Dépistage de la syphilis sur automate multiparamétrique trique d immunoanalysed. Dr Patrice SEDNAOUI Institut Alfred Fournier Paris

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1 Dépistage de la syphilis sur automate multiparamétrique trique d immunoanalysed Dr Patrice SEDNAOUI Institut Alfred Fournier Paris

2 Introduction Maladie systémique bactérienne sexuellement transmissible due à Treponema pallidum Longue évolution sur plusieurs années avec possibilité de complications graves Phases distinctes : incubation, phases primaires, secondaires et tertiaires entrecoupées es de phases de latence Toutes les phases ne sont pas obligatoires Durée e et expression clinique variable, faisant de la syphilis une maladie difficile à diagnostiquer : Phases de latence (incubation, primaire -secondaire, secondaire-tertiaire, parfois absence de phase secondaire Manifestations cliniques de la phase primaire parfois cachées Manifestation primaires et secondaires spontanément régressivesr Rareté de la maladie, méconnaissance m des médecins m et patients Absence d immunitd immunité acquise durable. Recontamination possible.

3 Stades cliniques de la syphilis non traitée Incubation silencieuse : environ 3 semaines [10-100j] 100j] Syphilis récente r ou précoce: contagiosité++ Phase de syphilis primaire : Obligatoire,, dure environ 1 mois Chancre indolore, adénopathie satellite, riche en trépon ponèmes Phase d apparition des anticorps sériques Phase de syphilis secondaire : non obligatoire,, dure environ 6 mois à 1 an Phase de dissémination à tous les tissus Poussées successives d érosions des muqueuses et d éd éruptions cutanées es,, avec adénopathies et signes générauxg Synthèse d anticorps d maximale Complications neuro-méning ningées (atteinte médullaire, m nerfs craniens,, oculaires) Phase de syphilis latente précoce coce: <1an d éd évolution - absence de signes cliniques - phase sérologique Syphilis latente 2 à 30 ans Syphilis tardive: Phase de syphilis latente tardive: > 1an d éd évolution Phase de syphilis tertiaire: non obligatoire, ou syphilis tardive symptomatique Lésions cutanées, viscérales, cardio-vasculaires ou neurologiques chez 1/3 des patients

4 Chez qui dépister d la syphilis acquise? Hommes ayant eu des rapports sexuels non protégés s avec des hommes, fellation comprise Travailleurs du sexe ayant eu des rapports non protégés, fellation comprise Personnes ayant eu des rapports non protégés s avec des travailleurs du sexe Lors du diagnostic ou en cas d ATCD d de gonococcie, de LGV et d infection d à VIH Personnes ayant eu des rapports non protégés s avec plusieurs partenaires par an Migrants en provenance de pays d endd endémie (Afrique, Asie, Europe de l Est, l Amérique du Sud). Lors d une d incarcération ration Après s un viol.

5 Syphilis congénitale nitale Risque surtout > SA Risque de transmission très élevé en cas de syphilis récente r (50-100%) Risque plus faible en cas de syphilis tardive (10%) Extrêmement grave: - mortalité fœtale, néonatale n (40% en cas de syphilis récente) r - accouchement prématur maturé - retard de croissance - syphilis congénitale nitale précoce ou tardive avec risque de séquelles s définitivesd Dépistage: : très s important chez la femme enceinte Lors du 1 er examen prénatal (au mieux lors du 1 er trimestre de la grossesse) chez toutes les femmes. Au 3 ème trimestre, si la femme ou son conjoint ont eu des rapports sexuels els non protégés s avec un nouveau partenaire après s le 1 er dépistage. Avant ou après s l accouchement l en l absence l de sérologie s au cours de la grossesse. Proposer le dépistage d de la syphilis aux femmes ayant des ATCD d avortement spontané ou d enfant d mort-nés.

6 Recrudescence des IST en France à partir du milieu des années 1990 HAART Incidence élevée des gonococcies (puis diminution) Gonococcies Syphilis LGV rectale - Syphilis - Gonococcie - Chancre mou -LGV Les IST «classiques» ne sont plus à déclaration obligatoire

7 Surveillance des IST : sources des données Patients Réseaux de laboratoires - Rénago : gonocoque (1986) - Rénachla : chlamydia (1989) Réseau de cliniciens (RésIST) Surveillance : syphilis (2000) gonococcie (2004) CNR - Gonocoque : résistances - Chlamydia : LGV (2010) - Syphilis -HPV InVS / Cire

