1 Introduction Processus de la validation Plan de la validation... 3
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- Lucie Normand
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1 P. : 1/13 Modifications version 4 Extension de la méthode pour 25 AAPs Correction LOD ANL Références Table des matières 1 Introduction Processus de la validation Plan de la validation Résultats de la validation Résultats qualitatifs : Temps de rétention Critère d acceptation... 3 Résultats Résultats qualitatifs : Rapport d intensité des deux ions filles Critère d acceptation... 5 Résultats Spécificité Critère d acceptation... 6 Résultats Linéarité Critère d acceptation... 7 Résultats Effet de matrice Critère d acceptation... 8 Résultats Répétabilité, Reproductibilité, Mesure d incertitude et Justesse Critère d acceptation... 8 Résultats Limite de détection (LOD) et de quantification (LOQ) Critère d acceptation Résultats Rendement Critère d acceptation Résultats Conclusion Références Introduction Ce rapport décrit les différents paramètres de validation et leurs applications techniques nécessaires pour prouver la fiabilité et l exactitude de la méthode d analyse. La procédure appliquée est décrite dans la SOP 23/0558/F. Le but de cette procédure est de vérifier la conformité des ustensiles en polyamide émis sur le marché belge, destinés aux consommateurs. En effet, les amines aromatiques primaires (AAP) sont utilisées
2 P. : 2/13 dans la production de colorants azotés donnant une couleur noire aux ustensiles de cuisine en nylon. Les amines aromatiques sont donc susceptibles de migrer dans les aliments. Une limite spécifique de migration de 0,010 mg/kg aliment (ou simulant alimentaire), soit de 0,0033 mg/dm 2 (en se référant au rapport conventionnel de 6 dm 2 par kg d aliment), est mentionné dans la Directive 10/2011 pour la quantité totale d amines primaires aromatiques. Le dossier de validation est adapté selon Technical guidelines on testing the migration of primary aromatic amines from polyamide kitchenware and for formaldehyde from melamine kitchenware, EU-RL, NRL-FCM publication, version 7, April 30 th, La détermination des amines aromatiques primaires (Aniline (ANL), 2,4-diaminotoluene (2,4-TDA), 4,4- diaminophenylmethane (4,4 -MDA), Ortho-aminoazotoluene (o-aat), 4-aminoazobenzene (4-AAB), o- anisidine (o-asd), 4-chloro-aniline (4-CA), 4-chloro-o-toluidine (4-CoT), 1,5-diaminonaphtalene (1,5- DAN), 3,3 -dichlorobenzidine (3,3 -DCB), 2,2 -dichloro-4,4 -methylenedianiline (DCMDA), 2,4- dimethylaniline (2,4-DMA), 2,6-dimethylaniline (2,6-DMA), 3,3 -dimethylbenzidine (3,3 -DMB), 3,3 - dimethoxybenzidine (3,3 -DMOB), 4,4 -diaminodiphenylether (4,4 -DPE), 4,4 -methylene-di-o-toluidine (4,4 -MDoT), 2-methyl-5-nitroaniline (2-M-5-NA), 2,4-diaminoanisole (2-M-mPDA), 2-methoxy-5- methylaniline (2-MO-5-MA), m-phenylenediamine (m-pda), p-phenylenediamine (p-pda), 4,4 - thiodianiline (4,4 -SDA), o-toluidine (o-t), 2,6-diaminotuoluene (2,6-TDA) et 2,4,5-trimethylaniline (2,4,5- TMA)) dans des ustensiles en polyamide/nylon s effectue par UPLC-MS/MS. 2 Processus de la validation Type de méthode : Le processus de validation concerne la méthode analytique pour la détermination des 26 amines aromatiques primaires (Aniline (ANL), 2,4-diaminotoluene (2,4-TDA), 4,4-diaminophenylmethane (4,4 - MDA), Ortho-aminoazotoluene (o-aat), 4-aminoazobenzene (4-AAB), o-anisidine (o-asd), 4-chloroaniline (4-CA), 4-chloro-o-toluidine (4-CoT), 1,5-diaminonaphtalene (1,5-DAN), 3,3 -dichlorobenzidine (3,3 -DCB), 2,2 -dichloro-4,4 -methylenedianiline (DCMDA), 2,4-dimethylaniline (2,4-DMA), 2,6- dimethylaniline (2,6-DMA), 3,3 -dimethylbenzidine (3,3 -DMB), 3,3 -dimethoxybenzidine (3,3 -DMOB), 4,4 -diaminodiphenylether (4,4 -DPE), 4,4 -methylene-di-o-toluidine (4,4 -MDoT), 2-methyl-5-nitroaniline (2-M-5-NA), 2,4-diaminoanisole (2-M-mPDA), 2-methoxy-5-methylaniline (2-MO-5-MA), m- phenylenediamine (m-pda), p-phenylenediamine (p-pda), 4,4 -thiodianiline (4,4 -SDA), o-toluidine (o-t), 2,6-diaminotuoluene (2,6-TDA) et 2,4,5-trimethylaniline (2,4,5-TMA)) dans le liquide de migration après contact avec les ustensiles de par UPLC-MS/MS. Principe de la méthode : Les ustensiles (à usage répété) sont mis en contact avec le simulant en respectant les conditions de temps et température de contact pour extraire les amines aromatique primaires (ANL, 2,4-TDA, 4,4-MDA, o-aat, 4-AAB, o-asd, 4-CA, 4-CoT, 1,5-DAN, 3,3 -DCB, DCMDA, 2,4-DMA, 2,6-DMA, 3,3 -DMB, 3,3 - DMOB, 4,4 -DPE, 4,4 -MDoT, 2-M-5-NA, 2-M-mPDA, 2-MO-5-MA, m-pda, p-pda, 4,4 -SDA, o-t, 2,6- TDA et 2,4,5-TMA). Après trois migrations successives le liquide de migration est analysé par UPLC- MS/MS. Matrices Ustensiles de cuisines en polyamide Responsable du processus de validation : Tina N Goy, Els Van Hoeck, Kathy Van Den Houwe Exécuteurs de la validation : Caroline Evrard Paramètres suivants à déterminer :
3 P. : 3/13 La spécificité, linéarité, l effet de matrice, répétabilité et reproductibilité, mesure d incertitude, justesse, limite de détection et de quantification et rendement. Equipements utilisés : UPLC-MS/MS 3 Plan de la validation Le plan des analyses est réalisé de la façon suivante : Validation primaire pour ANL, 2,4-TDA et 4,4 -MDA Blanc matrice 2 µg/l 5 µg/l 10 µg/l 20 µg/l Jour 1 : 18/07/ Jour 2 : 19/07/ Jour 3 : 20/07/ Total : Validation secondaire pour o-aat, 4-AAB, o-asd, 4-CA, 4-CoT, 1,5-DAN, 3,3 -DCB, DCMDA, 2,4-DMA, 2,6-DMA, 3,3 -DMB, 3,3 -DMOB, 4,4 -DPE, 4,4 -MDoT, 2-M-5-NA, 2-M-mPDA, 2-MO-5-MA, m-pda, p- PDA, 4,4 -SDA, o-t, 2,6-TDA et 2,4,5-TMA. Blanc matrice 2 µg/l 5 µg/l 10 µg/l 20 µg/l Jour 4 : 06/03/ Total : Résultats de la validation 4.1 Résultats qualitatifs : Temps de rétention Critère d acceptation Le temps de rétention ne peut pas varier plus de 5 % en comparant avec le temps de rétention de l analyse de référence (échantillon de contrôle ou standard de référence)
