Microscopie à onde évanescente : Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)

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1 Microscopie à onde évanescente : Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Stephanie Bonneau stephanie.bonneau@upmc.fr

2 1- interaction lumière matière A- Bases physiques de la lumière Une forme d énergie «petits paquets discrets» : les quanta -> photons Propagée par vagues Distance entre les pics de deux vagues successives = longueur d onde λ (nm) Durée de défilement entre deux vagues successives = fréquence ν (Hz) Vitesse (c) λ ν = c/λ Energie d un photon E = hν E Radiation électromagnétique Longueur d onde croissante = énergie par quantum décroissante λ nm Rayon X U.V. Visible Infrarouge (IR) micro ondes E

3 1- interaction lumière matière B - Matière et énergie électron noyau E rotation < E vibration < E électronique chimique < E électronique atomique Mouvements dans la molécule Polarisabilité / polarisation Liaison chimique Lumière = onde électromagnétique Elle peut interagir avec les dipôles stables ou induits, et donc avec la matière Quand un photon rencontre une molécule, il peut être État excité S2 Réfléchi Transmis (il traverse) Absorbé Pas d effet État excité S1 État fondamental S0 Seuls les photons dont le quantum d énergie correspond à un des niveaux d énergie autorisés de la molécule peuvent être absorbés. Ce phénomène est discret.

4 1- interaction lumière matière C - Conclusions E nm λ Rayon X U.V. Visible Infrarouge (IR) micro ondes E Extraction des e - des couches électroniques de l atome Saut électronique sur orbitale moléculaire π. Formation de radical libre Saut d'un niveau électronique dans une orbitale moléculaire délocalisée saut d'un niveau de vibration saut d'un niveau de rotation Variation d énergie de la matière Spécificité informationnelle de chaque spectroscopie couleur Conservation de l énergie : M + hv M* Dégénérescence de l énergie : M* M + énergie thermique M* M + énergie «chimique» (réaction) M* M + hv

5 2- Le monde du vivant Caractéristiques de la matière, mais spécificités : Plusieurs milliers de molécules différentes par cellule Renouvellement rapide A Les molécules du vivant glucide (Hèmes ) Complexité Spécificité biologique due à leur conformation et aux mouvements «autorisés» E (liaisons etc ) réactions, en fonction des paramètres thermodynamiques et biologiques Cas particuliers : certaines captent et transforment l E lumineuse (ex. : chlorophylles) Milieux aqueux protéine lipide Acide nucléique

6 2- Le monde du vivant B La cellule membrane nucléaire noyau nucléole centrioles appareil de Golgi chromatine ribosomes vacuole réticulum endoplasmique mitochondrie lysosomes membrane plasmique

7 3- L absorbance UV-visible Pourquoi parler de l absorbance dans un cours sur la fluorescence Etat Singulet E relaxation vibrationelle ISC Etat Triplet absorption fluorescence Etat Fondamental La fluorescence est le résultat du retour à l état fondamental d une molécule à l état excité par émission d un photon relaxation vibrationelle

8 4- La fluorescence C - Paramètres mesurables Paramètres mesurables - Le coefficient d extinction molaire ε λ correspondant à la longueur d onde d excitation choisie - L intensité de fluorescence F ou I F - La distribution spectrale de la fluorescence I = f(λ) - Les longueurs d onde max. λ max - Le rendement quantique de fluorescence φ F - La durée de vie de fluorescence τ F

9 4- La fluorescence C Paramètres mesurables (2) Rendement quantique de fluorescence φ F S 1 T 1 k isc Possibilités de désexcitations : k a k i k f k i k i 1 1 M M * kf k * 1 1 M M + + hv Q S 0 1 M kisc * 3 M * Cinétique : À l état stationnaire : Rendement quantique = 1 d[ M*] 1 = ka[ M ] ( k f + ki + k dt 1 d[ M*] 1 = 0 ka[ M ] = ( k f + k dt isc i 1 )[ M*] + k nombre de photons émis nombre de photons absorbés isc 1 )[ M*] φ = F k f ki+kisc+k f Le rendement quantique est unique pour chaque fluorochrome et dépendant des conditions, maximum : 1

10 4- La fluorescence C Paramètres mesurables (3) Durée de vie de l état excité M* Irradiation de l échantillon pendant t < 10-9 s par un éclair extrêmement puissant le plus de molécules à l état excité Mesure de l intensité de fluorescence au cours du temps On obtient une intensité décroissant exponentiellement avec un τf [ M ] dt d 1 * desexcitation = (k f +ki+kisc) 1 M * [M*] [ 1 M * ] = t (kf +ki +kisc).t c.e = t/τ c.e τ = 1 F k f+ki+kisc