8 Syphilis récentes : en augmentation (1) En 2011, 113 sites : 72% des patients consultant dans Ciddist et CDAG Augmentation des cas surtout hors Ile-de-France chez hommes homo-bisexuels Co-infections VIH 38% (stable depuis 2003) 81% des VIH+ connus sous ARV Réseau RésIST Syphilis primaire, secondaire et latente précoce < 1 an

9 Syphilis récentes : en augmentation (2) En 2011, Augmentation des cas chez hommes homo-bisexuels (HSH : 83% des cas) Stable chez hommes et femmes hétéros Réseau RésIST

10 Syphilis récentes : comportements sexuels Nombre de partenaires : stable Utilisation du préservatif : depuis 2009, légère diminution de l utilisation systématique lors des pénétrations anales et vaginales persistance d une très faible utilisation régulière lors des fellations (7%) Réseau RésIST

11 Ration H/F 4/1 Chancre syphilitique Siège ulcération Aspect ulcération Guérison spontanée Sillon balano-pr préputial,, prépuce, puce, fourreau, grandes lèvres,petites l lèvres, anus Ulcération superficielle, propre, indurée, régulière, indolore unique dans 70% des d cas oui Adénopathie inguinale 100% Unilatérale,non inflammatoire, indolore non fistulisée,, disparition spontanée

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20 Treponema pallidum Famille des Spirochaetaceae,, genre Treponema 4 sous-esp espèces de T.pallidum différentes pathologies T. pallidum subsp.. pallidum syphilis T. pallidum subsp. pertenue pian T. pallidum subsp. endemicum bejel T. pallidum subsp. carateum pinta ou carate (trépon ponématoses endémiques) Aucun trépon ponème n a n été cultivé in vitro Aucune technique de diagnostic direct ou indirect ne permet de distinguer ces agents pathogènes

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22 Structure antigénique nique de T. pallidum Très complexe Grande diversité dans la réponse r anticorps mise en évidence par des tests différents. Membrane d enveloppe d peu immunogène ne Lipoprotéine ine de l espace l périplasmique très immunogène ne (Lp( 47 Kd) Endoflagelles immunogènes nes Peptidoglycane peu immunogène ne Membrane cytoplasmique contient le cardiolipide (haptène de Wasserman)

23 DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE soit direct : sur lésions l visibles - fond noir - IF - détection du génome g soit indirect : dépistage et diagnostic - sérologie (négative au tout début d du chancre)

24 DIAGNOSTIC DIRECT Prélèvement des lésions l primaires et secondaires (chancre,, ganglions, plaques muqueuses, lésions l cutanées génitales): g Sérosité qui sourd de l ulcl ulcération Prélèvement dans du sérum s physiologique entre lame et lamelle Microscope au fond noir : fine bactérie spiralée e régulir gulièrement d une d longueur de 5 à 20 µm, mobilité en spirale,, flexion, en avant. Avantages: - simple - rapide (examen extemporané) - précoce - bonne fiabilité Mais: - Nécessite un observateur expériment rimenté et un laboratoire équipé - faible sensibilité (surtout si ATB ou antiseptiques) - faible spécificit cificité sur lésions l génitales g non péniennes, p orales (spirochètes commensaux) IFI : intéressant si la lecture est différée

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27 Détection génomique de T. pallidum PCR +++ car T. pallidum non cultivable. Dans échantillons biologiques ou T. pallidum sont peu nombreux Situations oùo l interprétation tation sérologique s peut être difficile Syphilis congénitale nitale Neurosyphilis. Liquide amniotique : PCR sensible et spécifique Sécrétions nasales (nouveau-né) ) placenta, cordon LCR : résultats r inconstants Technique lourde. Non disponible en routine en France

28 Ulcérations génitales g à l IAF 116 patients avec ulcérations génito-anales entre septembre 2011 et avril 2013: 57 ulcérations génitales, g 56 ulcérations ano-rectales 3 buccales. Il s agissait s de 108 hommes (93.1%) d âge d moyen 39.3 ans (+/-11.1, médiane m 39.2). Sur ce collectif, 19 fond noirs étaient positifs (16.4%). Les autres diagnostics retenus étaient : HSV (n=16) LGV (n=13) LGV+N. gonorrhoeae (n=2) LGV+HSV (n=2) N. gonorrhae (n=7) HSV+N. gonorrhoeae (n=1) infections bactériennes autres (MSSA, Strepto.. C/A n=14), ulcère VIH+HSV (n=1) inconnu (n=34). 21 PCR sont revenues positives dont 17 avaient aussi un fond noir r positif, 4 avaient un fond noir négatif n et 2 PCR étaient négatives n avec un FN positif. Ceci donne une sensibilité de la PCR comparée e au FN de 89.5% ( %) 98.7%) et une spécificit cificité de la PCR de 95.9% ( ). 98.9). La concordance entre les 2 méthodes m est excellente (kappa 0.82).

