ARF1 contrôle la migration des cellules hautement invasives du cancer du sein via Rac1

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1 Université de Montréal ARF1 contrôle la migration des cellules hautement invasives du cancer du sein via Rac1 par Sebastian Lewis-Saravalli Département de pharmacologie, Université de Montréal Faculté de Médecine Mémoire présenté à la Faculté de Médecine en vue de l obtention du grade de Maîtrise ès sciences en pharmacologie option moléculaire Décembre, 2012 Sebastian Lewis-Saravalli, 2012

2 Université de Montréal Faculté des études supérieures et postdoctorales Ce mémoire intitulé : ARF1 contrôle la migration des cellules hautement invasives du cancer du sein via Rac1 Présenté par : Sebastian Lewis-Saravalli évalué par un jury composé des personnes suivantes : Dr. Jean-François Gauchat, président-rapporteur Dr. Jean-François Côté, examinateur externe Dre. Audrey Claing, directrice de recherche

3 i SOMMAIRE Dans un contexte où la forte prévalence du cancer du sein chez les femmes demeure depuis plusieurs années un enjeu de société majeur, les nouvelles stratégies visant à réduire la mortalité associée à cette maladie sont le sujet de nombreuses recherches scientifiques. Les facteurs d ADP-ribosylation sont des petites protéines G monomériques importantes pour la réorganisation du cytosquelette d actine, le remodelage des lipides membranaires et la formation de vésicules. Notre laboratoire a précédemment montré qu ARF1 est surexprimée dans les cellules hautement invasives du cancer du sein et contribue à leur phénotype migratoire accru. Dans le cadre de ce mémoire, nous avons défini le rôle de cette GTPase dans la migration de telles lignées cellulaires. Pour ce faire, nous avons étudié le rôle d ARF1 dans l activation de Rac1, un membre de la famille des GTPases Rho connu pour son implication dans la formation de lamellipodes ainsi que dans la migration cellulaire. Globalement, nous avons déterminé que l activation d ARF1 permet l activation subséquente de Rac1 ainsi que de la voie de signalisation nécessaire au processus de migration. Par une approche d interférence à l ARN dans les cellules MDA-MB-231, nous avons d abord montré la contribution essentielle de Rac1 la migration dépendante d ARF1. Puis, de façon à établir le mécanisme derrière cette régulation, nous avons montré que l inhibition de l expression endogène d ARF1 altère l activation de Rac1 dépendante de l EGF. Nous avons ensuite examiné les conséquences d une telle inhibition sur les partenaires d interaction de Rac1. Nous avons découvert qu ARF1 et Rac1 forment un complexe constitutif, puis qu ARF1est nécessaire à l association de Rac1 à IRSp53, une protéine importante dans la formation de lamellipodes. La translocation dépendante de l EGF du complexe Rac1/IRSp53 à la membrane plasmique est également sous le contrôle d ARF1. En conclusion, cette étude fournit un nouveau mécanisme par lequel ARF1 régule la migration cellulaire et identifie cette GTPase en tant que cible pharmacologique prometteuse pour freiner le développement des métastases chez les patients atteints du cancer du sein. Mots-clés : Cancer du sein, Récepteur du facteur de croissance épidermique, Facteur d ADPribosylation 1, Rac1, Migration cellulaire, IRSp53

4 ii TABLE DES MATIÈRES SOMMAIRE... i TABLE DES MATIÈRES... ii LISTE DES FIGURES... iv LISTE DES ABRÉVIATIONS... v REMERCIEMENTS... viii CHAPITRE I. INTRODUCTION Le cancer du sein L origine La carcinogenèse La formation de métastases Les sous-types Les traitements Les thérapies générales Les thérapies ciblées Les récepteurs à activité tyrosine kinase Les récepteurs du facteur de croissance épidermique Le mécanisme d activation de l EGFR Les voies de signalisation associées à l EGFR La voie Ras/MAPK La voie PI3K/Akt La voie STAT L implication de l EGFR dans le cancer du sein Les thérapies ciblant l EGFR Les petites protéines G monomériques La famille des facteurs d ADP-ribosylation La structure des ARFs La régulation de l activité des ARFs La GTPase ARF

5 iii La famille des Rho La régulation de l activité des Rho La GTPase Rac La migration cellulaire La protéine IRSp Hypothèse de recherche CHAPITRE II. ARTICLE Résumé Abstract Introduction Materials and Methods Results Discussion References Figures CHAPITRE III. DISCUSSION ARF1 dans la migration cellulaire La communication entre ARF1 et Rac ARF1 dans le remodelage du cytosquelette d actine Conclusion Perspectives La modulation de l état d activation d ARF1 et Rac La modulation de l interaction ARF1/Rac L implication des GEFs L implication des isoformes d ARF La régulation de l activité de WAVE ARF1 dans la formation de métastases ARF1 dans les autre types de cancer BIBLIOGRAPHIE... 66

6 iv LISTE DES FIGURES Figure 1. La carcinogénèse... 3 Figure 2. La famille du récepteur du facteur de croissance épidermique Figure 3. Modèle d activation de l homodimère EGFR Figure 4. Les voies de signalisation de l'egfr Figure 5. Le cyclage des GTPases Figure 6. La structure tridimensionnelle d'arf Figure 7. La migration cellulaire... 29

7 v LISTE DES ABRÉVIATIONS AREG : amphiréguline ARF: facteur d ADP-ribosylation Arp2/3 : protéine reliée à l actine 2/3 ARNO : ADP-Ribosylation factor Nucleotide-binding site Opener BRCA : breast cancer BTC: bêtacelluline Cdk: kinase dépendante des cyclines EGF : facteur de croissance épidermique EGFR : récepteur du facteur de croissance épidermique ER : récepteur à l œstrogène ERK : Extracellular-Regulated Kinase EREG : épiréguline GAP : protéine activatrice de GTPase GEF : facteur d échange de nucléotide guanylique GDI : inhibiteurs de la dissociation du GDP GDP : guanosine diphosphate GTP : guanosine triphosphate HB-EGF : facteur de croissance épidermique liant l héparine HER2 : récepteur humain du facteur de croissance épidermique de type 2 IMD : IRSp53 and MIM (missing in metastases) homology Domain IRSp53 : substrat p53 du récepteur tyrosine kinase à l insuline MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase MEK : MAP ERK kinase MMP : métalloprotéase matricielle PARP : poly(adp-ribose) polymérase PI3K : phosphoinositide 3-kinase PIP2 : phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate PIP3 : phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate

8 vi PR : récepteur à la progestérone RTK : récepteur à activité tyrosine kinase SH2/3 : Src Homology 2/3 STAT : Signal Transducer and Activator of Transcription TGFα : facteur de croissance transformant alpha VEGF : facteur de croissance de l endothélium vasculaire WASP : protéine du syndrome de Wiskott Aldrich WAVE : protéine homologue à la verproline de la famille des WASP

9 vii À mes parents Isabelle et Miguel

10 viii REMERCIEMENTS J aimerais avant tout remercier ma directrice de recherche Dre. Audrey Claing. La généreuse confiance dont tu m as témoigné en m acceptant au sein de ton laboratoire me touche beaucoup et je t en serai reconnaissant tout au long de ma vie professionnelle. Merci de m avoir ouvert les yeux sur le monde de la science et d avoir été pour moi un mentor aussi inspirant. Je tiens également à remercier tous les membres de mon équipe, soit Pierre-Luc Boulay, Shirley Campbell, Sabrina Schlienger, Ricardo Charles, Eric Haines, Danaë Tassy et Mohamed Bourmoum, pour avoir fait de mon passage au laboratoire une expérience plus humaine. Merci particulièrement à Rick et Sab pour les beaux moments culturels (théâtre, impro, humour), les 5 à 7 impromptus, les courses de chaises, et tous ces autres beaux souvenirs qui m ont fait sentir que nous étions plus que de simples collègues de laboratoire. Il m est évidemment très important de remercier tous les membres de mon jury pour avoir si gentiment accepté d examiner mon mémoire. Sachez que votre temps et dévouement sont sincèrement appréciés. D un point de vue plus personnel, merci infiniment à ma famille d avoir fait de moi la personne que je suis. Votre amour a été pour moi la plus grande des motivations et votre soutien m a été essentiel tout au long de ma maîtrise. J espère de tout cœur que cet accomplissement contribuera à vous rendre fiers. Merci à ma copine Marie-France pour son immense support et ses belles attentions qui ont apporté l équilibre nécessaire au maintient de ma persévérance. Je t aime! Merci également à mon grand ami Marc-André de s être occupé de moi en me faisant constamment rire aux éclats! Toujours là pour moi, même quand je suis sur les "chapeaux de roue". Finalement, merci à des femmes courageuses telles que Solange Longpré, Sylvie Mathurin, et Louise Gareau qui ont tous été touchées à différents niveaux par les problématiques discutées dans cet ouvrage. Votre courage est pour moi une grande source d inspiration.

11 1 CHAPITRE I. INTRODUCTION 1.1. Le cancer du sein L origine Le cancer du sein est la forme de cancer la plus répandue chez les Canadiennes. Il est estimé qu une femme sur neuf risque d'en être atteinte au cours de sa vie (Société canadienne du cancer, 2012). Bien que les causes ne puissent pas toujours être décrites avec précision, de nombreux gènes de susceptibilité au cancer du sein ont été identifiés. Des mutations dans ces gènes peuvent être retrouvées au niveau des cellules germinales dans le cas d une prédisposition héréditaire au cancer, ou dans les cellules somatiques dans le cas de tumeurs sporadiques (1). Les individus héritant d une mutation germinale au niveau des gènes de susceptibilités BRCA (Breast Cancer), particulièrement BRCA1 et BRCA2, ont un risque significativement plus élevé de développer le cancer du sein ( 2,3). Ces gènes sont reconnus pour leur implication dans la régulation de la réparation des dommages à l ADN (4). Ainsi, un défaut de fonctionnalité des protéines codant pour ces gènes crée une instabilité génétique favorisant l apparition du cancer en interférant avec la fidélité du processus de réplication de l ADN. Plusieurs autres gènes de plus faible pénétrance tels que CHEK2, ATM, NBS1, RAD50, BRIP1 et PALB2 ont été associés à un risque modéré de cancer du sein et sont également impliqués dans les cancer du sein familiaux (5,6). Bien que les mutations liées aux gènes précédemment évoqués puissent être retrouvés au niveau germinal, il est estimé que l hérédité n est responsable que de 5 à 10% des cas de cancer du sein reportés (7,8). La majorité des cas résultent plutôt de l accumulation de mutations au niveau des gènes somatiques, sans égard aux mutations germinales. Ces cancers, dits sporadiques, seraient causés par l exposition à des carcinogènes environnementaux tels que les œstrogènes (9), les radiations (10), la cigarette (11,12) et/ou des éléments de la diète (13).

12 La carcinogenèse Le développement d un carcinome, ou carcinogénèse, peut prendre des décennies suite à l exposition à une dose suffisante de carcinogène (14). De plus, il faut généralement plusieurs mutations dans les gènes de susceptibilité au cancer avant qu une tumeur se développe (9). Un model de progression en plusieurs étapes à été proposé pour décrire ce processus de carcinogenèse. Tel que décrit dans la figure 1, celui-ci comprend les étapes d initiation, de promotion et de progression vers la formation de métastases (15). Notons cependant que ce processus n est pas linéaire puisque certaines tumeurs peuvent être éliminées alors que d autres ne progressent pas jusqu à la formation de métastases. L initiation consiste en une altération génétique dans un gène lié au cancer de l épithélium mammaire. Tel que mentionné dans la section précédente, cette mutation peut être d origine héréditaire ou sporadique et sera conservée de manière permanente et irréversible. Vient ensuite l étape de la promotion dans laquelle la cellule mutée, alors génétiquement instable, est sensible aux effets d un promoteur (ex : hormone) stimulant la prolifération cellulaire. Lorsqu en présence d une exposition suffisante au promoteur, cette étape donne lieu à une expansion clonale interruptible et réversible qui initie le processus de néoplasie, soit la prolifération anormale des cellules mutées (16). Au fil de cette expansion, qui constitue l étape de progression, les cellules filles acquièrent des mutations somatiques additionnelles conduisant à un changement karyotypique. Celles-ci acquièrent alors de nouvelles fonctions telles que la perte de différentiation et d inhibition de contact, une croissance incontrôlée, la capacité d invasion, la néo-angiogénèse ainsi qu une capacité d échapper au système immunitaire et aux signaux d apoptose (17). Les cellules transformées évoluent ainsi d une tumeur bénigne vers un carcinome à caractère malin et, ultimement, vers la formation de métastases (18).

