La technologie «HRM» (High Resolution Melting)

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1 Projets Exploratoires PluridisciplinaireS 2010 La technologie «HRM» (High Resolution Melting) Une nouvelle approche pour l étude de la diversité des communautés symbiotiques Hélène Henri & Laurence Mouton Laboratoire de Biométrie et Biologie Evolutive UMR CNRS 5558 Université de Lyon; Université Lyon1 Henri & Mouton. Molecular Ecology Resources, in Press

2 Contexte biologique Arthropodes -> grande diversité de symbiotes bactériens -> Multi-infections -> Transmission verticale : héritabilité de communautés bactériennes Symbiotes primaires -> Obligatoires : symbiotes nutritionnels Symbiotes secondaires -> Facultatifs : grande diversité d effets phénotypiques -> Influence de la composition symbiotique sur le phénotype de l hôte -> Phénotype étendu : génome hôte + génome(s) bactérie(s) + interactions Projet: mise au point d une technique d exploration et de caractérisation de la diversité symbiotique à large échelle et sans a priori

3 Contexte biologique Exploration et caractérisation de la diversité symbiotique au niveau individuel à grande échelle - Séquençage + Facile (grandes séries possibles) - Cher (grandes séries) - Clonage, screening, puis séquençage si multi-infections (petites séries seulement) + Facile (grandes séries possibles) - PCR-RFLP + Pas cher (dépend enzyme) - Mise au point au cas par cas (parfois difficile) - Sous-estime la diversité : polymorphisme au niveau du site de restriction - Approche avec a priori + Pas cher (grandes séries possibles) - PCR spécifiques - Mise au point au cas par cas (Pas toujours possible) - Approche avec a priori

4 «HRM» : dérive la PCR quantitative en temps réel Principe de la PCR quantitative en temps réel 18 Cinétique d'amplification Phase plateau Fluorescence (qté ADN) Phase exponentielle Phase de latence Cycle Début de l amplification de l ADN Courbes de fusion -> Cinétique de dissociation des brins des produits PCR -> Validation de la spécificité du produit amplifié

5 Principe de la technique de HRM «High Resolution Melting» HRM = courbes de fusion améliorées -> Intercalant : saturation de l'adn double brin -> Cinétique plus fine -> Regroupements en clusters Tm + forme de la courbe

6 Principe de la technique de HRM «High Resolution Melting» - Détection et identification des mutations de gènes impliqués dans certaines maladies, SNPs... (outil diagnostic). - Détection de nouveaux variants viraux et bactériens But du projet : Développer cette technique dans un contexte écologique pour étudier la diversité des endosymbiotes dans les populations naturelles d insectes

7 Infections par différentes espèces bactériennes Modèle : Bemisia tabaci Insecte polyphage, ravageur de cultures (liste IUCN) Cardinium Symbiote primaire -> Bactérie Portiera Classe γ - protéobactérie Wolbachia Hamiltonella γ - protéobactérie Arsenophonus γ - protéobactérie Symbiotes secondaires Wolbachia Cardinium α - protéobactérie Bacteroidetes Prévalence : >95% Multi-infections : >45% Rickettsia Fritschea α - protéobactérie Chlamydia Hamiltonella Arsenophonus Nécessite l utilisation d amorces qui amplifient l ensemble des symbiotes secondaires de B. tabaci et seulement eux -> problèmes de spécificité -> trop de variabilité

8 Etude de la diversité des souches de Wolbachia Wolbachia - Bactérie intracellulaire présente chez de nombreux invertébrés ( 66% des espèces d arthropodes) - Nombreux cas d infection multiple -> lignées présentant différents statuts d infection Cible : Gène wsp (Wolbachia Surface Protein) 611pb HVR1 HVR2 HVR3 HVR4 Amorces 81F 2bF2 2R 3bF 3R 691R Région1 290pb Amplicons Région2 266pb Région3 269pb

