg) Toutes espèces produisant de Erythromycine l'aliment Erythromycine A Muscle 2 Josamycine (2)* Spiramycine Bovins Somme de spiramycine et néospiramycine Muscle 2 Porcins Spiramycine I Muscle 25 Néospiramycine (2)** Toutes espèces produisant de Tilmicosine l'aliment Tilmicosine Muscle 5 Toutes espèces produisant de Tylosine l'aliment Tylosine A Muscle * La MRL pour la Josamycine ne figure pas dans l Annexe du nouveau Règlement mais a été fixée provisoirement dans l Annexe III du règlement 2377//EC à 2 µg/kg pour la viande de porc. Afin de garder la Josamycine dans la méthode, la concentration de travail dans la viande de bœuf a été fixée à 2 µg/kg. ** En ce qui concerne la Néospiramycine, vu qu aucune valeur n est fixée par le règlement (UE) N 37/21, il est décidé de fixer la concentration de travail dans la viande de bœuf à 2 µg/kg, au même niveau que celle de la Spiramycine I. SÉCURITÉ Il est recommandé de porter des gants lors de la préparation des solutions standards ainsi que lors de la manipulation des échantillons durant l extraction. Toutes les précautions seront prises lors de la manipulation des échantillons et des solutions étalons afin d éviter toute contamination. Toute l extraction devra être effectuée sous une hotte bien ventilée. L élimination des solvants organiques et des solutions se fera dans les bidons prévus à cet effet. En ce qui concerne les déchets organiques, ils seront stockés dans les poubelles jaunes appropriées en attendant d être éliminés. 5 PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS Les échantillons sont prélevés par le demandeur de l analyse et placés dans des sacs étanches. 6 RÉCEPTION, STOCKAGE ET DISTRIBUTION DES ÉCHANTILLONS Les échantillons sont réceptionnés à l accueil de l ISP selon la procédure 3/F/12. Ils sont ensuite réceptionnés au sein de la section des denrées alimentaires selon les procédures 22/F/17 et 22/F/31. Lorsqu ils sont broyés, les échantillons sont distribués à l analyste qui les stocke à 15 C dans le compartiment adéquat du surgélateur jusqu au moment du rapportage final du résultat. La date de réception, le suivi et le résultat des analyses, ainsi que la destruction des échantillons sont enregistrés dans le LIMS de la section. 7 PARTIE EXPÉRIMENTALE
7 SOP 22/117/F P. : 7/2 7.1 Produits chimiques, solvants et réactifs Tylosine tartrate (Réf. Fluka 386 ; Sigma-Aldrich) Tilmicosine (Réf. Vetranal 3386 ; Sigma-Aldrich) Josamycine (Réf. Fluka 583 ; Sigma-Aldrich) 7.1. Erythromycine (Réf. Fluka 5673; Sigma-Aldrich) Spiramycine (Réf. S-132 ; Sigma-Aldrich) Roxithromycine (Réf. R-33; Sigma-Aldrich) = IS Tungstate de sodium dihydraté (Réf. T-262 ; Sigma-Aldrich) Ammoniaque 28 (VWR) 7.1. Eau (qualité Milli-Q ; Millipore) Acétonitrile (HPLC grade ; Biosolv) = ACN Méthanol (HPLC grade ; Biosolv) = MeOH Acide trifluoroacétique (Acros) = TFA Acide acétique (- ; VWR) Trizma Base (minimum ; Sigma-Aldrich) Hydroxide de sodium (qualité p.a. ; VWR) Néospiramycine (Réf ; Wako Chemicals) Acétate d ammonium (Réf ; Merck) Remarque : des standards, réactifs et solvants de qualité équivalente peuvent être utilisés. 7.2 Solutions pour l analyse Tampon d extraction TRIS (.1 M ; ph 1.5) Peser g de Trizma Base [7.1.1], les dissoudre dans environ ml d eau, ajuster le ph à 1.5 au moyen de NaOH M. Transférer dans un matras de 1 L et porter au trait avec de l eau Milli-Q. Cette solution se conserve 1 semaine au frigo Tungstate de sodium dihydraté (.15 M) Peser g de Tungstate de sodium [7.1.7], les dissoudre dans 2 ml d eau Milli-Q. Transférer dans un matras de 25 ml et porter au trait avec de l eau Milli-Q. Cette solution se conserve 1 semaine au frigo Solution de rinçage pour SPE : MeOH / H 2 O (5 :5, v/v) Mélanger 5 ml de méthanol [7.1.11] avec 5 ml d eau Milli-Q [7.1.]. Cette solution se conserve maximum 1 semaine à température ambiante Solution d élution pour SPE : MeOH / ammoniaque 28 (5 :5, v/v) Mélanger 5 ml de méthanol [7.1.11] avec 5 ml d ammoniaque 28 [7.1.8]. Cette solution est à renouveler chaque jour et à préparer juste avant utilisation.