11 Fluo non isolée d une molécule 3-4- Sp. La absorbance fluorescenceuv-visible D- C - Les chromophores a - solvants Interactions avec le solvant - Balance hydrophile/hydrophobe hv > hv hv hv < hv F (U.A.) Blue shift Red shift Solvant apolaire Longueur d onde (nm) - Ionisation (dans l eau, sensible au ph) rendement Trp Tyr ph «Isolée» Trp dans eau Trp dans dioxane 330 Solvant polaire λem max φ 355 0, , Informations sur l environnement local Conformation et mouvement de la molécule Associations et Interactions

12 Fluo non isolée d une molécule 3-4- Sp. La absorbance fluorescenceuv-visible D- C - Les chromophores b «quenching» Différents types de «quenching» de l énergie de fluorescence (= extinction) «Quenching» dû à d autres espèces moléculaires «Auto-quenching» Différents processus de «quenching» de l énergie de fluorescence «Quenching» de couleur Ré-absorbtion des photons émis par l environnement fortement «coloré» τ = Cte, mais I non visible car absorbée «Quenching» statique Formation d un complexe fluorochrome-quencheur, à l état fondamental [D - Q] [D -Q]* [D - Q] dark decay «Quenching» dynamique Collision conduisant au complexe fluorochrome*-quencheur, à l état excité Transfert d énergie par résonance (FRET) Transfert d excitation entre deux molécules voisines

13 Fluo non isolée d une molécule 3-4- Sp. La absorbance fluorescenceuv-visible D- C - Les chromophores b «quenching» (2) «Quenching» statique Complexe à l état fondamental : 1. Effets hydrophobes et électrostatiques induisent l association 2. Couplage électronique de type Dexter, le complexe a ses propres propriétés (spectres abs. et fluo. différents de ceux de M et Q) 3. Seules les M isolées fluorescent normalement [M - Q] Abs Des-excitation [M -Q]* [M - Q] sans émission Q [ M Q] il ya moinsde Mdanslemilieu M M* F M* inchangées fluorescence visible a des caractéristiques inchangées F M Fo La fluorescence de M diminue avec la concentration en Q τ Μ το τ Μ n est pas fonction de [Q] [Q] Ne dépend pas de la viscosité du milieu (η), ni de la température (T). [Q]

14 Fluo non isolée d une molécule 3-4- Sp. La absorbance fluorescenceuv-visible D- C - Les chromophores b «quenching» (3) «Quenching» dynamique Complexe à l état excité : 1. Excitation de M 2. Effets hydrophobes et électrostatiques induisent l association M*-Q 3. Couplage électronique de type Dexter, une partie des M* transmettent leur énergie, i.e. seule une partie des M* fluorescent normalement M* + Q M + Q* Q [ M* Q] il ya moinsde M*danslemilieu M* F Une partie des M* réagissent avec Q le temps de vie moyen diminue F M Fo ϕ k 1 f ' = τ ' f = f k + kq[q] k το + k τ Μ Q [Q] [Q] La fluorescence de M diminue avec la concentration en Q [Q] τ Μ est fonction de [Q]

15 3- Sp. absorbance UV-visible C - Les chromophores 4- La fluorescence D- b «quenching» (4) Fluo d une molécule non isolée «Quenching» dynamique Établissement de la relation de Stern-Volmer : ] [ ] [ ] [ ] [ ' Q k Q k k k Q k k Q k k k k k Q Q Q Q f f f f τ ϕ ϕ + = + = + = + = 1 1 [Q] k 1 F F Q 0 τ + = (Fo/F)-1 SV k Q τ K = F Q =.[Q] k k k k k Q f isc i f φ F

16 Fluo non isolée d une molécule 3-4- Sp. La absorbance fluorescenceuv-visible D- C - Les chromophores b «quenching» (5) Extinction de fluorescence par FRET 1. Excitation de M 2. Couplage de type dipôle-dipôle, une partie des M* transmettent leur énergie, i.e. seule une partie des M* fluorescent normalement M* + Q M + Q* 3. Retour de Q à l état fondamental (différents processus, radiatifs ou non) Recouvrement spectral Transfert M Q