13 3 Figure 1. La carcinogénèse Lors de l initiation, une cellule normale subit une mutation permanente et irréversible lui offrant des avantages de prolifération. La promotion et la progression consistent en une expansion clonale donnant lieu à des cellules filles transformées. Ces cellules s organisent d abord en tumeur primaire, puis évoluent vers un carcinome à caractère malin.

14 La formation de métastases La formation de métastases est un processus en plusieurs étapes par lequel les cellules cancéreuses doivent envahir la matrice extracellulaire, pénétrer dans la circulation sanguine (intravasation), survivre au transport dans le système circulatoire, et finalement ressortir de la circulation sanguine (extravasation) afin de coloniser les organes distants (19-21). Puisqu environ 90% des cas de décès liés au cancer sont dues aux métastases (22,23), il y a intérêt à développer des stratégies de traitements permettant d inhiber leur formation. Plusieurs mécanismes sont utilisés pour permettre aux cellules tumorales d envahir les tissus environnants et les vaisseaux sanguins. Premièrement, la cellule doit être en mesure de se détacher des autres cellules. En effet, il a été démontré qu une forte expression d Ecadhérine, une protéine d adhésion cellule-cellule, est retrouvée dans les carcinomes mammaires in situ alors que les carcinomes avec métastases en expriment très peu (24). Cette différence d expression reflète la nécessité pour la cellule cancéreuse de se détacher des autres cellules afin de former une métastase. Deuxièmement, la cellule doit être en mesure de migrer. Tel qu il le sera décrit à la section 1.4 du présent manuscrit, le remodelage du cytosquelette d actine est essentiel à ce processus. Ainsi, la suractivation des protéines promouvant ce remodelage contribue au cancer du sein. L activation de WAVE3 (25) ou du complexe WAVE2-Arp2/3, par exemples, promeuvent la migration de cellules de cancer du sein hautement invasif (26). À l opposé, l expression d un dominant négatif de la Rho GTPase Rac1 inhibe la migration cellulaire de cellules de cancer du sein hautement invasif (27). Troisièmement, la cellule doit être en mesure de remodeler la matrice extracellulaire qui constitue une barrière à ses déplacements. Pour se faire, les cellules produisent des métalloprotéases matricielles (MMP) permettant la dégradation de protéines de la matrice extracellulaire de façon à se déplacer et à pénétrer dans la circulation sanguine (28). La MMP-1 et 7, par exemples, sont surexprimées dans les cellules de cancer du sein hautement invasives (29). Après avoir envahies les tissus environnant, les cellules tumorales doivent pénétrer à l intérieur des vaisseaux sanguins de façon à s éloigner de la tumeur primaire. Encore une

15 5 fois, la motilité cellulaire constitue une étape importante à ce processus puisqu il a été démontré que l inhibition de CD151, une protéine associée à l intégrine, permet d inhiber l intravasation cellulaire et la formation de métastases en réduisant la migration cellulaire (30). De plus, afin de voyager à travers la circulation sanguine, les cellules doivent acquérir une résistance à l anoïkose, soit l apoptose qui survient normalement lors de la perte de contact avec la matrice extracellulaire ou des cellules voisines (31). La surexpression de la protéine D4-GDI, par un mécanisme dépendant de Rac1, augmente la résistance à l anoïkose dans les cellules de cancer du sein hautement invasif (32). Une fois pénétrées dans la circulation sanguine, les cellules tumorales doivent finalement en ressortir afin de coloniser un organe secondaire. À ce moment, les cellules doivent retrouver leurs propriétés leur permettant de croître en formant une masse tumorale (33). De plus, la théorie de «la graine et du sol», formulée par Paget et al. (34), stipule que toutes les cellules complétant l étape d extravasation ne réussiront pas à se développer. En effet, la cellule, qui représente la graine, doit se trouver dans un environnement favorable à sa croissance, représenté par le sol, afin qu une tumeur secondaire puisse se former. Pour le cancer du sein, les sites de métastases les plus communs incluent les os, les poumons, le foie et le cerveau (35) Les sous-types On peut diviser le cancer du sein en au moins cinq sous-types basés sur un profil d expression de 500 gènes, soit le luminal de type A, luminal de type B, basal, ErbB2, et normal (36). Ceux-ci sont associés à des pronostics particuliers et à des potentiels de survie distincts (37,38). Les sous-types moléculaires sont généralement caractérisés par leur niveau d expression protéique du récepteur à l œstrogène (ER), à la progestérone (PR), ainsi qu au récepteur humain du facteur de croissance épidermique de type 2 (HER2). Les tumeurs luminales regroupent les cellules positives pour ER et exprimant les cytokératines de faibles poids moléculaires 8/18, un profil d expression rappelant les cellules épithéliales luminales de la glande mammaire normale (39). Parmi ce sous-type, les

16 6 tumeurs luminales de type B ont souvent un plus haut grade histologique, un taux de prolifération supérieur et un pire pronostic que les tumeurs luminales de type A (40). Les tumeurs ErbB2, quant à elles, sont généralement négatives pour ER et caractérisées par une surexpression de HER2 (36). Les tumeurs de type basal expriment les cytokératines de hauts poids moléculaires 5/6 et 17 et sont elles aussi généralement négatives pour ER, un profil rappelant les cellules basales/mésoépithéliales normales du sein (41,42). De plus, elles surexpriment souvent le récepteur du facteur de croissance épidermique (43). Parmi tous les cancers du sein, environ 15-20% sont dits triples négatifs (44). Cette appellation faisant référence à l absence des récepteurs ER, PR et HER2 est souvent confondue avec le sous-type basal. Bien qu aucun consensus ne soit établit quant à la différence entre ces 2 sous-types de cancers, des phénotypes différents suggèrent une distinction entre le cancer du sein triple-négatif et basal (45). Les cancers du sein triplenégatifs sont associés à un mauvais pronostic, notamment en raison du manque de thérapies ciblées (46,47) Les traitements Le traitement du cancer du sein repose sur plusieurs stratégies thérapeutiques. Des thérapies générales, pouvant s appliquer à tous les sous-types, constituent la base du traitement. À celles-ci peuvent s ajouter des thérapies ciblées, pouvant offrir des bénéfices dans certains sous-types particuliers Les thérapies générales Selon de nombreuses considérations cliniques telles que l âge, le type de tumeur, le grade histologique, l emplacement, le métabolisme de l individu, etc, différents traitements généraux sont mis à la disposition des patients atteints du cancer du sein. Parmi ceux-ci, on compte des traitements locaux tels que la chirurgie et la radiothérapie, ainsi que des

