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3 Table des matières 1. Contenu Stockage Matériel nécessaire et non fourni Précautions générales Informations sur le pathogène Principe de la PCR en temps réel Description du produit Protocole Extraction de l ADN Préparation de la PCR Programmation du système LightCycler Interprétation Aide au dépannage Spécifications Sensibilité analytique Spécificité Sensibilité et spécificité diagnostiques Remarques particulières concernant l utilisation du produit Informations de sécurité Contrôle qualité Références bibliographiques Explication des symboles artus TPMT LC PCR Kit 04/2007 3

4 artus TPMT LC PCR Kit * Pour une utilisation avec le système LightCycler. 1. Contenu Étiquetage et contenu Réf réactions Bleu TPMT LC Master A 2 x 12 rxns Bleu TPMT LC Master B 2 x 12 rxns Jaune TPMT LC Mg-Sol 1 x 400 µl Rouge TPMT LC Control Aw 1 x 200 µl Rouge TPMT LC Control Av 1 x 200 µl Rouge TPMT LC Control B 1 x 200 µl Blanc Water (PCR grade) 1 x µl Mg-Sol = Solution de magnésium 2. Stockage Les composants de l artus TPMT LC PCR Kit doivent être stockés à -20 C et peuvent être utilisés jusqu à la date de péremption indiquée sur l étiquette. Éviter de répéter les étapes de congélation/décongélation (> 2 x) qui pourraient réduire la sensibilité. En cas d utilisation occasionnelle, répartir les réactifs en aliquotes. Si les composants doivent être stockés à +4 C, la période de stockage ne doit pas dépasser cinq heures. * TPMT = thiopurine S-méthyltransférase 4 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

5 3. Matériel nécessaire et non fourni Gants de laboratoire sans talc Kit d extraction d ADN (voir 8.1 Extraction de l ADN) Pipettes (réglables) Pointes de pipette stériles avec filtre Mixeur Vortex Micro-centrifugeuse avec rotor pour tubes de réaction de 2 ml Color Compensation Set (Roche Diagnostics, (réf. cat ) pour la création d un fichier Crosstalk Color Compensation Capillaires LightCycler (20 µl) «Cooling Block» LightCycler Système LightCycler «Capping Tool» LightCycler 4. Précautions générales L utilisateur doit toujours respecter les mesures suivantes : Analyser un maximum de 12 échantillons par série PCR. Si plus de 12 échantillons sont analysés parallèlement, un déroulement atypique de la courbe de fusion peut avoir lieu pour les variants hétérozygotes nt 238. Utiliser des pointes de pipette stériles avec filtre. Conserver et purifier les éléments positifs (échantillons, contrôles, amplicons) séparément des autres réactifs et les ajouter au mélange réactionnel dans une autre pièce. Décongeler complètement tous les composants à température ambiante avant le début du test. Mélanger ensuite soigneusement les composants et les centrifuger brièvement. Toujours travailler dans de la glace ou dans le «Cooling Block» LightCycler. artus TPMT LC PCR Kit 04/2007 5