4 P. : 4/ Résultats Validation primaire pour ANL, 2,4-TDA et 4,4 -MDA % des échantillons analysés pour lesquels les temps de rétention étaient approuvés ANL 100% 2,4-TDA 100% 4,4 -MDA 100% Validation secondaire pour o-aat, 4-AAB, o-asd, 4-CA, 4-CoT, 1,5-DAN, 3,3 -DCB, DCMDA, 2,4-DMA, 2,6-DMA, 3,3 -DMB, 3,3 -DMOB, 4,4 -DPE, 4,4 -MDoT, 2-M-5-NA, 2-M-mPDA, 2-MO-5-MA, m-pda, p- PDA, 4,4 -SDA, o-t, 2,6-TDA et 2,4,5-TMA. % des échantillons analysés pour lesquels les temps de rétention étaient approuvés ANL 100% o-t 100% p-pda 100% m-pda 100% 2,4-DMA 100% 2,6-DMA 100% 2,4-TDA 100% 2,6-TDA 100% o-asd 100% 4-CA 100% 2,4,5-TMA 100% 2-MO-5-MA 100% 2-M-mPDA 100% 4-CoT 100% 2-M-5-NA 100% 1,5-DAN 100% 4-AAB 100% 4,4 -MDA 100% 4,4 -DPE 100% 3,3 -DMB 100% 4,4 -SDA 100% o-aat 100% 4,4 -MDoT 100% 3,3 -DMOB 100% 3,3 -DCB 100% DCMDA 100%
5 P. : 5/ Résultats qualitatifs : Rapport d intensité des deux ions filles Critère d acceptation Le rapport du signal des deux ions filles obtenu ne peut pas différer plus que 30 % comparé avec le rapport obtenu de l analyse de référence (échantillon de contrôle ou standard de référence) Résultats Validation primaire pour ANL, 2,4-TDA et 4,4 -MDA % des échantillons analysés pour lesquels les rapports d intensités des deux ions filles étaient approuvés ANL 100% 2,4-TDA 100% 4,4 -MDA 100% Validation secondaire pour o-aat, 4-AAB, o-asd, 4-CA, 4-CoT, 1,5-DAN, 3,3 -DCB, DCMDA, 2,4-DMA, 2,6-DMA, 3,3 -DMB, 3,3 -DMOB, 4,4 -DPE, 4,4 -MDoT, 2-M-5-NA, 2-M-mPDA, 2-MO-5-MA, m-pda, p- PDA, 4,4 -SDA, o-t, 2,6-TDA et 2,4,5-TMA. % des échantillons analysés pour lesquels les rapports d intensités des deux ions filles étaient approuvés ANL 100% o-t 100% p-pda 100% m-pda 100% 2,4-DMA 100% 2,6-DMA 100% 2,4-TDA 100% 2,6-TDA 100% o-asd 100% 4-CA 100% 2,4,5-TMA 100% 2-MO-5-MA 100% 2-M-mPDA 100% 4-CoT 100% 2-M-5-NA 100% 1,5-DAN 100% 4-AAB 100% 4,4 -MDA 100% 4,4 -DPE 100% 3,3 -DMB 100% 4,4 -SDA 100% o-aat 100% 4,4 -MDoT 100% 3,3 -DMOB 100% 3,3 -DCB 100% DCMDA 100%
6 P. : 6/ Spécificité Critère d acceptation L utilisation de blanc et du blanc matrice prouve qu il n y a aucune présence de pic éventuel pouvant perturber l identification et la quantification des amines aromatiques primaires. La méthode est sélective et spécifique car basée sur la détermination du temps de rétention et le rapport des ions filles spécifique pour chaque molécule recherchée. On considère qu il y a présence d amine aromatique primaire lorsqu on détecte un pic ayant un temps de rétention proche de ceux des standards de la même série en tenant compte de l intervalle