17 7 traitements systémiques tels que la chimiothérapie. Une association de traitements est généralement préconisée pour optimiser l efficacité de traitement (48). La chirurgie constitue le traitement le plus commun face au cancer du sein (49). Elle a pour but de retirer la tumeur ainsi qu une partie du tissus sain environnant (ex : ganglions, vaisseaux lymphatiques voisins, etc) susceptible de contenir des cellules tumorales. On parle d une tumorectomie dans le cas d une ablation mammaire partielle ou d une mastectomie dans le cas d une ablation totale. La radiothérapie et la chimiothérapie, pour leur part, ont pour but de freiner la progression tumorale. La radiothérapie consiste à créer des lésions à l ADN par exposition à de multiples doses de radiations (50). Les cellules cancéreuses réplicatives n ayant pas le temps de réparer ces dommages meurent tandis que les cellules saines, dont la machinerie de réparation est plus efficace, possèdent un avantage de survie (51). La chimiothérapie cible elle aussi les cellules en réplications (52) et consiste en l administration, souvent concomitante, de diverses molécules telles que des agents alkylants, des alcaloïdes, des antibiotiques ou des anti-métabolites par exemples. La combinaison de molécules possédant différents mécanismes d actions permet de réduire la possibilité de résistance aux médicaments (53) Les thérapies ciblées Selon les particularités associées aux différents sous-types de cancer du sein, des traitements ciblés peuvent être envisagés. Les patients dont les tumeurs expriment les récepteurs hormonaux (ER et PR) par exemple, peuvent avoir recours à l hormonothérapie. Celle-ci a pour but de freiner la progression tumorale en empêchant la signalisation via ces récepteurs, bien connus pour favoriser la prolifération cellulaire en réponse aux hormones (27,54-56). Ainsi, les antagonistes des récepteurs aux œstrogènes (ex : tamoxifène), les inhibiteurs de la synthèse d œstrogènes (ex : anastrozole) ou la suppression ovarienne constituent tous des exemples de l arsenal de l hormonothérapie. Les patients dont les tumeurs expriment HER2, quant à eux, peuvent avoir recours à des anticorps monoclonaux

18 8 (ex : trastuzumab) dirigés contre ce récepteur. L approbation de cette thérapie a d ailleurs grandement améliorée la survie des patients répondant à ce traitement (57,58). Dans le cas des patients triple négatifs par contre, le manque de cibles thérapeutiques a poussé la recherche vers le développement de thérapies ciblant des molécules surexprimées dans les cellules tumorales. Parmi les molécules ciblées, on retrouve par exemples le facteur de croissance de l endothélium vasculaire, certaines protéines impliquées dans les mécanismes de réparations, le facteur de croissance épidermique, la cible humaine de la rapamycine, certaines protéines de la voie de signalisation associée à Src, les histones déacétylases et les récepteurs aux androgènes (59). Le facteur de croissance de l endothélium vasculaire (VEGF) joue un rôle majeur sur l apport en oxygène aux tissus corporels, soit une étape essentielle à la formation de vaisseaux sanguins. Une forte expression du VEGF est associée à un mauvais pronostic dans le cancer du sein (60,61). Les inhibiteurs de l angiogénèse forment donc une stratégie thérapeutique intéressante pour contrer la progression tumorale. Le bevacizumab, par exemple, est un anticorps monoclomal dirigé contre le VEGF. Néanmoins, les études de phase III menées jusqu à présent sur cette molécules n ont pas permis de démontrer une amélioration du taux de survie des patients (62-64). La poly(adp-ribose) polymérase (PARP) est une protéine nucléaire abondante appartenant à une famille d enzymes permettant la poly(adp-ribosylation) de protéines liant d ADN. De par son rôle clé dans la réparation de l ADN, la famille des PARPs constitue une bonne cible thérapeutique contre le cancer. En ce sens, plusieurs études cliniques de phase I et de phase II ont conduits à des résultats positifs, ce qui a permis de mener les inhibiteurs de PARP aux études de phase III (65). La plupart de ces inhibiteurs sont des analogues de la β- nicotinamide adénine dinucléotide qui compétitionnent avec le site actif de l enzyme, une région hautement conservée à travers les différents homologues des PARPs (66). Utilisé en monothérapie, ils auraient le potentiel d induire l apoptose dans certains cancers en raison d une forte accumulation de dommages à l ADN, alors qu en combinaison avec un agent thérapeutique, ils pourraient potentialiser les effets du premier traitement (67).