29 DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE 2 types de réactions r selon l antigl antigène ne utilisé. Tests à antigènes nes trépon ponémiques (TT): détectant des anticorps spécifiques des trépon ponèmes assurent le diagnostic d une d trépon ponématose - Tests à antigènes nes non trépon ponémiques(tnt): (cardiolipides): non spécifiques caractère re actif d une trépon ponématose

30 Réactions à antigène ne trépon ponémique (TT) TPHA, MHA-TP, TPPA FTA abs EIA (ELISA et TDR) Western blot Réactions à antigène ne non trépon ponémique (TNT) VDRL RPR Détection des IgM spécifiques FTA abs IgM SPHA EIA-IgM IgM WB-IgM

31 VDRL ou RPR Antigène ne : suspension de microcristaux de cholestérol + cardiolipide +- charbon ou latex coloré L Ag cardiolipidique est présent dans tous les trépon ponèmes pathogènes Principe : en présence d anticorps anti-cardiolipides agglutination de l antigl antigène ne visible à l œil nu ou au microscope Test qualitatif: dilution de dépistage d : pure Test quantitatif: si positif, dilutions de 2 en 2 Intérêt : Anticorps se positivant précocement en primo-infection infection : 8 à10j après s le chancre (1à 4semaines) Bon indicateur d efficacitd efficacité du traitement (suivi sérologique) s Inconvénient nient : - lecture subjective Peu spécifique (faux+) grossesse, infections virales, bactériennes ou parasitaires, maladies auto-immunes, âge, toxicomanie.. Phénom nomène ne de zone (faux -): (syphilis II et LP 1-2% 1 cas (HIV+)

32 TPHA (T Pallidum hemagglutination Assay) Antigène ne : lysat de T. pallidum souche Nichols absorbés s sur des hématies h (aviaires, humaines, ovines) Principe : hémagglutination passive. Si présence d anticorpsd spécifiques anti-tr tréponème hémagglutination des hématiesh -Test qualitatif: : dilution de dépistage d : 1/80 -Test quantitatif: : si positif, dilutions de 2 en 2 Intérêt : - spécifique+ - test facile, peu coûteux - se positive environ 8 à10j après s le chancre Limites : peu influencé par le traitement, inutile pour le suivi thérapeutique rares faux positifs (lyme( lyme,, paludisme, MNI, grossesse, maladies auto-immunes..) Variante: TPPA (T.pallidum( particle agglutination) support Ag= gélatine, g automatisable

33 Immunofluorescence indirecte (FTA-abs) Antigène ne : suspension standardisée e de T.pallidum fixés s sur une lame Principe : le sérum s (absorbé et dilué au 1/5 pour éliminer les réactions non spécifiques) est déposd posé sur la lame. La fixation des anticorps aux trépon ponèmes est révélée r à l aide d anticorps d marqués à la fluoresceine -Test qualitatif : dilution de dépistage d : 1/5 -Test quantitatif: : si positif, dilutions au 1/50, 1/200 et de 2 en 2 Intérêt : - réaction la plus précoce et la plus sensible en phase I environ 5j après s le chancre - détection possible des IgM (Nn( Nné) Limites : Peu adaptée e aux grandes sériess Personnel expériment rimenté et matériel, lecture subjective Faux positif (maladies auto-immunes et infectieuses) Titres peu influencés s par l antibiothl antibiothérapie

34 EIA Antigènes nes : lysats de T.pallidum ou Ag recombinants fixés s sur support Principe : les anticorps fixés s sont révélés r s par les anti-globulines marquées Intérêt : Détecte les IgG ou les IgM Mixtes(G+M) et Ag recombinants: sensibilité et spécificit cificité comparable au couple TPHA/VDRL Lecture objective, automatisable Dépistage de grande séries s (CTS) Minimisation des risques d erreur d de manipulation et de transcription Limites : Tests qualitatifs essentiellement Ne dispense pas de réaliser r les autres tests si positif Coût Différents kits: réacto-vigilance++ Inutile pour le suivi d un d traitement

35 TDR (tests de diagnostic rapide) Immuno-chromatographie, immuno-analyse Sur bandelette Sur savonnette Sur gel Résultat rapide en consultation pour guider le traitement si accès s limité au laboratoire Sensibilité et spécificit cificité très s variables, souvent insuffisantes!