17 3-4- Sp. La absorbance fluorescenceuv-visible D- C - Les chromophores b «quenching» (6) Extinction de fluorescence par FRET Fluo non isolée d une molécule 1. Excitation de M 2. Couplage de type dipôle-dipôle, une partie des M* transmettent leur énergie, i.e. seule une partie des M* fluorescent normalement M* + Q M + Q* 3. Retour de Q à l état fondamental (différents processus, radiatifs ou non) Recouvrement spectral Transfert M d Q

18 3-4- Sp. La absorbance fluorescenceuv-visible D- C - Les chromophores b «quenching» (7) Extinction de fluorescence par FRET Fluo non isolée d une molécule 1. Excitation de M 2. Couplage de type dipôle-dipôle (type Förster), une partie des M* transmettent leur énergie, i.e. seule une partie des M* fluorescent normalement M* + Q M + Q* 3. Retour de Q à l état fondamental (différents processus, radiatifs ou non) Recouvrement spectral Transfert M d Q Diminution de la fluorescence de M Augmentation de l éventuelle fluorescence de Q Pas de contact entre M et Q Dépend de la distance (MQ) en 1/r 6 Spectres de M et Q inchangés Efficacité de transfert 50 % R 0 Distance

19 4- La fluorescence E - Les fluorophores biologiques a - intrinsèques Toutes les molécules ne fluorescent pas : il existe d autres processus de désexcitation Chromophores λex max λem max rendement Remarques Acides nucléiques A G C U/T / / / 10-4 Très peu fluorescents Monomères fluorescent plus que chaînes. Protéines Trp ,2 sensible à l hydrophobie et au ph Tyr ,15 sensible au ph Phe ,02 Hèmes, coenzymes... NADH, NADPH ,019 Hème (protoporphyrine) ,5 GFP... EGFP ECFP Microscopie sur cellules vivantes Suivi de molécules uniques

20 4- La fluorescence E - Les fluorophores biologiques b - extrinsèques Peu de molécules naturelles sont de bons fluorophores On marque les molécules avec des fluorophores additionnels Fluorophore Cible λex max λem max Acridine orange (1) ADN Bodipy sonde DiI membrane NBD (2) sonde Fluoresceine FITC (3) (-Lys) (1) (2) (3)

21 5- Conséquences biologiques possibles Au niveau moléculaire Altérations directe (radicaux libres) (A-B)* A + B Altérations indirecte (par les peroxydes) H 2 O 2 Sur les acides nucléiques > ruptures simples ou doubles Sur les protéines > rupture des ponts S-S, des liaisons de van der Wals, éventuellement des liaisons peptidiques Au niveau cellulaire Retard de mitose (synchronisation) Mort cellulaire

22 La Microscopie de Fluorescence : Introduction Paramètres déterminant la qualité de l image Source de lumière Marqueurs fluorescents Optique Détection Laser Lampes Intrinsèques Extrinsèques Objectifs Lentilles Oeil Caméras

23 1- Les marqueurs de fluorescence A- Propriétés importantes pour la micro. Propriétés importantes des fluorophores pour les utiliser comme marqueurs de fluorescence en microscopie - Coefficient d extinction molaire - Rendement quantique brillance - Shift - Largeur de bande - Photostabilité - Temps de vie Décalage spectral Durée d observation - Toxicité (si on veut les utiliser in vivo)

24 1- Les marqueurs de fluorescence B- Marqueurs utilisés en biologie Type de fluorophore Avantages inconvénients Auto-fluorescence Marqueurs fluorescents Protéines fluorescentes Quantum dots (nano-cristaux de semi-conducteur) intrinsèque Brillants, grande variété spectrale Grands décalages des spectres Petite taille, spécificité +/- Sensibilité à l environnement Utilisation dans les cellules vivantes Marquage spécifique des protéines (protéine fusion) Sensibilité à certains paramètres Extrêmement brillants Photostables Propriétés spectrales adaptables Non contrôlée Souvent vue comme un problème Nécessite souvent de travailler sur cellules fixées Impossibilité de marquer de façon spécifique une protéine intracellulaire Faible photostabilité Variété spectrale limitée Décalage des spectres moyen La marquage spécifique intracellulaire pose encore des problèmes

25 1- Les marqueurs de fluorescence B- Marqueurs utilisés en biologie (2) Les marqueurs vitaux Marquage des lysosomes au lysotracker Green sur fibroblaste vivant Vague de calcium dans un oocyte suivie en calcium green