6 5. Informations sur le pathogène Plusieurs facteurs tels que l âge, le sexe, l alimentation, les interactions entre médicaments et en particulier les facteurs génétiques peuvent influencer l activité enzymatique. On sait que les patients présentant une absence ou un déficit de l activité de l enzyme thiopurine méthyltransférase (TPMT) génétiquement induit présentent sous thérapie à base de 6-thioguanine, 6- mercaptopurin ou azathioprine une incidence plus élevée d apparitions d effets secondaires sévères (1-3, p.ex. toxicité hématologique, hépatotoxicité). Une analyse du gène TPMT permet d estimer les risques d origine génétique d effets secondaires induits par une thérapie. Les porteurs d un variant génétique du gène TPMT peuvent donc être identifiés avant le début d une thérapie et si nécessaire, suivre un traitement alternatif ou à dose nettement réduite. L activité enzymatique de la thiopurine méthyltransférase est déterminée entre autres par des altérations du gène TPMT. Des altérations génétiques peuvent engendrer par exemple un échange d acides aminés. La conformation ainsi modifiée de l enzyme a des conséquences sur l activité enzymatique. Les variants génétiques les plus fréquents du gène TPMT concernent les nucléotides (nt) 238, 460 et 719. D autres variants génétiques sont rapportés dans la documentation, mais qui n ont été observés que rarement, voire une seule fois dans une population. Près de 10 % de la population caucasienne présentent un déficit de l activité TPMT de 75 % alors que près de 0,3 % ne présentent aucune activité enzymatique mesurable. Des analyses comparatives de génotype-phénotype ont conclu qu il existe une corrélation entre le génotype et l activité enzymatique dans 87 % des cas. Le génotypage permet une sélection optimale d une thérapie individuelle par médication. En particulier dans le cas de thérapies tumorales avec thiopurine, de traitements de maladies inflammatoires chroniques de l intestin ou suite à une transplantation, il est souhaitable de procéder à une analyse du gène de TPMT, permettant de diminuer les effets secondaires indésirables ainsi que les coûts occasionnés (séjour hospitalier prolongé, etc.). 6 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

7 6. Principe de la PCR en temps réel Lors du diagnostic génétique par amplification en chaîne par polymérase (PCR), des régions spécifiques du génome humain sont amplifiées. La détection a lieu à l aide de marqueurs fluorescents au cours de la PCR en temps réel. Ceux-ci sont généralement couplés à des sondes oligonucléotidiques, qui se lient spécifiquement à l amplicon de la PCR. L analyse de la courbe de fusion immédiatement après l amplification de la PCR permet l identification et la différenciation des variants génétiques. Une ré-ouverture des tubes d échantillons après la PCR n étant plus nécessaire, le risque de contamination est réduit de manière significative. (Mackay, 2004). 7. Description du produit Une analyse de l ADN humain peut être effectuée de manière simple, rapide et fiable à l aide de l artus TPMT LC PCR Kit pour détecter les variants génétiques cliniquement importants du gène TPMT. Cette analyse permet une estimation des risques induits par une thérapie, par ex. un traitement avec thiopurine. L analyse est effectuée par la détection des variants génétiques du gène TPMT avec le système LightCycler. Les réactifs contiennent les sondes nécessaires à l amplification d une séquence du gène humain TPMT ainsi que des sondes fluorescentes pour la détection des variants génétiques aux positions nucléotidiques nt 238 sur l exon 5, nt 460 sur l exon 7 et nt 719 sur l exon 10. De plus, des contrôles positifs A (Aw/Av) et B sont fournis pour contrôler la réaction dans une série indépendante. Le test étant basé sur l amplification d ADN génomique humain, les signaux de fluorescence de la courbe de fusion doivent pouvoir être identifiés indépendamment de la présence d un variant allélique. Le cas contraire met en évidence une extraction inefficace de l ADN ou une inhibition de la PCR. Un contrôle interne additionnel n est pas nécessaire avec ce test génétique. artus TPMT LC PCR Kit 04/2007 7

8 Attention : Les signaux de l analyse de la courbe de fusion sont décisifs pour l interprétation. Lors de l emploi de l artus TPMT LC PCR Kit, aucune amplification quantitative au cours des séries sur le système LightCycler n est généralement observé. Ceci n a aucune influence sur l analyse de la courbe de fusion. 8. Protocole 8.1 Extraction de l ADN Différents fabricants proposent des kits d extraction d ADN à partir de sang. Procéder à l extraction d ADN conformément aux instructions, tel que le préconise le fabricant, en utilisant la quantité indiquée d échantillon. Le kit d extraction suivant est recommandé : Échantillon sang Kit d extraction QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Référence du catalogue Fabricant QIAGEN L artus TPMT LC PCR Kit ne convient pas aux procédés d extraction à base de phénol. Dans le cas d extractions utilisant des tampons de lavage contenant de l éthanol, s assurer impérativement qu une étape de centrifugation supplémentaire (trois minutes, tr/min) est exécutée avant l élution pour éliminer les résidus d éthanol. Cela permet de prévenir d éventuelles inhibitions de la PCR. 8.2 Préparation de la PCR Attention : Analyser un maximum de 12 échantillons par série PCR. Si plus de 12 échantillons sont analysés parallèlement, un déroulement atypique de la courbe de fusion peut avoir lieu pour les variants hétérozygotes nt 238. S assurer que le «Cooling Block» et les adaptateurs qu il contient (accessoires du système LightCycler ) sont refroidis à +4 C. Placer le nombre de capillaires LightCycler nécessaires pour le nombre de réactions prévues 8 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