36 Western blot ou immuno-empreintes sur trépon ponèmes Antigène: ne: 3 protéines trépon ponémiques suffisantes et essentielles pour affirmer une positivité : La lipoprotéine ine membranaire majeure de 47 kd Deux protéines membranaires de 17 kd et de 15kD Principe: Protéines recombinantes fixées sur une bandelette de nylon incubées avec le sérums Intérêt: Permettant de détecter d des IgG et les IgM Très s sensible et spécifique (mais pas évalué en phase primaire) Limite: Coût+++ Non adapté aux séries. s

37 Détection des IgM spécifiques Techniques : - FTA-abs IgM - SPHA (immunocapture et hémaggltination) - ELISA IgM (immunocapture) - WB-IGM Limites Bonne spécificit cificité mais manquent de sensibilité: : ne doivent être pris en compte que si positifs Intérêt : - IgM : premiers anticorps à apparaître en cas de primo-infection infection intérêt en cas de doute sérologique s, sérologie s dissociée - Chez le nouveau-né : IgM+ affirme un syphilis congénitale nitale production d anticorps par le nouveau-né - Neurosyphilis: : IgM dans le LCR - IgM: infection souvent active - Chez le patient traité : la persistance d IgM d fait craindre un échec thérapeutique et indique la nécessitn cessité d un nouveau traitement

38 Cinétique des anticorps : syphilis non traitée FTA-abs, FTA IgM, EIA IgM, EIA IgM-IgG, IgG, EIA IgG : 25 à 30 jours après s contamination (environ 5j du chancre) TNT(VDRL) et TT(TPHA) les jours suivants: ordre de positivation variable d un d individu à l autre. souvent 30 à 40j après s contamination (environ 8-10j 8 du chancre) Les anticorps augmentent titres élevés s en phase secondaire (6 à 18 mois d éd évolution) Chute des anticorps en phase de latence (latente tardive) avec TNT(VDRL) +-+ TT restent le plus souvent positifs Phase III, ré-ascension r des anticorps à taux variables

39 Cinétique des anticorps: syphilis traitée Si traitement au début du chancre : la sérologie s peut rester négative Si traitement au stade de syphilis primaire: chute rapide des anticorps (2 à 4 dilutions pour TNT) et disparition en 3 à 6 mois Si traitement au stade de syphilis secondaire récenter (3 à 6 mois après s le contage) une négativation des anticorps est possible en environ un an Si traitement plus tardif: : chute des IgM spécifiques et du TNT (négatif 1 cas/2), mais persistance d une d cicatrice sérologique s en TT

40 INTERPRETATION SIMPLIFIEE TT : si positif +++ le patient a contracté une trépon ponématose On regarde le TNT la positivité et le titre informent sur l évolutivité de la maladie. TT + TNT : bonne couverture sur l ensemble l des phases sauf les syphilis très s précoces En dépistaged pistage: TNT : Intérêt surtout clinique TT : Intérêt surtout épidémiologique

41 Interprétation tation TT- TNT- - absence de trépon ponématose - syphilis très s récente r - syphilis guérie (traitée e précocement) TT+ - syphilis active TNT+ - syphilis latente (ayant gardé une TNT+) - syphilis traitée e ou guérie (ayant gardé une TNT+) - trépon ponématose endémique TT- - faux + TNT+ - syphilis très s précoce (1ers jours du chancre) TT+ TNT- - syphilis guérie (cicatrice sérologique) s - syphilis latente tardive - syphilis très s précoce (1ers jours du chancre) - syphilis tertiaire très s ancienne (rare) - faux positif (rare) - trépon ponématose endémique

42 Stratégies sérologiques s existantes dans le monde En France : Réalisation concomitante d un d TT (TPHA, FTA, EIA) et d un d TNT (VDRL, RPR). En cas de positivité d au moins un des deux tests de dépistage, d un titrage doit être pratiqué sur les deux tests. Des tests de confirmation sont prévus sans précision quand à leurs indications (WB IgG, WB IgM). Aux Etats-Unis : Le CDC préconise le dépistage d par TNT, à confirmer en cas de positivité par un TT. En pratique, les laboratoires utilisent le dépistage d avec TT (EIA surtout), suivi d une d confirmation par TNT si positif. Si discordance entre les deux tests, un autre TT est effectué. Au Royaume-Uni : Dépistage avec TT (EIA ou TPPA), à confirmer si positif avec TT différent. Si les 2 TT sont positifs, alors un TNT est effectué. Si discordance entre les TT, préconisation d un d WB ou FTA.