19 9 Plusieurs autres molécules ont démontré un intérêt dans le traitement du cancer du sein triple-négatif. La voie PI3K/Akt étant souvent dérégulée dans le cancer du sein (68,69), l everolimus, un inhibiteur de mtor, a conduit à des effets bénéfiques chez les femmes atteintes d un cancer du sein positif pour HER2 (70). Le dasatinib, un inhibiteur de tyrosine kinase, est actuellement en essai mais n a pas encore démontré d efficacité lorsque pris seul (71). La bicalutamide, un inhibiteur des récepteurs aux androgènes, est présentement à l essai pour les patients atteints du cancer du sein métastatiques (72). Finalement, le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) est surexprimé dans environ 60% des cancers triples négatifs (73). Ce récepteur, faisant parti de la grande famille des récepteurs à activité tyrosine kinase, été associé aux processus de prolifération, de migration et de survie à l apoptose (74-76), faisant de l EGFR une cible intéressante pour freiner le développement tumoral Les récepteurs à activité tyrosine kinase Les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) sont des récepteurs de surface cellulaire possédant une grande affinité envers plusieurs facteurs de croissance, de cytokines et d hormones (77). Près de 20 classes différentes de RTK ont été identifiées (78). À l exception du récepteur à l insuline (79) et du récepteur au facteur de croissance semblable à l insuline-1 (80), ceux-ci existent tous sous la forme de monomères (81). Chaque monomère possède une région N-terminale extracellulaire, un domaine transmembranaire et une région C-terminale intracellulaire (82). La portion N-terminale contient une variété d éléments conservés propre à chaque famille de RTK et qui agissent à titre de sites de liaison à leurs ligands extracellulaires respectifs. La portion C-terminale est quant à elle très conservée entre les familles de RTK et contient des domaines catalytiques responsables de l activité kinase de ces récepteurs. Suite à la liaison de leur ligand, la dimérisation des récepteurs monomériques catalyse l autophosphorylation des résidus tyrosine du domaine intracellulaire des récepteurs et la phosphorylation des substrats des RTK.

20 10 Bien que considérés comme des régulateurs importants des processus biologiques normaux, les récepteurs tyrosine kinases ont aussi un rôle critique dans le développement et la progression du cancer du sein (83-85). Plus particulièrement, puisque la majorité des cancers du sein surexpriment l EGFR, celui-ci représente actuellement un domaine de recherche très actif Les récepteurs du facteur de croissance épidermique La famille du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), également appelée ErbB, constitue une des classes de RTK. Tel que représenté dans la figure 2, cette famille comprend quatre membres structurellement reliés : ErbB1 (aussi appelé HER-1, ErB1 ou EGFR), ErbB2 (HER-2 ou Neu), ErbB3 (HER-3) et ErbB4 (HER-4). Ces récepteurs sont activés par dimérisation et bien qu une combinaison de 10 dimères soit possible, ceux-ci ne sont pas tous biologiquement actifs (86). ErbB2, par exemple, ne possède aucun ligand connu, mais constitue le partenaire préféré de tous les membres de la famille en raison d une vaste boucle d interaction le rendant constitutivement disponible pour la dimérisation. ErbB3, quant à lui, ne possède pas d activité catalytique mais peut s associer aux autres membres pour les activer (87). Plusieurs ligands sont connus pour lier la famille de l EGFR, tel que le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur de croissance semblable à l EGF liant l héparine (HB-EGF), l amphiréguline (AREG), l épiréguline (EREG), le facteur de croissance transformant alpha (TGFα), l épigène, la bêtacelluline (BTC) et quatre isoformes de neuréguline (88,89). Ceux-ci comprennent tous une séquence connue comme le motif EGF constituée de six résidus cystéine spatialement conservés (90). Ce motif est nécessaire pour la liaison des membres de la famille de l EGFR. Les ligands de cette famille existent sous forme de précurseurs ancrés à la membrane dont les ectodomaines sont clivés par des métalloprotéinases, ce qui mène à la relâche de facteurs solubles permettant l activation de l EGFR (91). La portion de ligand transmembranaire peut également stimuler l EGFR des

21 11 cellules adjacentes via un mécanisme de signalisation juxtracrine (92). De plus, l EGFR est souvent transactivé par des récepteurs hétérologues tels que les récepteurs couplés aux protéines G (93). Figure 2. La famille du récepteur du facteur de croissance épidermique La famille du récepteur du facteur de croissance épidermique comprend les membres ErbB(1 à 4). La liaison de leur ligand respectif conduit à la dimérisation des récepteurs, un processus nécessaire à leur activation. Le récepteur ErbB2 ne possède pas de ligand connu. Le récepteur ErbB3 ne possède pas d activité catalytique. (Inspiré de Hynes et al., 2005) (94)

22 Le mécanisme d activation de l EGFR Le mécanisme d activation de l EGFR comprend les étapes d activation du récepteur depuis la liaison du ligand au niveau de sa portion extracellulaire jusqu à la phosphorylation de son domaine kinase intracellulaire où les effecteurs interagiront. Ce mécanisme peut être schématisé selon l exemple de l hétérodimère ErbB2-ErbB3 illustré à la figure 3. La portion extracellulaire de l EGFR est formée de quatre domaines (I-IV). Les domaines I et III servent à la liaison bivalente du ligand à l intérieur d un même monomère. Le domaine II, quant à lui, contient une boucle de dimérisation qui, en absence de ligand, se trouve séquestré par des interactions moléculaires du domaine IV. Ces interactions stabilisent la conformation repliée du récepteur, inhibant ainsi la dimérisation du récepteur. Suite à la liaison du ligand, un changement conformationnel libère et expose la boucle de dimérisation. Cette conformation allongée lui permet d interagir avec un second récepteur lié à un ligand de façon à former un homodimère ou un hétérodimère (95,96). Le domaine kinase intracellulaires de l EGFR est, pour sa part, constitué de deux lobes. Lors de la dimérisation des récepteurs, le lobe C-terminal d un récepteur entre en contact avec le lobe N-terminal de l autre récepteur de façon à le transphosphoryler asymétriquement. Cette activation induit l autophosphorylation des résidus tyrosine des domaines cytoplasmiques des récepteurs, ce qui génère des sites de recrutement pour plusieurs protéines en aval (97-99). Le complexe EGFR-ligand est ensuite internalisé dans les endosomes précoces de façon à être recyclé à la membrane plasmique ou ubiquitiné pour sa dégradation (88).

23 13 Figure 3. Modèle d activation de l homodimère EGFR En absence de ligand (L), l EGFR adopte une conformation repliée. Lors de la liaison du ligand, l EGFR activé adopte une conformation allongée. Au niveau de la portion extracellulaire, les récepteurs dimérisent au niveau du domaine II. Au niveau de la portion intracellulaire, le lobe C-terminal d un récepteur transphosphoryle asymétriquement le lobe N-terminal de l autre récepteur, provoquant l autophosphorylation des résidus sur les queues cytoplasmiques. (Inspiré de Carraway et al., 2009) (100) Les voies de signalisation associées à l EGFR Tel qu illustré à la figure 4, l activation de l EGFR induit la cascade de plusieurs voies de signalisation. Parmi celles-ci, l EGFR est principalement connu pour activer la voie Ras/MAPK, la voie PI3K/Akt et la voie STAT, résultant en l activation de plusieurs processus biologiques tels que, la survie cellulaire (101), l invasion (102), la prolifération ou la migration cellulaire (74).