9 Echantillonnage Espèce hôte Classe/Ordre Souche(s) de Wolbachia wlhet1 Leptopilina heterotoma Asobara tabida Insecte/Hyménoptère Insecte/Hyménoptère wlhet1, wlhet2 wlhet1, wlhet3 wlhet1, wlhet2, wlhet3 watab3 watab1, watab3 watab2, watab3 watab1, watab2, watab3 Asobara japonica Insecte/Hyménoptère wajap Drosophila simulans Drosophila melanogaster Sitophilus Oryzae Sitophilus Zeamais Phlebotomus papatasi Phlebotomus duboscqui Phlebotomus longicornis Bemisia tabaci Zygiella sp. Insecte/Diptère Insecte/Coléoptère Insecte/Diptère Insecte/Hémiptère Arachnide/Araneae wri wmel wsoraus wszeareu wphleb-m4 wphleb-54d wphleb-31f wbem1 wbem2 wzyg-i96 wzyg-im37

10 Cas des mono-infections Espèce hôte D. simulans Population Souche dewolbachia Résultat HRM Mozambique wri Cluster 1 Antibes (France) wri Cluster 1 Bordeaux (France) wri Cluster 1 Chicharo (Espagne) wri Cluster 1 Tokyo (Japon) wri Cluster 1 L. heterotoma Laboratoire wlhet1 Cluster 1 A. japonica Kagoshima wajap Cluster 2 HiroN wajap Cluster 2 SendN wajap Cluster 2 S. Oryzae Australie wsoraus Cluster 3 S. Zeamais Ile de la Réunion wszeareu Cluster 3 B. tabaci Zygiella sp. N Grèce wbem1 Cluster 4 N Grèce wbem1 Cluster 4 N Grèce wbem1 Cluster 4 N Grèce wbem1 Cluster 4 N Grèce wbem2 Cluster 5 N 195 Grèce wbem2 Cluster 5 N 160 Grèce wbem2 Cluster 5 N 152 Grèce wbem2 Cluster 5 N 153 Grèce wbem2 Cluster 5 N 169 Grèce wbem2 Cluster 5 N Grèce wbem2 Cluster 5 I96 wzyg-i96 Cluster 6 IM37 wzyg-im37 Cluster 6 wsp wbem1 / wbem2 : 2nt sur 611 (99.64% identité)

11 Cas des multi-infections Seuil de détection de la 2 ème souche Test : dilutions de 2 souches de Wolbachia 10% 40% Proportion des 2 souches de Wolbachia Résultat HRM wau wri Région 1 Région 2 Région 3 Totalité 0 1 Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 Cluster Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 Cluster Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 Cluster Cluster 1 Cluster 1 Cluster 1 Cluster Cluster 2 Cluster 1 Cluster 1 Cluster Cluster 2 Cluster 1 Cluster 1 Cluster Cluster 3 Cluster 1 Cluster 1 Cluster Cluster 4 Cluster 1 Cluster 2 Cluster Cluster 4 Cluster 1 Cluster 3 Cluster Cluster 5 Cluster 2 Cluster 3 Cluster Cluster 5 Cluster 2 Cluster 3 Cluster 6 Pb. affiliation -> quand les proportions relatives sont très différentes, certaines souches ne sont pas détectées Résultats non symétriques -> détection préférentielle d une souche (wri)? -> dans les échantillons naturellement multi-infectés (trois souches présentes) : OK

12 Bilan Mono-infections : Fiable, reproductible et discriminante -> Permet d identifier les souches présentes par rapport à des références -> Permet de détecter la présence de nouvelles souches (méthode sans a priori) Multi-infections : risque de sous-estimer la diversité Problème quand proportions des souches bactériennes très différentes Même problème rencontré avec les autres techniques utilisées actuellement Méthode sans a priori permettant le screening de la diversité des souches d une espèce bactérienne dans les populations naturelles