de confiance de 5 % et qu il y a confirmation du rapport des ions filles d amine aromatique primaire en tenant compte de l intervalle de confiance de 30 % Résultats Analytes Ion parent (MH+) (m/z) Ions filles (m/z) Temps de retention** (min) Temps de retention*** (min) ANL 94 51, 77* o-t *, p-pda , 92* 0.69 m-pda , 92* ,4-DMA , 107* 3.5 2,6-DMA , 105* ,4-TDA , 108* ,6-TDA , 106* 0.99 o-asd , 109* CA *, ,4,5-TMA , 121* MO-5MA , 123* M-mPDA *, CoT *, M-5-NA , 107* ,5-DAN , 143* AAB *, ,4 -MDA , 106* ,4 -DPE , 108* ,3 -DMB , 198* ,4 -SDA *, o-aat *, ,4 -MDoT *, ,3 -DMOB *, ,3 -DCB , 218* 5.62 DCMDA , 232* 5.76 * Ion fille utilisé pour la quantification ** Temps de rétention avec le gradient pour 3 AAP *** Temps de rétention avec le gradient pour 26 AAP
7 P. : 7/ Linéarité Critère d acceptation La linéarité ou la non-linéarité du modèle de régression utilisé pour la quantification est évaluée à l aide du test de Mandel. Ce test détermine le modèle préférentiellement utilisé : si TV (Test value) < Fcritique, alors régression linéaire si TV > Fcritique, alors régression quadratique Le coefficient de corrélation (r 2 ) des courbes obtenu doit être égal ou supérieur à 0, Résultats Les droites d étalonnages ont été réalisées sur une gamme de concentration autour de la SML pour chaque amine. Validation primaire pour ANL, 2,4-TDA et 4,4 -MDA TV F critique Linéaire ou quadratique R² Linéarité ANL Linéaire Ok 2,4-TDA Linéaire Ok 4,4 -MDA Linéaire Ok Validation secondaire pour o-aat, 4-AAB, o-asd, 4-CA, 4-CoT, 1,5-DAN, 3,3 -DCB, DCMDA, 2,4-DMA, 2,6-DMA, 3,3 -DMB, 3,3 -DMOB, 4,4 -DPE, 4,4 -MDoT, 2-M-5-NA, 2-M-mPDA, 2-MO-5-MA, m-pda, p- PDA, 4,4 -SDA, o-t, 2,6-TDA et 2,4,5-TMA. TV F critique Linéaire ou quadratique R² Linéarité ANL Linéaire Ok o-t Linéaire Ok p-pda Linéaire Ok m-pda Linéaire Ok 2,4-DMA Linéaire Ok 2,6-DMA Linéaire Ok 2,4-TDA Linéaire Ok 2,6-TDA Linéaire Ok o-asd Linéaire Ok 4-CA Linéaire Ok 2,4,5-TMA Linéaire Ok 2-MO-5-MA Linéaire Ok 2-M-mPDA Linéaire Ok 4-CoT Linéaire Ok 2-M-5-NA Linéaire Ok 1,5-DAN Linéaire Ok 4-AAB Linéaire Ok 4,4 -MDA Linéaire Ok 4,4 -DPE Linéaire Ok 3,3 -DMB Linéaire Ok 4,4 -SDA Linéaire Ok o-aat Linéaire Ok 4,4 -MDoT Linéaire Ok
8 P. : 8/13 TV F critique Linéaire ou quadratique R² Linéarité 3,3 -DMOB Linéaire Ok 3,3 -DCB Linéaire Ok DCMDA Linéaire Ok Conclusion : Il s avère que la linéarité est constatée pour toutes les amines primaires aromatiques dans la gamme des concentrations étudiées. 4.5 Effet de matrice Critère d acceptation Comparaison entre les pentes des standards préparés dans le blanc et les standards préparés dans le blanc matrice. Les valeurs obtenues pour les 2 droites sont introduites et comparées en utilisant le t-test dans le tableau ci-dessous. Si t est inférieur au t critique, il n y a pas d effet de matrice Résultats t t critique Effet matrice ANL non 2.4-TDA non 4.4 -MDA non Conclusion : il n y a pas d effet de matrice pour la molécule étudiée, car t est inférieur au t critique. 