CARACTÉRISATION STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DE L AQUAGLYCÉROPORINE AQP3 EXPRIMÉE DANS DIVERS SYSTÈMES

Transcription

1 CARACTÉRISATION STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DE L AQUAGLYCÉROPORINE AQP3 EXPRIMÉE DANS DIVERS SYSTÈMES CEA Saclay Département de Biologie Cellulaire et Moléculaire - Service de Biologie Cellulaire

2 Perméabilité à l eau des membranes Réabsorption de l eau au niveau rénal Eau Eau Diffusion lipidique: Canal collecteur P f = 1-4 cm / s Tubule distal Tubule proximal Eau présence de canaux hydriques AQP1 Diffusion facilitée: P f = 1-2 cm / s Anse de Henle AQP2 apical basolatéral AQP3 AQP4

3 LES PROTÉINES DE LA FAMILLE MIP Aquaglycéroporines perméables à l eau et aux petits solutés Transporteurs de glycérol Fps1 S. cerevisiae AQP7 H. sapiens GlpF E. coli AQP3 H. sapiens AQP9 H. sapiens AQPZ E. coli NOD26 G. max Nt-TIPa N. tabacum alpha-tip A. thaliana gamma-tip A. thaliana AQP8 H. sapiens Exceptions: transportent des solutés Aquaporines sélectivement perméables à l eau Plantes Mammifères Micro-organismes PIP1A A. thaliana PIP2A A. thaliana AQP H. sapiens AQP2 H. sapiens AQP6 H. sapiens AQP H. sapiens AQP4 H. sapiens AQP1 H. sapiens AQY1 S. cerevisiae

4 TOPOLOGIE ET CARACTÉRISTIQUES DES PROTÉINES MIPs Face extracellulaire 2 motifs N-P-A Rat AQP segments transmembranaires 2 a -2 b c e Rat AQP C E A d B D a -2 b c d e COOH NH2 Face cytoplasmique Identité de séquence d'au moins 2 % PM de 26 à 31 kda

5 LE MODÈLE DU SABLIER A C D P N A E C Preston et Agre, 1991 A C189 R19 N192 E A194 P193 3 C A B N A P NH 2 COOH H74 A73 S71 N76 P77 A78 B T8 4 D Jung et al., 1994 A 6 E C A P N N P A A B 4 D C NH 2 COOH Heymann et al., 1998 NH 2 COOH

6 STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE D AQP1 Walz et al., 1997 (6 Å) Li et al., 1997 (6 Å)

7 OBJECTIFS 1 Les voies de passage de l eau et du glycérol à travers le globule rouge humain sont elles communes? Moyens Mesure des perméabilités à l eau et au glycérol de globules rouges humains témoins et Colton (a-b-). Immunotransfert 2 Détermination d éléments structuraux impliqués dans la sélectivité des protéines MIPs. 3 Détermination de l état d oligomérisation d AQP3 présente dans les systèmes natifs ou hétérologues, comparaison avec AQP1.

8 UTILISATION DE GLOBULES ROUGES DE PHÉNOTYPE COLTON (a- b-) Erythrocyte témoin Erythrocyte Colton (a- b-)?? AQP1? AQP1 Eau Eau Glycérol

9 SPECTROPHOTOMÉTRIE A FLUX INTERROMPU Lumière incidente Amplificateur Variation de volume Lumière diffusée Intensité lumineuse Photomultiplicateur Intensité électrique mélange Sortie d eau Vésicules à l équilibre Solution hypertonique Moteurs pas à pas Calcul des constantes de vitesse Analyse

10 PERMÉABILITÉ À L EAU ET AU GLYCÉROL DES MEMBRANES D ÉRYTHROCYTES Eau Glycérol.1.22 Spectrophotométrie à flux interrompu volts Témoins Colton (a-b-) volts temps (s) temps (s) Filtration ultra-rapide Vt/Vo Fantômes d hématies équilibrés dans le glycérol Sortie de glycérol temps (s)

11 IMMUNOTRANSFERT ET IMMUNOFLUORESCENCE kda kda anti AQP1 anti AQP3 1: AQP1 humaine pure 2: membranes GR humains Co (a- b-) 3: membranes GR humains témoins 1: membranes GR de rat 2: membranes GR humains Co (a- b-) 3: membranes GR humains témoins 4: médullaire externe de rein de rat a: GR humains + anti-aqp3 b: GR humains + anti-aqp3 épuisé par peptide

12 CONCLUSIONS 1 La perméabilité au glycérol du globule rouge humain n est pas due à AQP1. La protéine responsable du transport de glycérol dans le globule rouge humain est probablement AQP3. OBJECTIFS 2 Détermination d éléments structuraux impliqués dans la sélectivité des protéines MIPs. Moyens Étude de la fonction de chimères constituées d AQP2 (strictement perméable à l eau) et d AQP3 (perméable à l eau et au glycérol). 3 Détermination de l état d oligomérisation d AQP3 présente dans les systèmes natifs ou hétérologues, comparaison avec AQP1.