8 SOP 22/117/F P. : 8/ Solution tampon acétate d ammonium 1 mm Peser,778g de poudre d acétate d ammonium [7.1.17] dans un ballon jaugé d un litre, mettre au trait avec de l eau milli-q. Cette solution se conserve jusqu à épuisement Solution tampon acétate d ammonium 1 mm/acn : 8/2 (v/v) Dans un verre à pied, mélanger 8 ml d acétate d ammonium 1 mm [7.2.5] avec 2 ml d ACN Phase mobile A = ACN pur Phase mobile B = H 2 O +.5 TFA Ajouter 5 µl de TFA à 1 L d eau Milli-Q, mélanger et filtrer sous vide sur un filtre de type HA. Cette solution se conserve 1 semaine à température ambiante. 7.3 Solutions étalons Solutions stocks individuelles à ± 1 mg/ml ACN Peser séparément environ 5 mg de chaque substance (6 macrolides et 1 standard interne) dans un matras de 5 ml, ajouter de l acétonitrile presque jusqu au trait, mettre au bain à ultrasons jusqu à entière dissolution et puis mettre au trait avec de l acétonitrile. La pureté et le poids de la substance définissent la concentration exacte de la solution selon la formule : Conc. exacte = (masse pesée x pureté) / volume Ces solutions stocks sont aliquotées dans des cupules Eppendorf et conservées à -2 C, maximum 2 mois.
9 SOP 22/117/F P. : / Solution intermédiaire mixte des 6 macros à * MRL (ACN) Dans un matras de 2 ml (V final), pipeter un volume (V) de chacune des solutions stocks (concentration initiale), mélanger et mettre au trait avec de l ACN. Le volume de la solution stock à pipeter se calcule selon la formule : V (ml) = [conc. finale (µg/ml) x V final (ml)] / conc. initiale (µg/ml) Cette solution intermédiaire se prépare tous les jours. Le reste de l aliquote de solution stock est jeté après utilisation afin d éviter tout dégradation suite au processus de décongélation/recongélation Solution intermédiaire mixte des 6 macros à 1 * MRL (eau) Dans un matras de 1 ml (V final), pipeter 1ml de la solution MRL (ACN) (7.3.2), mélanger et mettre au trait avec de l eau Milli-Q. Cette solution intermédiaire se prépare tous les jours. Le reste de la solution est jeté après utilisation Solution intermédiaire IS à µg/ml (ACN) Dans un matras de 2 ml (V final), pipeter un volume (V) de la solution stock (concentration initiale), mélanger et mettre au trait avec de l ACN. Le volume de la solution stock à pipeter se calcule selon la formule : V (ml) = [conc finale (µg/ml) x V final (ml)] / conc initiale (µg/ml) Cette solution intermédiaire se prépare tous les jours. Le reste de l aliquote de solution stock est jeté après utilisation afin d éviter tout dégradation suite au processus de décongélation/ré-congélation Solution intermédiaire IS à µg/ml (eau) Dans un matras de 1 ml (V final), pipeter 1ml de solution intermédiaire à µg/ml (ACN) (7.3.), mélanger et mettre au trait avec de l eau Milli-Q. Cette solution intermédiaire se prépare tous les jours. Le reste de la solution est jeté après utilisation.