9 dans l adaptateur du «Cooling Block». Avant le début du test, décongeler complètement tous les réactifs à température ambiante, bien les mélanger (aspirer et rejeter plusieurs fois à l aide de la pipette ou vortexer brièvement) et immédiatement après les centrifuger brièvement. S assurer que les contrôles positifs (TPMT LC Control Aw, TPMT LC Control Av et TPMT LC Control B) fournis avec l artus TPMT LC PCR Kit et un contrôle négatif (Water, PCR grade) sont exécutés parallèlement à chaque série de PCR. Pour préparer les réactions PCR, utiliser le tableau de pipetage suivant (voir également la représentation schématique à la Fig. 1) : 1. Préparation du mélange réactionnel 2. Préparation de la reaction Nombre d échantillons 1 TPMT LC Master A ou TPMT LC Master B 16 µl TPMT LC Mg-Sol 2 µl Volume total 18 µl Mélange réactionnel 18 µl Échantillon 2 µl PCR Volume total 20 µl Pipeter 18 µl de mélange réactionnel dans le réservoir en plastique de chaque capillaire. Ajouter ensuite 2 µl de l éluat d extrait d ADN. De la même manière, utiliser respectivement 2 µl de TPMT LC Control A (Aw/Av) ou B comme contrôle positif et 2 µl d eau pour contrôle négatif (Water, PCR grade). Fermer les capillaires. Pour transférer le mélange du réservoir en plastique aux capillaires, centrifuger les adaptateurs contenant les capillaires dans une micro-centrifugeuse pendant dix secondes à 400 x g (2 000 tr/min) maximum. Attention : La mise en place du bouchon sur les capillaires doit avoir lieu avec le «Capping Tool» LightCycler afin d éviter tout risque de contamination. artus TPMT LC PCR Kit 04/2007 9

10 Préparation de la PCR " # $! Fig. 1 : Schéma de procédure. * A chaque pipetage, s assurer impérativement que les solutions à utiliser sont complètement décongelées, bien mélangées et brièvement centrifugées. 10 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

11 8.3 Programmation du système LightCycler Pour détecter les variants génétiques du gène TPMT, créer un profil de thermocyclage sur votre système LightCycler, conformément aux cinq étapes suivantes (voir Fig. 2-6). A. Activation initiale de l'enzyme «Hot Start» Fig. 2 B. Étape «Touch Down» Fig. 3 C. Amplification de l'adn Fig. 4 D. Courbe de fusion Fig. 5 E. Refroidissement Fig. 6 Bien tenir compte des paramètres pour Analysis Mode, Cycle Program Data et Temperature Targets. Pour plus de clarté, les paramétrages à effectuer sont encadrés en noir dans les figures. Pour plus de détails sur la programmation du système LightCycler, se reporter au guide LightCycler Operator s Manual. Fig. 2 : Activation initiale de l enzyme «Hot Start». artus TPMT LC PCR Kit 04/

12 Fig. 3 : Étape «Touch Down». Fig. 4 : Amplification de l ADN. 12 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