26 1- Les marqueurs de fluorescence B- Marqueurs utilisés en biologie (2) La GFP et ses variants

27 1- Les marqueurs de fluorescence B- Marqueurs utilisés en biologie (3) Les QDs Cœur CdSe Coquille ZnS Groupe enveloppant Revêtement organique Revêtement fonctionnalisé

28 1- Les marqueurs de fluorescence B- Marqueurs utilisés en biologie (4) Taille Photo-stabilité brillance Marqueurs vitaux GFP QD 1 nm 2-4 nm 5-30 nm 10 s 10 ms > 20 min Utilisations différentes Au niveau d un organisme Au niveau sub-cellulaire Au niveau d une seule molécule 10 cm In vivo ou post-mortem 10 µm Cellules vivantes ou fixées

29 2- Le microscope A- Principe du Microscope Principe d un microscope (objectif corrigé à l infini) Lentille de tube A B f 1 F occulaire A1 A F objectif Objectif B1 Oculaire Lentille oculaire B L objectif et la lentille de tube forment un système afocal Grossissement g 1 =F tube /F obj F tube : en général 1,6 cm L image intermédiaire est au plan focal objet oculaire L oculaire travaille sur cette image comme une loupe Grossissement g 2 = D/F occulaire D : distance conventionnelle (25 cm, minimum pour une vision distincte) Grossissement G = g 1 x g 2

30 2- Le microscope A- Microscope droit / Microscope inversé

31 3- Les différents microscopes A- Microscope de fluorescence a but Obtention d une image d un objet petit Grossissement Localisation précise des structures Définition précise Mesurer et localiser la fluorescence Système optique et détection

32 3- Les différents microscopes A- Microscope de fluorescence b montage Filtres Passe bas «short pass» Passe bande «band pass» : BP Passe haut «Long Pass» : LP Miroir Dichroïque : DM

33 3- Les différents microscopes A- Microscope de fluorescence b montage Bloc de filtres

34 3- Les différents microscopes A- Microscope de fluorescence b montage Bloc de filtres Filtre emission Filtre excitation Miroir dichroïque

35 3- Les différents microscopes A- Microscope de fluorescence b montage Microscope droit, à épi-fluorescence

36 3- Les différents microscopes A- Microscope de fluorescence b montage Microscope inversé

37 3- Les différents microscopes A- Microscope de fluorescence c caract. Effets de la diffraction R = 0,61 λ/(na) avec NA = n sinθ Disque d Airy Fonction d étalement d un point d image «Point Spread Fonction» (PSF)

38 3- Les différents microscopes A- Microscope de fluorescence c caract. Profondeur de champ Résolution d un microscope Deux points sont résolus quand leurs PSF à mi-hauteur sont distinct Cette distance correspond à δ Résolution latérale Résolution axiale δ x,y = 1,4.λ.(NA) = nm δ x,z = 1,4.λ.(NA) 2 = nm

39 3- Les différents microscopes A- Microscope de fluorescence d déconvol. Acquisitions en empilement-en-z (Z-stack) Pilotage précis en Z Fonction de diffusion du point Élimination du flou (i.e. de la contribution des autres focales) Algorithmes différents

40 3- Les différents microscopes B- Microscope confocale à balayage a but Effets de la diffraction δ x,y = = 1,4.λ.(NA) = nm δ x,z = 1,4.λ.(NA) 2 = nm But de Microscopie confocale à balayage: amélioration de la définition axiale Amélioration du profil d intensité axial de la Fonction d étalement d un point d image Champ large Confocal A la détection, on ne mesure que la fluorescence qui vient du plan focal.

41 3- Les différents microscopes B- Microscope confocale à balayage b montage Effets du «trou d épingle» (focalisation) Balayage Inconvénient : temps passé sur un petit objet est bref, le temps total de balayage est long Plan focal de l échantillon Source : le plus souvent LASER R = 0,61 λ/(na) Pinhole, trou confocal, iris Autre possibilité : pattern de trous (disque de Nipkow, multiplexage) Détecteur

42 3- Les différents microscopes B- Microscope confocale à balayage c caractéristiques

43 3- Les différents microscopes 3D-Deconvolution B- Microscope confocale à balayage d 3D reconstruct. 3D-Confocal