24 14 Figure 4. Les voies de signalisation de l'egfr Suite à l activation de l EGFR, celui-ci signale via les voies de signalisation Ras/MAPK, PI3K/Akt et STAT. Ces voies consistent en une cascade de phosphorylation de protéines résultant en la transcription de gènes responsables de nombreux processus biologiques.

25 La voie Ras/MAPK Une fois l EGFR activé, les résidus tyrosines phosphorylés des domaines cytoplasmiques du récepteur servent de site de liaison pour une série de protéines adaptatrices permettant l activation de la GTPase Ras. Pour ce faire, la protéine Grb2 se lie aux résidus tyrosines phosphorylés via son domaine SH2. Les domaines SH3 de cette protéine adaptatrice permettent ensuite la liaison aux motifs riches en proline de SOS, un facteur d échange de nucléotide catalysant l activation de la GTPase Ras (103). Une fois la GTPase activée, celle-ci initie une cascade de phosphorylation de protéines constituant les MAP kinases, en débutant par la protéine kinase Raf. Raf activée phosphoryle ensuite les résidus sérines et thréonines des protéines kinases MEK1/2. Ces dernières phosphorylent à leur tour les résidus thréonines et tyrosines de ERK1/2, un groupe de protéines qui, une fois activées, transloquent au noyau afin d y phosphoryler plusieurs facteurs de transcription. Parmi les protéines activées par ERK1/2, on retrouve Jun, une protéine composant le facteur de transcription AP-1, et des protéines de la famille des facteurs de transcription Ets (104). Ces facteurs de transcriptions activent la transcription de gènes précoces codant pour la production d autres facteurs de transcription, incluant Myc, Fos, et Jun, qui activent à leur tour la transcription d une famille de gènes tardifs. Un de ces gènes code pour le facteur de transcription E2F dont le rôle est de contrôler l entrée en phase S (105). Parmi les gènes tardifs, plusieurs gènes codent également pour les cyclines ou les kinases dépendantes des cyclines (Cdk) dont la production conduit à la formation de complexes Cdk-cycline qui phosphoryle Rb et, ainsi, provoque le passage de la phase G1 à S La voie PI3K/Akt L activation de l EGFR conduit également à l activation de la phosphoinositide 3- kinase (PI3K). Celle-ci peut être activée de plusieurs façons, soit par sa liaison directe aux résidus tyrosines phosphorylées du récepteur, via l intermédiaire de protéines adaptatrices telles qu IRS-1 (106), ou via d autres protéines telle que la GTPase Ras

26 16 activée (107). Une fois activée, la PI3K migre dans la paroi interne de la membrane plasmique et catalyse l addition d un groupement phosphate sur le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2), un des lipides membranaires constituant la bicouche lipidique de la membrane plasmique. Le PIP2 est alors converti en phosphatidylinositol 3,4,5- trisphosphate (PIP3). Le PIP3 recrute ensuite des protéines kinases à la surface interne de la membrane plasmique conduisant à l activation de la sérine-thréonine kinase Akt. En phosphorylant plusieurs protéines clés, telles que GSK3, mtor, et des facteurs de transcription de la famille Forkhead, Akt permet la suppression de l apoptose et inhibe l arrêt du cycle cellulaire (108). L effet net de la voie de signalisation PI3K est donc de promouvoir la survie cellulaire et la prolifération La voie STAT Les protéines STAT ont la capacité d être activés par leur liaison aux résidus tyrosines phosphorylés de l EGFR activé via leur domaine SH2. Une fois activés, les STAT dimérises et transloquent au noyau où ils se lient à des gènes ou des facteurs de transcription tels que Fos et Jun, permettant ainsi la prolifération cellulaire (109) L implication de l EGFR dans le cancer du sein L EGFR joue des rôles majeurs dans la pathogénèse associée au cancer du sein tels que la prolifération, la migration et la survie à l apoptose (74-76). La plupart des récepteurs ErbB et de leurs ligands sont surexprimés dans la glande mammaire (110). L intérêt de l EGFR dans le contexte du cancer du sein a vu le jour suite à la démonstration du profil d expression génique de plusieurs carcinomes mammaires. Bien que l utilisation de l EGFR à titre de marqueur pronostic demeure à ce jour controversée, il reste qu une association entre certains sous-types de cancer du sein et la surexpression du récepteur à été établie (111). Tous les membres de la famille ErbB sont exprimés à différents niveaux dans le cancer du sein: ErbB2>EGFR>ErbB3>ErbB4 (112).

27 17 Plusieurs dérégulations de la voie EGFR ont été décrites. Parmi les mécanismes menant à ces dérégulations, on dénote la surexpression ainsi que la suractivation du récepteur (110,113). La surexpression du récepteur est occasionnée par amplification génique ou par des mécanismes épigénétiques. La suractivation du récepteur est quant à elle liée à l action de ses ligands ou à des mutations sur le récepteur. La mutation EGFRvIII a également été décrite dans certaines études (114,115). Cette mutation délétère cause une forme tronquée de l EGFR le rendant insensible aux ligands en raison de la délétion du domaine I et II du domaine extracellulaire. En revanche, le récepteur muté possède une activité d autophosphorylation supérieure et reste constamment disponible puisqu il ne se fait pas internaliser (116). Malgré tout, les mutations de l EGFR sont rarement retrouvés dans le cancer du sein (117). Les cancers du sein triples-négatifs surexpriment fréquemment l EGFR (43,118,119). Dans ce contexte, la surexpression du récepteur est généralement associée à des tumeurs larges, faiblement différenciées, et liées à un mauvais pronostic (120,121). Une corrélation entre l expression de l EGFR et la mutation du gène BRCA1 semble également être retrouvée dans les cancers du sein triple-négatifs (122,123). Il a d ailleurs été démontré qu une inhibition de l expression endogène de BRCA1 peut induire l expression de l EGFR via des mécanismes d activation transcriptionnelle ainsi que des mécanismes posttraductionnels (124). Ces résultats suggèrent que des inhibiteurs de l EGFR pourraient être bénéfiques pour les patients présentant une mutation dans le gène BRCA Les thérapies ciblant l EGFR En se basant sur le mécanisme d activation de l EGFR, des thérapies ciblées sont présentement en développement dans le but de traiter les patients atteints du cancer de sein. Ces thérapies peuvent être divisées en au moins 2 catégories, soit les inhibiteurs de l activité kinase du récepteur, ainsi que les inhibiteurs de la dimérisation ou de la liaison du ligand.