13 Fig. 5 : Courbe de fusion. Fig. 6 : Refroidissement. artus TPMT LC PCR Kit 04/

14 9. Interprétation Lors d analyses multi-couleurs, il peut y avoir des interférences entre les canaux de fluorimétrie. Le logiciel du système LightCycler comprend un fichier appelé Color Compensation File qui compense ces interférences. Ouvrir ce fichier avant, pendant ou à l issue de la série de PCR, en activant l onglet Choose CCC File ou Select CC Data. Si aucun fichier Color Compensation File n est installé, créer le fichier en respectant les instructions du guide LightCycler Operator s Manual. Une fois le fichier Color Compensation File activé, des signaux apparaissent séparément dans les canaux de fluorimétrie F1, F2 et F3. Pour interpréter les résultats de la PCR obtenus avec l artus TPMT LC PCR Kit, sélectionner les fonctions d affichage F2/Back-F1 et F3/Back-F1 pour la PCR analytique de TPMT. Lors de l emploi de l artus TPMT LC PCR Kit, aucune amplification quantitative au cours des séries sur le système LightCycler n est généralement observé. Les composants de l artus TPMT LC PCR Kit permettent la détection des variants génétiques (type sauvage (wildtyp) = wt ; variant = var) aux positions nucléotidiques nt 238, 460 et 719 du gène TPMT. La détermination des variants génétiques a lieu à l aide du programme Melting Curve. Dans l analyse de la courbe de fusion, les points de fusion aux températures indiquées dans le tableau suivant (voir Tableau 1) démontrent la présence d un type sauvage ou de variants génétiques. En cas d hétérozygotie, la courbe présente deux sommets. Tableau 1 : Points de fusion pour le type sauvage (wt) ou les variants génétiques (var). Master Canal F2 Canal F3 nt wt var nt wt var A C 64 C B C 47 C C 54 C 14 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

15 Remarquer bien que les points de fusion peuvent varier de ± 2 C des températures données. Pour une meilleure visualisation de l analyse de la courbe de fusion, il est recommandé dans plusieurs cas de désactiver le Digital Filter. Les figures suivantes (voir Fig. 7-9) illustrent l analyse de la courbe de fusion pour la détection des polymorphismes aux positions nucléotidiques nt 238, nt 460 et nt 719 sous la forme homozygote type sauvage ainsi que les formes altérées hétérozygote et homozygote. Les contrôles positifs fournis avec l artus TPMT LC PCR Kit (TPMT LC Control A (Aw/Av) et B) représentent la forme hétérozygote de chaque variant génétique. Fig. 7: Analyse de la courbe de fusion pour la détection des échanges nucléotidiques nt 238 dans le canal de fluorimétrie F2/Back-F1 à l aide de l artus TPMT LC PCR Kit (Master A). NTC: non-template control (contrôle négatif). Attention : Analyser un maximum de 12 échantillons par série PCR. Si plus de 12 échantillons sont analysés parallèlement, un déroulement atypique de la courbe de fusion peut avoir lieu pour les variants hétérozygotes nt 238. artus TPMT LC PCR Kit 04/

16 Fig. 8: Analyse de la courbe de fusion pour la détection des échanges nucléotidiques nt 460 dans le canal de fluorimétrie F2/Back-F1 à l aide de l artus TPMT LC PCR Kit (Master B). NTC: non-template control (contrôle négatif). Fig. 9: Analyse de la courbe de fusion pour la détection des échanges nucléotidiques nt 719 dans le canal de fluorimétrie F3/Back-F1 à l aide de l artus TPMT LC PCR Kit (Master B). NTC: non-template control (contrôle négatif). 16 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