10 SOP 22/117/F P. : 1/ Solutions de travail Préparation des standards pour la droite en solution Pour la droite en solutions, mélanger dans des matras jaugés de 1 ml les volumes décrits dans le tableau ci-dessous de manière à obtenir 5 solutions standards de concentrations croissantes. Standard (équiv.mrl) Volume (ml) Mix 6 macros à 1 x MRL [7.3.3] Volume (ml) IS à µg/ml [7.3.5] Volume (ml) tampon acétate d ammonium/acn : 8/2 (v/v) [7.2.6] x MRL 1.5 x MRL x MRL x MRL x MRL Matériel Verrerie classique de laboratoire Micropipette à volume variable 5-2 µl Micropipette à volume variable 2- µl Tube Falcon conique de 5 ml (VWR) Pipetus (EuroScientific) Balance de précision pour les solutions de standard (Sartorius A 2 S)) Balance (Sartorius) Vortex (EuroScientific) Cartouches HLB Oasis ; 2 mg/6 ml (Varian) Filtres papiers sans cendre 11 mm (Euroscientific) Fitres PVDF.5 µm, 13 mm (Euroscientific) Seringue Terumo 2 ml pour filtres (VWR) Centrifugeuse Eppendorf 581R (VWR) + centrifugeuse 236 (Analis) Reacti-therm heating module (Pierce) Flacon 2 ml en verre brun (ouverture mm, short-thread) + bouchons avec septum préprecé («Waters quality, GraceVydac) Inserts en verre de.1 ml (Gracevydac) Microtubes en plastique de 1.5 ml (Eppendorf) Pompe HPLC quaternaire (Alliance 265 ; Waters)
11 SOP 22/117/F P. : 11/2 Spectromètre de masse en tandem triple quadrupole (Quattro Micro ; Waters) Logiciel MassLynx.1 Colonne analytique Symmetry C18 15 x 2.1mm, 5µm (Waters) Précolonne C18, 1 x 2 mm (CP1818, Varian) 7.5 Extraction et purification des échantillons Echantillons inconnus 1. Peser 3 ±,1 g de matrice dans un tube Falcon conique de 5 ml. 2. Ajouter 3 µl de la solution intermédiaire SI à µg/ml [7.3.5], vortexer quelques secondes et attendre 15 min avant de poursuivre en plaçant les tubes à l abri de la lumière. 3. Ajouter 35 ml de tampon TRIS [7.2.1] et vortexer 1 min. Mélanger sur agitateur rotatif (1 min ; vitesse maximale). 5. Centrifuger 1 min à 7. rpm maximum (5 C). 6. Verser le surnageant dans un nouveau tube Falcon. 7. Précipitation et élimination des protéines : ajouter µl d acide acétique [7.1.13] et 5 ml de la solution de tungstate de sodium dihydraté à.15 M [7.2.2] au 35 ml de surnageant. 8. Laisser décanter les tubes au frigo pendant 6 minutes.. Centrifuger 5 min à 7. rpm maximum (5 C). 1. Filtrer le surnageant (sur filtre en papier) dans des nouveaux tubes Falcon. 11. Conditionner des cartouches SPE OASIS HLB (2 mg ; 6 ml) avec successivement 6 ml de MeOH et 6 ml d eau, en veillant à ne jamais laisser les cartouches aller à sec (max 5 mbar). 12. Faire passer la totalité du filtrat (environ 5 ml) sur la cartouche en s aidant d un réservoir 13. Rincer avec 2 ml du mélange MeOH/H 2 O (5 :5, v/v) [7.2.3] et sécher 3 min sous vide à 3 mbar en augmentant progressivement le vide (en restant sur le système BAKER) 1. Eluer par capillarité dans des tubes en verre de 1 ml (à fond rond, avec bouchons) avec 2 x 1 ml du mélange MeOH/ammoniaque 28 (5 :5) [7.2.]. 15. Evaporer à sec sous N 2 à 35 C. 16. Reprendre l extrait sec dans 3 ml de tampon acétate d ammonium 1 mm/acn (8/2) [7.2.6] et vortexer quelques secondes 17. Centrifuger 5 min à 2 rpm (t ambiante) 18. Filtrer le surnageant (filtre 13 mm + seringue) 1. Transférer environ 2 µl du surnageant dans un vial contenant un insert en verre et injecter µl