28 18 Les inhibiteurs de l activité kinase sont des petites molécules inhibitrices se fixant au site de liaison à l ATP du domaine tyrosine kinase intracellulaire de l EGFR, empêchant ainsi la signalisation du récepteur. Malheureusement, la majorité de ces molécules, tel que l erlotinib ou le gefitinib, n ont démontré qu un taux de réponse pas plus haut que 5% chez les patients atteints de cancer du sein métastatique (125). Les inhibiteurs de la dimérisation/liaison au ligand consistent plutôt en des anticorps monoclonaux dirigés contre la portion extracellulaire du récepteur. Un de ces inhibiteurs, le cetuximab, est actuellement approuvé pour le traitement de certains carcinomes colorectaux métastatiques (Santé Canada, 2012). Néanmoins, les études cliniques portées jusqu à présent dans le contexte du cancer du sein n ont démontré qu une faible efficacité lorsqu administré en combinaison (126,127). Le manque d efficacité global associé aux thérapies ciblant l EGFR remet en question le développement de telles futures drogues pour le cancer du sein. Toutefois, les protéines impliquées dans la signalisation de ce récepteur demeurent des cibles potentielles intéressantes. Parmi les protéines impliquées dans les voies de signalisation de l EGFR, les petites protéines G monomériques représentent une cible prometteuse en raison de leurs nombreuses implications dans le cancer du sein (128,129) Les petites protéines G monomériques Les petites protéines G monomériques, également appelées GTPases, appartiennent à une famille d enzymes ayant la capacité de lier les nucléotides guanyliques. Tel qu illustré dans la figure 5, la régulation de ces protéines se fait sous le contrôle de protéines régulatrices permettant à la petite protéine G de cycler entre son état actif et son état inactif. D une part, les facteurs d échange de nucléotide guanylique (GEF) stimulent l échange d une molécule de guanosine diphosphate (GDP) pour une molécule de guanosine triphosphate (GTP), activant ainsi la GTPase qui interagira avec ses effecteurs. À l opposé, les protéines activatrices de GTPase (GAP) catalysent l activité hydrolase intrinsèque de la GTPase, permettant ainsi l inactivation de la GTPase en hydrolysant le GTP en GDP.

29 19 Figure 5. Le cyclage des GTPases Les GTPases possèdent une activité hydrolase intrinsèque. Celles-ci sont toutefois sous le contrôle de protéines régulatrices, leur permettant de cycler entre leur état inactif (lié au GDP) et leur état actif (lié au GTP). Les GAPs catalysent la réaction d hydrolise du GTP en GDP. Les GEFs favorisent le remplacement du GDP par du GTP. (Inspiré de Taylor et al., 2004) (130) Jusqu à présent, plus d une centaine de petites protéines G monomériques ont été identifiées chez l eucaryote (131). Celles-ci constituent la superfamille Ras, un nom faisant référence au premier membre à avoir été découvert, soit l oncogène Ras (132). Les petites protéines G sont classifiées en au moins 5 familles selon leur homologie de structure : la famille Ras, Rho, Rab, Sar1/Arf et Ran (133). Les membres de la famille Ras sont principalement connus pour réguler l expression génique ( ). Ceux de la famille des Rho ont de plus été montrés comme des protéines importantes pour la réorganisation du

30 20 cytosquelette ( ). Les membres de la famille de Rab ( ) et Sar1/ARF ( ) sont d avantage connus pour réguler le trafic vésiculaire intracellulaire. Finalement, les membres de la famille Ran régulent le transport nucléocytoplasmique pendant la phase G1, S et G2 du cycle cellulaire (149,150) et l organisation des microtubules pendant la phase M (151,152) La famille des facteurs d ADP-ribosylation Les facteurs d ADP-ribosylation (ARF) sont des petites protéines G monomériques de 20 kda faisant parti de la superfamille de Ras. La famille des ARFs est composée de 6 isoformes regroupées en 3 classes selon leur similarité de séquence : la classe I incluant ARF1, ARF2 et ARF3, la classe II comprenant ARF4 et ARF5, et la classe III contenant ARF6. Bien que présents chez la plupart des mammifères, le gène codant pour l isoforme ARF2 semble avoir été perdu au courant de l évolution (153). Les membres de la classe I et II possèdent des fonctions redondantes puisque l inhibition de l expression de chacun de ces membres individuellement n affecte pas la morphologie du Golgi (154). Ceux-ci sont principalement localisés au niveau de l appareil de Golgi et des endosomes où ils régulent les voies de sécrétion cellulaires. Dans leur état inactif, les ARFs de classe I/II sont localisés dans le cytosol puis, lorsqu activés, transloquent au niveau des compartiments membranaires du Golgi où ils recrutent des protéines essentielles à la formation de vésicules et au trafic rétrograde (Golgi vers réticulum endoplasmique) et antérograde (réticulum endoplasmique vers Golgi) (155). L unique membre constituant la classe III, ARF6, est structurellement et fonctionnellement moins similaire que les isoformes des autres classes. Dans son état inactif, ARF6 est localisé dans les compartiments endosomaux puis, lorsqu activé, transloque au niveau de la membrane plasmique (146,156). ARF6 est impliqué dans plusieurs processus tels que le trafic membranaire via la régulation du métabolisme lipidique (157), l internalisation de

31 21 certains récepteurs couplés aux protéines G aux compartiments endosomaux (158), ainsi que le remodelage du cytosquelette d actine (159,160) La structure des ARFs Les membres familles des ARFs possèdent certaines caractéristiques structurales communes. Tout d abord, ils possèdent une hélice amphipathique en N-terminal leur permettant de s insérer aux membranes. Cette hélice distingue la famille des ARFs des autres familles de GTPases qui possèdent plutôt une modification lipidique en C-terminal (161). Une autre caractéristique des ARFs réside dans le fait que leur liaison au GTP cause le déplacement d une boucle située entre les régions switch et permettant le déplacement de l hélice amphipathique N-terminale loin du site de liaison au GTP. Cette boucle, formée d un feuillet beta et constituant la région interswitch, provoque ainsi le déplacement de l hélice d une pochette hydrophobe vers une région hydrophobe adjacente telle qu une membrane cellulaire (Figure 6) (162). L insertion de l hélice est nécessaire aux fonctions de la ARF aux membranes (163). De plus, les ARFs sont modifiées par myristoylation sur leur second résidu glycine en N-terminale. Cette modification est également requise pour son recrutement membranaire (164).