13 SCHÉMA DES CHIMÈRES AQP3- AQP2 Cter AQP2- AQP3 Cter E E B B NH 2 COOH NH 2 COOH AQP3- NPA AQP2 AQP2- NPA AQP3 E E B B NH 2 COOH NH 2 COOH

14 MESURE DES PERMÉABILITÉS A L EAU ET AU GLYCÉROL DES OVOCYTES DE XÉNOPE Entrée d eau Xenopus laevis P f ARN 72 heures Entrée de 14 C-glycérol P gly

15 FONCTION DES CHIMÈRES P f P gly AQP2- AQP3 Cter E B N C Pf (cm/s) H2O AQP2 AQP3 AQP2- CT3 Pgly (pmol/min.ovocyte) H2O AQP2 AQP3 AQP2- CT3 AQP2- NPA AQP3 E B N C Pf (cm/s) H2O AQP2 AQP3 AQP2- NPA'3 Pgly (pmol/min.ovocyte) H2O AQP2 AQP3 AQP2- NPA'3

16 FONCTION DES CHIMÈRES AQP3- AQP2 Cter E B N C Pf (cm/s),18,12, H2O AQP2 AQP3 AQP3- CT2 9 Pgly (pmol/min.ovocyte) H2O AQP2 AQP3 AQP3- CT2 4 AQP2 AQP3 NPA 2 AQP3- NPA AQP2 E B N C Pf (cm/s),18,12, H2O AQP2 AQP3 AQP3- NPA' 2 Pgly (pmol/min.ovocyte) H2O AQP2 AQP3 AQP3- NPA' 2 1 2

17 COEXPRESSION DES CHIMÈRES COMPLÉMENTAIRES AQP2-NPA AQP3 ET AQP3-NPA AQP2 4 1 Lot A Pgly (pmol/min.ovocyte) Eau AQP2 AQP3 AQP2-NPA' AQP3 AQP3-NPA' AQP2 Coinjection Lot B Pgly (pmol/min.ovocyte) ND Eau AQP2 AQP3 AQP2-NPA' AQP3 ND AQP3-NPA' AQP2 11 Coinjection

18 EFFET DE LA PROGESTÉRONE SUR LA PERMÉABILITE AU GLYCÉROL DES OVOCYTES Non matures Perméabilité au glycérol (pmoles/min.ovocyte) sans traitement 2 34 Progestérone nuit Progestérone 3' veille Matures 1 14 Progestérone 3' avant exp

19 La perméabilité au glycérol du globule rouge humain n est pas due à AQP1. 1 La protéine responsable du transport de glycérol dans le globule rouge humain est probablement AQP3. CONCLUSIONS 2 La partie C-terminale d AQP3 est impliquée dans la formation du pore hydrique mais elle n est pas impliquée dans celle du pore du glycérol. Nous avons démontré l existence d un canal endogène présent dans les ovocytes de xénope encore immatures. OBJECTIFS Détermination de l état d oligomérisation d AQP3 présente dans les systèmes natifs ou hétérologues, comparaison avec AQP1. 3 Moyens Sédimentation sur gradient de saccharose. Cryofracture de membranes d ovocytes de xénope exprimant AQP3 ou AQP1, et détermination de la taille des particules intramembranaires.

20 DÉTERMINATION DE L OLIGOMÉRISATION D AQP3 EXPRIMÉE DANS DIVERS SYSTÈMES le globule rouge de Homo sapiens la levure Saccharomyces cerevisiae l ovocyte de Xenopus laevis?

21 DÉGLYCOSYLATION D AQP3 Erythrocyte Médullaire rénale Ovocyte Levure kda 62, 47, 32, 2, PNGase F

22 MEMBRANES DE GLOBULES ROUGES - SDS 1% AQP3 AQP kda 9 16 kda Avant solubilisation:? Après solubilisation: monomères attendus Après dépôt sur gel-sds: monomères et dimères Avant solubilisation: tétramères Après solubilisation: monomères attendus Après dépôt sur gel-sds: monomères

23 MEMBRANES DE GLOBULES ROUGES - NLS 2% AQP3 AQP kda Avant solubilisation:? Après solubilisation: monomères et dimères Après dépôt sur gel-sds: monomères et dimères Avant solubilisation: tétramères Après solubilisation: tétramères Après dépôt sur gel-sds: monomères Oligomérisation membranaire AQP3: monomère, dimère? AQP1: tétramère

24 CRYOFRACTURE DE MEMBRANES D OVOCYTES EXPRIMANT AQP1 ET AQP3 H 2 O Densité de particules (nombre / µm2) 1 H 2 O 181 ± 4 Densité (IMPs/µm 2 ) 1 AQP1 AQP3 AQP1 723 ± Taille des particules (nm) Taille moyenne des particules AQP3 H 2 O 8,4 ± 1,6 nm (simple gaussienne) 46 ± 76 AQP1 8,1 ± 1, nm (simple gaussienne) 7 nm et 8 nm environ (double gaussienne) AQP3: 7,1 ± 1,4 nm (simple gaussienne)

25 1 La perméabilité au glycérol du globule rouge humain n est pas due à AQP1. La protéine responsable du transport de glycérol dans le globule rouge humain est probablement AQP3. 2 La partie C-terminale d AQP3 est impliquée dans la formation du pore hydrique mais elle n est pas impliquée dans celle du pore du glycérol. Nous avons démontré l existence d un canal endogène présent dans les ovocytes de xénope encore immatures. CONCLUSIONS 3 AQP3 n est pas tétramérique lorsqu elle est extraite par les détergents non-dénaturants utilisés. DEUX HYPOTHÈSES: -AQP3 est monomérique et dimérique dans les membranes. -AQP3 est tétramérique mais elle est sensible aux détergents utilisés En cryofracture, les membranes d ovocytes AQP3 présentent des particules de taille légèrement inférieure à celles d ovocytes AQP1. Cette variation de taille n est pas suffisamment importante pour suggérer qu AQP3 possède une organisation membranaire différente de celle d AQP1.