4.6 Répétabilité, Reproductibilité, Mesure d incertitude et Justesse Critère d acceptation Les critères d acceptation de répétabilité et reproductibilité sont respectés lorsque les cœfficients de variation de répétabilité (CV r ) et de reproductibilité (CV RW ) ne dépassent pas le niveau de tolérance calculé avec l équation d Horwitz. La Répétabilité et reproductibilité de la méthode ont été déterminées par les résultats obtenus à partir de l échantillon de contrôle : Pour la répétabilité, 3 répliquats de l échantillon de contrôle ont été analysés par la même personne, le même jour. Pour la reproductibilité, l échantillon de contrôle a été analysé par la même personne, dans les mêmes conditions mais durant 3 jours différents. L incertitude de la mesure est égale à deux fois la reproductibilité (S RW ) exprimée en pourcentage. Comme il n existe pas d échantillon de référence certifié, la justesse pourra être déterminée à partir de l échantillon de contrôle. Un échantillon spiké dans la matrice, dont la teneur est égale à la SML, a été injecté 3 jours différents. Les résultats sont encodés dans une carte de contrôle Résultats Par l utilisation du tableau statistique (STATISTICAL ANALYSIS OF DATA ACCORDING TO ISO5725-2(1994)), on détermine les cœfficients de variation de répétabilité (CV r ) et de reproductibilité (CV RW ). Ces coefficients sont comparés au niveau de tolérance donné à 2/3 d Horwitz par l équation d Horwitz.
9 P. : 9/13 Validation primaire pour ANL, 2,4-TDA et 4,4 -MDA Sr (mg/l) CVr 2/3 Horwitz S RW (mg/l) CV RW 2/3 Horwitz Apparent Recovery Uncertainty 2 ppb ANL ,4-TDA ,4 -MDA ppb ANL ,4-TDA ,4 -MDA ppb ANL ,4-TDA ,4 -MDA ppb ANL ,4-TA ,4 -MDA Validation secondaire pour o-aat, 4-AAB, o-asd, 4-CA, 4-CoT, 1,5-DAN, 3,3 -DCB, DCMDA, 2,4-DMA, 2,6-DMA, 3,3 -DMB, 3,3 -DMOB, 4,4 -DPE, 4,4 -MDoT, 2-M-5-NA, 2-M-mPDA, 2-MO-5-MA, m-pda, p- PDA, 4,4 -SDA, o-t, 2,6-TDA et 2,4,5-TMA. Sr (mg/l) CVr 2/3 Horwitz Apparent Recovery 2 ppb ANL o-t p-pda m-pda ,4-DMA ,6-DMA ,4-TDA ,6-TDA o-asd CA ,4,5-TMA MO-5-MA M-mPDA CoT M-5-NA ,5-DAN AAB ,4 -MDA
10 P. : 10/13 Sr (mg/l) CVr 2/3 Horwitz Apparent Recovery 4,4 -DPE ,3 -DMB ,4 -SDA o-aat ,4 -MDoT ,3 -DMOB ,3 -DCB DCMDA ppb ANL o-t p-pda m-pda ,4-DMA ,6-DMA ,4-TDA ,6-TDA o-asd CA ,4,5-TMA MO-5-MA M-mPDA CoT M-5-NA ,5-DAN AAB ,4 -MDA ,4 -DPE ,3 -DMB ,4 -SDA o-aat ,4 -MDoT ,3 -DMOB ,3 -DCB DCMDA ppb ANL o-t p-pda m-pda ,4-DMA ,6-DMA
11 P. : 11/13 Sr (mg/l) CVr 2/3 Horwitz Apparent Recovery 2,4-TDA ,6-TDA o-asd CA ,4,5-TMA MO-5-MA M-mPDA CoT M-5-NA ,5-DAN AAB ,4 -MDA ,4 -DPE ,3 -DMB ,4 -SDA o-aat ,4 -MDoT ,3 -DMOB ,3 -DCB DCMDA ppb ANL o-t p-pda m-pda ,4-DMA ,6-DMA ,4-TDA ,6-TDA o-asd CA ,4,5-TMA MO-5-MA M-mPDA CoT M-5-NA ,5-DAN AAB ,4 -MDA ,4 -DPE ,3 -DMB ,4 -SDA