32 22 Figure 6. La structure tridimensionnelle d'arf1 La liaison d ARF1 au GTP modifie la conformation des régions switch et cause le déplacement d une boucle constituée de la région interswitch. Cette modification permet le déplacement de l hélice amphipathique N-terminale d une pochette hydrophobe vers une région hydrophobe adjacente. (Inspiré de Gillingham et al., 2007) (162) La régulation de l activité des ARFs Il existe au moins 15 différents facteurs d échange de nucléotides guanyliques (GEF) pour les ARFs. Ceux-ci jouent un rôle déterminant dans la quantité et la distribution spatiotemporelle des ARFs activées (165). Bien qu exprimant une faible homologie de séquence, les différentes ARF GEFs possèdent une région centrale commune de 200 acides aminés connue comme le domaine Sec7 avec lequel elles interagissent avec les ARFs (166). L interaction avec une ARF, via ce domaine Sec7, est nécessaire et suffisante pour permettre l activité de la GEF (167). La brefeldine A, un antibiotique de type lactone, est

33 23 connue pour inhiber l activité de certaines GEFs en interagissant avec celles-ci au niveau de leur domaine Sec7 (168). Ce mécanisme a pour effet l inhibition du transport antérograde au profit du transport rétrograde, occasionnant une accumulation de protéines au niveau du RE et provoquant éventuellement la désintégration de l appareil de Golgi (169). Les GEFs n étant pas tous sensibles à la brefeldine A (170), plusieurs autres inhibiteurs d ARF GEFs ont été développés dans le but d étudier la fonction des ARFs ainsi que pour le développement de traitements ayant pour but la modulation de l activité des ARFs. Parmi les plus connus, on retrouve le LM11 qui agit à titre d inhibiteur noncompétitif du complexe formé par ARF1-GDP et d une de ses GEFs cytohésine-2 (171). D autres inhibiteurs, tel que la SecinH3, agissent de façon moins spécifique en liant les cytohésines 1 à 3 (172). À l opposé, plus de 15 gènes codent pour des protéines activatrices de GTPases (GAP) ciblant les ARFs ont été identifiées. Chacun de ces membres contient un domaine catalytique ARF GAP conservé formé d un domaine doigts de zinc responsable de l hydrolyse du GTP lié à la ARF (173). Bien qu inactivant les ARFs, ces protéines peuvent également être perçues comme des régulateurs positifs de la fonction des ARFs en permettant leur cyclage, un processus essentiel la complétion de plusieurs fonctions des ARFs (156,174). Ainsi, il n est pas étonnant que les ARF GAPs soient impliqués dans plusieurs fonctions des ARFs telles que l adhésion cellulaire, la migration cellulaire et l invasion cellulaire (175,176) La GTPase ARF1 ARF1 est une GTPase de 21 kda ubiquitaire et hautement conservée chez les mammifères (177). Comme les autre membres de la classe I/II, cette isoforme possède un motif MXXE permettant sa localisation à l appareil de Golgi où elle y exerce plusieurs fonctions (178). Classiquement, ARF1 permet de recruter des protéines effectrices essentielles aux voies de sécrétion golgiennes, telles que les coatomères, la protéine adaptatrice de clathrine 1 et les

34 24 protéines GGA (179). ARF1 contribue également au maintient de la morphologie et à l orientation du Golgi en régulant le cytosquelette d actine et en activant des enzymes de modification lipidiques au niveau des membranes (178). La forme active d ARF1 a également été retrouvée localisée au niveau de la membrane plasmique (74, ), notamment via son activation par des facteurs de croissance. Dans le contexte du cancer, la GTPase ARF1 a entre autre été retrouvée surexprimée dans les carcinomes gastriques (183) ainsi que dans les cellules de cancer du sein hautement invasifs. Dans les cellules mammaires cancéreuses, ARF1 contrôle l activation de la PI3K, ce qui a pour effet de réguler la prolifération ainsi que la migration cellulaire (74). Plus précisément, ARF1 contrôle la prolifération en régulant l association du suppresseur de tumeur prb au facteur de transcription E2F1 (184). Le mécanisme permettant à ARF1 de contrôler la migration cellulaire demeure, quant à lui, incompris. Les études menées sur ARF6 suggèrent néanmoins une voie de signalisation impliquant des membres de la famille des Rho GTPases (185) La famille des Rho Les membres de la famille des Rho sont des petites protéines G monomériques regroupant au moins 22 protéines (186). Chez l humain, les membres de cette famille sont divisés en 6 classes: Rho (RhoA, RhoB et RhoC), Rac (Rac1, Rac2, Rac3 et RhoG), Cdc42 (Cdc42, Tc10, TCL, Chp/Wrch-2 et Wrch-1), RhoBTB, Rnd et RhoT (187). Les Rho GTPases jouent un rôle dans de nombreux processus cellulaires tels que la réorganisation du cytosquelette, la progression du cycle cellulaire, l expression génique, la polarité cellulaire, la migration et la transformation cellulaire ( ). Parmi les membres les plus étudiés, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont surtout connus pour leur implication essentielle dans la régulation et l organisation des filaments d actine nécessaire à la morphogénèse et aux mouvements cellulaires (193). Classiquement, RhoA est associé aux fibres de stress, Rac1 à la formation de lamelipodes, et Cdc42 à la formation de filopodes (194). Pour être en