12 SOP 22/117/F P. : 12/ Blanc réactifs Remplacer la matrice par 5 ml de tampon TRIS, ajouter 3 µl de la solution intermédiaire IS à µg/ml [7.3.5] et leur faire suivre la procédure Echantillon de contrôle QC à 1 x MRL Préparer un échantillon négatif, ajouter respectivement 3 µl de la solution intermédiaire IS à µg/ml [7.3.5] et 3 µl de la solution intermédiaire mixte des 6 MACRO à 1 x MRL [7.3.3] et lui faire suivre la procédure Blanc matrice Préparer un échantillon négatif, ajouter 3 µl de la solution intermédiaire IS à µg/ml [7.3.5] et lui faire suivre la procédure Echantillon pour la droite d étalonnage en matrice Préparer 5 échantillons négatifs et leur faire suivre la procédure jusqu à l obtention des extraits secs (après évaporation sous N 2 ). Sur chaque extrait sec, ajouter successivement les volumes de la solution SI à µg/ml [7.3.5], de la solution intermédiaire mix 6 macros à 1 x MRL [7.3.3] et de la solution tampon [7.2.6] afin d obtenir un volume final de 3 ml. Les volumes à ajouter pour chaque niveau de concentration sont repris dans le tableau suivant : Concentration dans la matrice (équiv.mrl) Volume (ml) IS [7.3.5] Volume (ml) Mix 6 macros [7.3.3] Volume (ml) tampon acétate d ammonium/acn : 8/2 (v/v) [7.2.6] x MRL x MRL x MRL x MRL x MRL
13 SOP 22/117/F P. : 13/2 7.6 Conditions expérimentales Conditions chromatographiques Respecter les positions des solvants aqueux et organiques sur l HPLC pour éviter de boucher les canalisations : - vanne A : ACN pur - vanne B : Eau MilliQ +.5 TFA Volume d injection : injection automatique partielle de µl dans une boucle de 2 µl Température de l autoinjecteur : 1 C Température du four à colonne : 25 C Flux :. ml/minute Programme de conditionnement: Rincer la colonne en début de journée pendant 2 à 3 minutes en mettant la vanne A sur, puis appliquer le programme suivant pour amener progressivement la colonne sur les conditions d analyse initiales. Fichier : macrocond.wat Time (min) A B Flow (ml/min) Curve Stop time : 6 minutes Programme du gradient d analyse: Fichier : macro.wat Time (min) A B Flow (ml/min) Curve Stop time : 15 minutes
14 SOP 22/117/F P. : 1/ Programme de rinçage : Fichier : macrorinc.wat Stop time : 6 minutes Time (min) A B Flow (ml/min) Curve Paramètres de l injecteur automatique : Hauteur de l aiguille (needle depth) : 3 mm Vitesse (draw speed): slow Sample temperature: 1 C Conditions MS Fichier de Tune : macro.ipr Source (ES+) Capillaire 1 Cone (V) 2 Extractor 2 RF Lens (V).1 Source Temperature ( C) 12 Desolvation Temperature ( C) 35 Desolvation Gas Flow (L/Hr) 75 Cone gas Flow (L/Hr) 75 Analyser LM 1 Resolution 15. HM 1 Resolution 15. Ion Energy 1.5 Entrance -1 Collision 2 Exit 1 LM 2 Resolution 1 HM 2 Resolution 1 Ion Energy 2.5 Multiplier 65
15 SOP 22/117/F P. : 15/ Fichier d acquisition: MACROMRM.exp Type : MRM Ion Mode : ES+ Inter Channel Delay (sec) :.1 InterScan Time (min) :.1 Span (Da) :.5 Fichier d acquisition: MACROMRM.exp Néospiramycine (acq. function 1) Erythromycine (acq. function 1) Josamycine (acq. function 1) Roxithromycine (IS) (acq. function 1) Spiramycine (acq. function 1) Tilmicosine (acq. function 1) Tilosyne (acq. function 1) Parent ion Daughter ion Dwell Cone (V) Collision energy Delay Start Time (min) End Time (min) En gras, la transition utilisée pour quantifier. Les masses doivent être vérifiées et si nécessaire adaptées après chaque entretien de l instrument ou lors d un transfert de la méthode d un instrument LC-MS/MS à un autre. 7.7 Programmes de mesures On fait une distinction entre les analyses de screening (échantillons de routine des plans de contrôle Belge et Luxembourgeois) et les analyses de confirmation (identifications, contre-expertises, etc.). Une analyse de screening se fait en utilisant une droite de standards en solution et une analyse de confirmation se fait en utilisant une droite de standards en matrice. Un échantillon suspect après screening (avec une teneur supérieure à la ½ MRL), sera analysé une seconde fois via une analyse de confirmation. Pour chaque série d analyses, le programme de mesures est décrit ci-dessous. Le solvant utilisé pour rincer est l eau. Avant chaque série, le solvant (eau) utilisé pour préparer les standards et reprendre les extraits secs sera injecté afin de s assurer de sa pureté (absence de traces de macrolides). De plus, un standard à 1 x MRL en solution sera injecté afin de vérifier la sensibilité du système, ainsi que la bonne préparation des solutions de travail.