12 P. : 12/13 Sr (mg/l) CVr 2/3 Horwitz Apparent Recovery o-aat ,4 -MDoT ,3 -DMOB ,3 -DCB DCMDA S r : déviation standard sur la répétabilité CV r : coefficient de répétabilité S RW : déviation standard sur la reproductibilité CV RW : coefficient de reproductibilité Conclusion : Les paramètres de répétabilité et reproductibilité satisfont aux critères d acceptation. 4.7 Limite de détection (LOD) et de quantification (LOQ) Critère d acceptation La limite de détection (LOD) est égale à trois fois le signal du bruit. Il s agit de la plus petite concentration identifiable des amines. La limite de quantification (LOQ) est égale à dix fois le signal du bruit. Il s agit de la plus petite concentration quantifiable des amines Résultats Validation primaire pour ANL, 2,4-TDA et 4,4 -MDA Analyte LOD (ppt) LOQ (ppb) ANL ,4-TDA ,4 -MDA 5 15 Validation secondaire pour o-aat, 4-AAB, o-asd, 4-CA, 4-CoT, 1,5-DAN, 3,3 -DCB, DCMDA, 2,4-DMA, 2,6-DMA, 3,3 -DMB, 3,3 -DMOB, 4,4 -DPE, 4,4 -MDoT, 2-M-5-NA, 2-M-mPDA, 2-MO-5-MA, m-pda, p- PDA, 4,4 -SDA, o-t, 2,6-TDA et 2,4,5-TMA. Analyte LOD (ppt) LOQ (ppb) ANL o-t p-pda m-pda ,4-DMA ,6-DMA ,4-TDA ,6-TDA o-asd CA ,4,5-TMA MO-5-MA M-mPDA CoT
13 P. : 13/13 Analyte LOD (ppt) LOQ (ppb) 2-M-5-NA ,5-DAN AAB ,4 -MDA ,4 -DPE ,3 -DMB ,4 -SDA o-aat ,4 -MDoT ,3 -DMOB ,3 -DCB DCMDA Rendement Critère d acceptation Le rendement est établi à partir de l injection de l échantillon de contrôle au cours de la validation. Le rapport entre les concentrations obtenues en mg/l à partir de l équation de régression linéaire et la concentration théorique de l échantillon de référence permet d établir le rendement, exprimé en pourcentage Résultats La limite pour le rendement est fixée à 70%. Le rendement doit être supérieur à 70% 5 Conclusion La validation de la méthode d analyse des amines primaires aromatiques a satisfait aux critères. Il est conclu que la méthode est apte à détecter ANL, 2,4-TDA, 4,4-MDA, o-aat, 4-AAB, o-asd, 4-CA, 4-CoT, 1,5-DAN, 3,3 -DCB, DCMDA, 2,4-DMA, 2,6-DMA, 3,3 -DMB, 3,3 -DMOB, 4,4 -DPE, 4,4 -MDoT, 2-M-5- MA, 2-M-mPDA, 2-MO-5-MA, m-pda, p-pda, 4,4 -SDA, o-t, 2,6-TDA et 2,4,5-TMA dans le liquide de migration après contact avec les ustensiles de. 6 Références Règlement (UE) N 10/2011 concernant les matériaux et objets en matière plastiques destinés à entrer en contact avec des denrées alimentaires SOP 22/N/16 SOP I/03/03/NF SOP I/03/09/NF Les normes d assurance de qualité ISO sont d application pour les analyses. Technical guidelines on testing the migration of primary aromatic amines from polyamide kitchenware and for for formaldehyde from melamine kitchenware, EU-RL, NRL-FCM publication, version 7, April 30 th, 2011
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