43 Nomenclature Française aise actuelle Dépistage: deux réactions r obligatoires : qualitatif TNT : VDRL (latex, coloré,, charbon) TT: : TPHA, EIA, FTA abs B20 Diagnostic En cas de réaction r positive ou dissociée: - Titrage sur chaque groupe: quantitatif B40 - Tests complémentaires mentaires et tests de confirmation Confirmation IgG: Immuno-empreinte ou immuno-blot IgG B180 Recherche des IgM en cas de sérologie s positive B60 Confirmation IgM: Immuno-empreinte ou immuno-blot IgM B 180

44 Evaluation of the ADVIA Centaur Syphilis Assay in Routine Conditions for the Diagnosis of Syphilis P. Sednaoui, L. Monfort, J. Broyon, A. Goubard Institut Alfred Fournier, Laboratoire, Paris, France

45 Objectives Comparaison of the ADVIA Centaur Syphilis (SYPH) assay to our manual TPHA (TPHA, Bio-Rad, Marnes-la- Coquette, France) and RPR (RPR NOSTICON II, biomérieux SA, Marcy l'etoile, France) methods that are used in routine in our lab, for the diagnosis of Syphilis. The SYPH assay is a fully automated immunoassay that uses Tp15 and Tp17 recombinant antigens for the detection of total antibodies specific of Treponema pallidum. This assay was run in our lab on our ADVIA Centaur XP system. Analyzer and assay are both from Siemens (Siemens Healthcare Diagnostics SAS, Saint-Denis, France).

46 Methods 1074 patient samples from our routine workload were tested by our qualitative TPHA and RPR methods and few days after by the ADVIA Centaur SYPH assay. Our current routine algorithm is the following: reactive samples are tested by quantitative TPHA and RPR methods strongly reactive samples with TPHA but negative with RPR are checked by dilutions with RPR to avoid any prozone effect with this method. Reactive patients with TPHA and RPR methods without previous results or with a significant increase of the titers are tested by immuno- fluorescence (IF) for specific IgM detection. In addition, any patient with a genital ulceration has a direct research of Treponema (darkfield microscope).

47 Results The overall agreement between the ADVIA Centaur SYPH assay and our TPHA and RPR methods was 99.81% (1070/1072). All 57 reactive samples with both TPHA and RPR methods were reactive with the SYPH assay (observed clinical sensitivity=100% (57/57)). In addition, 100 reactive samples with TPHA but negative with RPR R were all reactive with the SYPH assay. 915 negative samples with both TPHA and RPR were all negative with the SYPH assay except 2 samples; the 1st sample was a very recent infection sample (genital ulceration showing Treponema and specific IgM by IF) the 2nd sample was considered as false-positive with the SYPH assay. Observed clinical specificity=99.89% (913/914).

48 Conclusion The ADVIA Centaur SYPH assay has shown to be a highly specific and sensitive method for Syphilis screening including Primary, Secondary and Latent Syphilis infection. There is no correlation between the signals measured by the analyzer and titers obtained with TPHA. Reactive samples should continue to be tested by quantitative RPR methods and TPHA.

49 Traitement Penicilline G (Extencilline( Extencilline) ) 2,4MU Voie IM avec Xylocaïne sans adrénaline Syphilis précoce: une dose unique Syphilis tardive: 1 injection/semaine x 3 Neurosyphilis: doses plus élevées: 20MU/j traitement plus long: 10-15j voie IV

50 POINTS ESSENTIELS La syphilis reste un problème mondial de Santé Publique, Un chancre syphilitique doit systématiquement être évoqué devant une ulcération de muqueuse (génitale, anale, buccale) En pratique courante : recherche de trépon ponème sur toute lésion l génitale suspecte et sérodiagnostic s associant un TNT et et un TT En cas de contage très s récent, r un TNT ou TT négatifs n n excluent n pas le diagnostic d une d syphilis débutante. d Les tests EIA utilisants des antigènes nes recombinant et détectant d les IgG et les IgM ont l avantage l d être d très s sensibles, très s spécifiques et automatisables. Un TT positif en cas de dépistage d chez une femme enceinte doit être confirmé par un autre TT ou par immunoblot. Ne pas oublier de dépister d le VIH +++ et les autres IST devant tout patient suspect de syphilis. Examiner et traiter les partenaires Prévention et information indispensables