16 SOP 22/117/F P. : 16/2 E1 Solvant (test eau) E2 Standard test en solution (equiv. 1 * MRL) E3 Solvant (eau) = E1 E Standard solution ou matrice (équiv. * MRL) E5 Standard solution ou matrice (équiv..5 * MRL) E6 Standard solution ou matrice (équiv. 1 * MRL) E7 Standard solution ou matrice (équiv. 1.5 * MRL) E8 Standard solution ou matrice (équiv. 2 * MRL) E Solvant (eau) = E1 E1 Blanc réactifs (facultatif) E11 Blanc matrice E12 QC (viande fortifiée à 1 * MRL)/a E13 QC (viande fortifiée à 1 * MRL)/b E1 Solvant (eau) = E1 E15-Ex Echantillons Ex+1 Solvant (eau) = E1 Ex+2 Standard test en solution (équiv. 1 * MRL) = E2 Ex+3 ACN Remarque : si on suspecte la présence d une concentration importante en macrolides dans un échantillon (ex. confirmation de sites d injection), on fera suivre son injection de plusieurs injections du solvant (aumoins 3) afin d éviter tout risque de «carry-over» dans les injections suivantes. 8 Evaluation des mesures Standard test en solution (équiv. 1 * MRL) L injection du standard test en début de série (E2) et en fin de série (Ex+2) doit donner une intensité d aumoins pour chaque transition. Blanc matrice Le blanc matrice permet de vérifier qu il n y a pas d analytes dans le matériel de référence considéré. Ainsi, le chromatogramme du blanc matrice ne devrait pas présenter au temps de rétention des analytes un pic de hauteur supérieure à 3 S/N. Echantillon de contrôle L échantillon de contrôle correspond à un échantillon blanc fortifié à 1 * MRL pour chaque analyte. Pour cet échantillon, il faut observer le pic de chaque analyte à son temps de rétention respectif. Pour chaque analyte, la présence des ions diagnostiques (un ion parent et deux ions filles pour une analyse en mode MRM) est requise. Les résultats de l échantillon de contrôle sont portés sur carte de contrôle (SOP 3/NF/25) Standards en solution ou matrice ( * MRL à 2 * MRL) Ils servent à estimer la teneur en analyte éventuellement présente dans un échantillon inconnu. La droite en solutions ne permet qu une estimation approximative car elle ne permet pas d évaluer précisément le rendement. Par contre, la droite en matrice permet d estimer précisément la teneur en analyte présente dans un échantillon inconnu et de calculer le rendement apparent obtenu pour l échantillon de contrôle, c est pourquoi elle doit être utilisée en cas de confirmation d un échantillon suspect. Echantillons inconnus Un échantillon suspect en screening (teneur > ½ MRL) sera analysé une seconde fois en confirmation, en utilisant une droite en matrice.