17 Le génotypage peut être déterminé par la combinaison des variants alléliques (voir Tableau 2). Bien noter qu en cas de présence de deux variants hétérozygotes, ceux-ci peuvent être situés sur le même allèle ou sur deux allèles différents. Dans tous les cas, un déficit de l activité enzymatique de la TPMT peut être anticipée en présence d au moins un des variants génétiques. Une activité enzymatique normale est anticipée chez les porteurs de deux allèles type sauvage, à condition qu elle ne soit influencée par aucun autre facteur non-génétique. Un déficit de l activité enzymatique est anticipé chez les porteurs d au moins un allèle altéré génétiquement. Par exemple, un cas d hétérozygotie aux positions nt 460 et nt 719 peut mener au génotype TPMT*3A/*1 mais aussi TPMT*3B/*3C. Si les deux allèles sont concernés, le risque d effets secondaires génétiquement induits est accru. À l aide de l artus TPMT LC PCR Kit, les variants nucléotidiques aux trois positions différentes du gène TPMT sont analysés, permettant ainsi la détection des allèles TPMT*1, TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B et TMPT*3C. Tableau 2: Variants génétiques du gène TPMT. Allèle TPMT*1 nt 238 F2 nt 460 F2 nt 719 F3 Activité enzymatique normale TPMT*2 x déficitaire TPMT*3A x x aucune TPMT*3B x déficitaire TPMT*3C x déficitaire artus TPMT LC PCR Kit 04/

18 Les différents génotypes possibles proviennent des combinaisons d allèles décrits précédemment. Ils sont énumérés dans le tableau suivant (voir Tableau 3). Tableau 3 : Influence du génotype sur l activité enzymatique TPMT. Génotype homozygote Wildtyp Génotype hétérozygote ou homozygote variants Génotype homozygote variants TPMT*1/*1 TPMT*1/*2 TPMT*3A/*3A TPMT*1/*3A TPMT*1/*3B TPMT*1/*3C TPMT*2/*2 TPMT*2/*3A TPMT*2/*3B TPMT*2/*3C TPMT*3A/*3B TPMT*3A/*3C TPMT*3B/*3B TPMT*3B/*3C TPMT*3C/*3C Activité enzymatique normale Activité enzymatique déficitaire Aucune activité enzymatique 18 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

19 10. Aide au dépannage Aucun signal pour les contrôles positifs (TPMT LC Control Aw, Av ou B) dans le canal de fluorimétrie F2/Back-F1 ou F3/Back-F1 : Il y a une erreur de programmation du thermocyclage du système LightCycler. Comparer le profil de thermocyclage avec les directives du protocole (voir 8.3 Programmation du système LightCycler ). Il y a une erreur de composition de la réaction PCR. Vérifier les étapes de pipetage à l aide du schéma de pipetage (voir 8.2 Préparation de la PCR) et si nécessaire, répéter la PCR. Les conditions de stockage d un ou plusieurs composants du kit ne sont pas conformes aux directives précisées en 2. Stockage ou la date de péremption de l artus TPMT LC PCR Kit a été dépassée. Vérifier aussi bien les conditions de stockage que la date de péremption des réactifs (voir l étiquette du kit) et si nécessaire, employer un nouveau kit. Il y a eu inhibition de la PCR. S assurer que l un des kits d extraction recommandés (voir 8.1 Extraction de l ADN) est utilisé et respecter scrupuleusement les instructions du fabricant. S assurer que lors de l extraction d ADN, l étape de centrifugation supplémentaire recommandée est effectuée avant l élution pour éliminer complètement les résidus d éthanol (voir 8.1 Extraction de l ADN). Il y a eu perte d ADN lors de l extraction. S assurer que l un des kits d extraction recommandés (voir 8.1 Extraction de l ADN) est utilisé et respecter scrupuleusement les instructions du fabricant. Aucun signal du TPMT LC Master A dans le canal de fluorimétrie F3/Back-F1 : Le TPMT LC Master A génère un signal seulement dans le canal de fluorimétrie F2/Back-F1. artus TPMT LC PCR Kit 04/