44 3- Les différents microscopes C- Microscope bi-photonique a but But de Microscopie Bi-photonique: Réduire le volume d excitation, amélioration de la définition Excitation à 1 photon Excitation à 2 photons Rq : confocal vs bi-photon Faible volume d excitation peu de photobleaching Longues longueurs d onde moins de dommages cellulaires moins de dispersion de la lumière

45 3- Les différents microscopes C- Microscope bi-photonique b principe S1 S1 S0 S0 F = I λ2 I λ1 F = I λ2 I λ1 2 Abs. = ε.l.c σ abs = ε/n A Incertitude d Heisenberg : δt suffisamment petit σ = σ abs. σ abs.δt

46 3- Les différents microscopes C- Microscope bi-photonique b principe z Excitation à 1 photon Excitation à 2 photons PSF fluorescence non confinée en z PSF 2 photons fluorescence confinée au volume d excitation

47 3- Les différents microscopes D- Microscope à ondes évanescentes I(z) = I 0 e-z/d Angle critique : θ c = arcsin(n 2 /n 1 ) Ordre de grandeur : θ c nm

48 4- Microscopie TIRF A- Principe Physique La réflexion interne totale (TIRF) Réfraction de la lumière Si n 1 sinθ 1 > n 2 θ 1 >θ c = Arcsin(n 2 /n 1 ) n 2 θ 2 n 2 n 1 θ 1 n 1 θ Loi de Descartes : n 1 sinθ 1 = n 2 sinθ 2 Ici n 1 >n 2 Réflexion totale Et dans le milieu n 2?

49 4- Microscopie TIRF A- Principe Physique L onde évanescente n 2 z n 1 λ θ Pour une onde plane monochromatique de longueur d onde λ : I(z) = I 0 e -z/d d = λ 4π ((n1 sinθ) 2 n 22 ) ½

50 4- Microscopie TIRF A- Principe Physique Le cas des cellules (aqueuses) sur lamelles de verre d = λ 4π ((n1 sinθ) 2 n 22 ) ½ D. Perrais, 2006

51 4- Microscopie TIRF B- Construction d un microscope TIRF Montage TIRF Montage avec prisme Objectif à immersion à eau Montage avec objectif NA = n 1 sinθ max NA > n cell = 1,38 Objectif à forte ouverture numérique + - θ variable, non limité Collection de la lumière Montage proche de microscope épifluorescence Commercial (Olympus, Nikon, Zeiss Objectifs particuliers θ limité

52 4- Microscopie TIRF B- Construction d un microscope TIRF Valeurs de d réellement accessibles D. Perrais, 2006

53 4- Microscopie TIRF B- Construction d un microscope TIRF Alignement de l illumination sur un microscope TIRF 1) Aligner le faisceau LASER Miroir dichroïque Filtre émission LASER CCD

54 4- Microscopie TIRF B- Construction d un microscope TIRF Alignement de l illumination sur un microscope TIRF Objectif Forte NA Miroir dichroïque Filtre émission 1) Aligner le faisceau LASER 2) Mettre l objectif et la lentille 3) Focaliser sur le plan focal arrière LASER CCD

55 4- Microscopie TIRF B- Construction d un microscope TIRF Alignement de l illumination sur un microscope TIRF Objectif Forte NA LASER CCD Miroir dichroïque Filtre émission 1) Aligner le faisceau LASER 2) Mettre l objectif et la lentille 3) Focaliser sur le plan focal arrière 4) Bouger le miroir jusqu à obtention d une réflexion TOTALE

56 4- Microscopie TIRF B- Construction d un microscope TIRF Alignement de l illumination sur un microscope TIRF Objectif Forte NA LASER CCD Miroir dichroïque Filtre émission 1) Aligner le faisceau LASER 2) Mettre l objectif et la lentille 3) Focaliser sur le plan focal arrière 4) Bouger le miroir jusqu à obtention d une réflexion TOTALE 5) Visualiser le spot formé par le LASER

57 4- Microscopie TIRF B- Construction d un microscope TIRF Tester la qualité de l illumination Avec des billes fluorescentes La lumière se propage Illumination par onde évanescente

58 4- Microscopie TIRF B- Construction d un microscope TIRF Tester la qualité de l illumination D. Perrais, 2006

59 4- Microscopie TIRF C- Exemple d application Mesure de mouvements verticaux Endocytose = disparition d un «spot» de clathrine de la membrane

60 4- Microscopie TIRF C- Exemple d application Nature du mouvement observé

61 4- Microscopie TIRF C- Exemple d application Mouvement = invagination des puits recouverts de clathrine