17 SOP 22/117/F P. : 17/2 La présence d un analyte à une teneur égale ou supérieure à celle de l échantillon de contrôle, implique la vérification de l identification de cet analyte. Pour ce faire, les critères à vérifier imposés par la décision 22/657/EC sont les suivants : - une tolérance maximale de ± 2.5 sur le temps de rétention relatif. - l abondance relative des deux ions filles doit se situer dans l intervalle de tolérance fixé. - le rapport signal-bruit sur l ion fille le moins intense doit être 3 La vérification des critères se fait par comparaison avec l échantillon de contrôle ou avec un standard en matrice, en veillant à ce que la concentration utilisée pour effectuer cette comparaison soit la plus proche possible de la teneur estimée. CALIBRATION ET CALCUL Les cinq standards sont portés en graphique pour obtenir une droite d étalonnage par composé, en considérant le rapport de l aire de chaque analyte (ion fille le plus intense) sur l aire du standard interne en fonction des concentrations exprimées en ppb. Le logiciel TargetLynx calcule automatiquement la teneur par extrapolation de la droite d étalonnage. La méthode de quantification utilisée est «macro.mdb». 1 VALIDATION Voir DOC 22/117/F 11 RAPPORT L analyste inscrit les résultats des analyses dans une feuille Excel qui sera importée dans le LIMS. Le responsable d analyse (ou le chef de programme) vérifie et approuve. Le résultat est exprimé tel que décrit dans le SOP 22/F/ CONTROLE DE QUALITE Comme première ligne de contrôle, un échantillon enrichi est injecté dans chaque série et la teneur de chaque analyte est reportée dans une carte de contrôle. Les critères de qualité stipulés dans le paragraphe «évaluation des mesures» sont pris en compte. Une deuxième ligne de contrôle est effectuée par le responsable d analyse ou son remplaçant au moins une fois par an. Le critère d acceptation pour la deuxième ligne de contrôle est la teneur trouvée, qui doit se situer dans un intervalle de +/- 2 autour de la teneur ajoutée. Une troisième ligne de contrôle, c est-à-dire la participation à une étude inter laboratoire, est effectuée quand cela est possible.
18 SOP 22/117/F P. : 18/2 13 Normes et références 1. ISO Règlement (UE) N 37/21 de la Commission du 22 décembre 2, L15 du Règlement 2377/, J. Off. Commun. Eur., L22 du Directive 6/23/CE (groupe B1), J. Off. Commun. Eur., L125/1 du Décision 22/657/CE, J. Off. Commun. Eur., L221/8 du Interpretation of the implementation of commission decision 22/657/EC, updated guidelines of 16/5/6 7. DOC 22/F/ SOP 22/F/17; SOP 22/F/25; SOP 22/F/31; SOP 3/F/12, SOP 3/NF/25. Jian Wang, Daniel Leung, and Fred Butterworth. Determination of five macrolide antibiotic residues in eggs using liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry; J.Agric Food Chem., 53(25): Rosa Codony, Ramon Compano, Mercè Granados, José Antonio Garcia-Regueiro. Residue analysis of macrolides in poultry muscle by liquid chromatography electrospray mass spectrometry; Journal of Chromatography A, 5 (22): M. Dubois, D. Fluchard, E. Sior, Ph. Delahaut. Identification and quantification of five macrolide antibiotics in several tissues, eggs and milk by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry; Journal of Chromatography B, 753 (21):18-22.
19 SOP 22/117/F P. : 1/2 Annexe 1 : chromatogramme d un QC à 1x MRL dans la viande de bœuf spike MRL/1 macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > e macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > e5 spike MRL/1 macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > e macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > e macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > e macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > e macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > e macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) macro221val-1 Sm (Mn, 2x1) > e > e Time Time
20 SOP 22/117/F P. : 2/2 Annexe 2 : chromatogramme d un QC à 1x MRL dans la viande de porc spike MRL HK macro Sm (Mn, 2x1) macro Sm (Mn, 2x1) macro Sm (Mn, 2x1) macro Sm (Mn, 2x1) macro Sm (Mn, 2x1) > 17..3e > e5 73. > e > e 6. > e macro Sm (Mn, 2x1) > e3 Time spike MRL HK macro Sm (Mn, 2x1) macro Sm (Mn, 2x1) macro Sm (Mn, 2x1) macro Sm (Mn, 2x1) macro Sm (Mn, 2x1) macro Sm (Mn, 2x1) > e 16.6 > e > > e 83.6 > e 83.6 > e Time
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