20 Déroulement atypique de la courbe de fusion pour la détection de l échange nucléotidique nt 238 dans le canal de fluorimétrie F2/Back-F1 : Plus de douze échantillons ont été analysés parallèlement. Faible pic de fluorescence Bien mélanger les composants avant de les employer. Vérifier les conditions d amplification. Refroidir le «Cooling Block» avec les adapteurs à +4 C. Refroidir tous les composants réactifs pendant le pipetage. Pour toute autre question ou en cas de problèmes, merci de contacter notre service technique. 11. Spécifications 11.1 Sensibilité analytique L artus TPMT LC PCR Kit permet la détection de la constitution génétique individuelle en ce qui concerne les variants génétiques nt 238, nt 460 et nt 719 du gène humain TPMT à l aide de la technologie LightCycler. L ADN génomique humain fut extrait à partir d échantillons sanguins, quantifié avec le spectrophotomètre et soumis à une série de dilutions. Une quantité minimale de 0,12 ng d ADN génomique (20 copies) par PCR suffit pour détecter les variants génétiques (ceci correspond à 0,005 0,02 µl de sang, selon les donneurs et l extraction) Spécificité La spécificité de l artus TPMT LC PCR Kit est garantie en premier lieu par la sélection des amorces et des sondes ainsi que des conditions de réaction des plus strictes. Une analyse par comparaison de séquences des amorces et des sondes a été effectuée afin de rechercher d éventuelles homologies avec toutes les séquences représentées dans les banques génétiques. De plus, la spécificité pour la détection de ce polymorphisme génétique a été garantie par 20 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

21 un séquençage de chacun des variants alléliques et par une comparaison de séquences avec les banques de données internationales Sensibilité et spécificité diagnostiques L analyse de 300 échantillons d ADN avec les composants du kit a confirmé la fréquence de polymorphisme dans la population caucasienne, tel que rapporté dans la documentation. 12. Remarques particulières concernant l utilisation du produit Tous les réactifs doivent être utilisés exclusivement pour le diagnostic in vitro. L utilisation est réservée aux personnes spécialement formées aux procédés de diagnostic in vitro (EN375). Le protocole doit impérativement être respecté scrupuleusement, afin d optimiser les résultats PCR. Respecter les dates de péremption figurant sur l emballage et les étiquettes des différents composants. Ne pas utiliser les réactifs dont la date de péremption est dépassée. 13. Informations de sécurité Pour obtenir des informations relatives à la sécurité de l artus TPMT LC PCR Kit, consulter la fiche de données de sécurité correspondante (material safety data sheets, MSDS), disponible sur notre site Internet au format PDF, un format compact et convivial. artus TPMT LC PCR Kit 04/

22 14. Contrôle qualité En accord avec le système de gestion de la qualité de QIAGEN certifié ISO 9001 et ISO 13485, chaque lot de l artus TPMT LC PCR Kit a été testé conformément aux spécifications prédéterminées afin d assurer une qualité constante du produit. 15. Références bibliographiques (1) Andersen JB, Szumlanski C, Weinshilboum RM, Schmiegelow K. Pharmacokinetics, dose adjustments, and 6-mercaptopurine/ methotrexate drug interactions in two patients with thiopurine methyltransferase deficiency. Acta Paediatr Jan; 87 (1): (2) Krynetski EY, Schuetz JD, Galpin AJ, Pui CH, Relling MV, Evans WE. A single point mutation leading to loss of catalytic activity in human thiopurine S-methyltransferase. Proc Natl Acad Sci USA Feb 14; 92 (4): (3) Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10 (3): (4) Schwab M, Schaffeler E, Marx C, Fischer C, Lang T, Behrens C, Gregor M, Eichelbaum M, Zanger UM, Kaskas BA. Azathioprine therapy and adverse drug reactions in patients with inflammatory bowel disease: impact of thiopurine S-methyltransferase polymorphism. Pharmacogenetics Aug; 12 (6): artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

23 16. Explication des symboles Utiliser jusque Code du lot Fabricant Référence du catalogue Référence du matériel Manuel Dispositif médical de diagnostic in vitro <N> Kit contient des réactifs pour <N> tests Limites de température Solution de magnésium artus TPMT LC PCR Kit 04/

24 24 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

25 artus TPMT LC PCR Kit 04/

26 26 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

27 artus TPMT LC PCR Kit 04/

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