NEFTI Lydia. GERART Sarah. LACROIX Laetitia

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1 NEFTI Lydia GERART Sarah LACROIX Laetitia

2 Introduction La maladie coeliaque est une maladie autoimmune causée par une intolérance permanente au gluten qui est une protéine présente dans certaines céréales. Lorsque le gluten est ingéré, il entraîne une réaction immunitaire anormale dans l intestin grêle en détruisant le gluten et en attaquant les villosités situées sur la face interne de l intestin grêle. Villosité de la paroi intestinale Les villosités sont de petites structures en forme de vague, qui permettent l absorption de la majeure partie des nutriments, des vitamines et des minéraux.

3 Introduction La maladie coeliaque peut survenir à tout âge et les femmes sont deux à trois fois plus touchées que les hommes. Symptômes : Chez les enfants : Une diarrhée chronique, un retard de croissance, des douleurs abdominales récurrentes, de l anémie, une petite taille, une fonte des muscles, des changements d humeur. Chez les adultes : Une diarrhée chronique, des malaises abdominaux, des gaz et des ballonnements, une perte de poids, de la fatigue et de l irritabilité, une pâleur, en cas d anémie, un état dépressif, des douleurs aux os et aux articulations, de l infertilité ou une absence de menstruations, des douleurs neuropathiques dans les membres, des éruptions cutanées.

4 Les patients atteints de maladie coeliaque (MC) présentent des facteurs de prédispositions génétiques : 95% des patients MC possèdent un HLA classe II de type DQ2 ou DQ8. La poche à peptide des molécules DQ2 et DQ8 permet d accommoder mieux que d autres molécules de classe II certains peptides gluten, favorisant ainsi leur présentation aux lymphocytes T et l initiation d une réponse immune. Le peptide gluten, traverse l'épithélium intestinal et est «déamidée» par la transglutaminase tissulaire, un enzyme constitutionnellement produite par les cellules mononucléées, les fibroblastes et les cellules endothéliales qui résident dans la matrice sous-épithéliale de la muqueuse digestive. Introduction

5 Plan

6 Rôle du polymorphisme HLA-DQ8 β57 dans la réponse des cellules T anti-gluten dans la maladie coealique. Lorsque les deux peptides sont administrés simultanément sous conditions de compétition, la réponse contre le peptide déaminé est largement prédominante sur celle du peptide natif. La réponse du peptide E229 ressemble à celle du peptide natif alors que la réponse du peptide E237 a un comportement comme le peptide déaminé. C est donc le résidu Glutamate en position 237 du peptide déaminé qui va se lier à la poche P9 de HLA-DQ8 β57.

7 Rôle du polymorphisme HLA-DQ8 β57 dans la réponse des cellules T anti-gluten dans la maladie coealique. Les patients atteints de la maladie coeliaque présentent également une prédisposition à un pool de cellules T présentant une charge négative en position 3 du CDR3β de leur TCR. La mutation de la charge négative du CDR3β entraîne une perte complète de reconnaissance du peptide natif alors que celle du peptide déaminé est préservée.

8 Rôle du polymorphisme HLA-DQ8 β57 dans la réponse des cellules T anti-gluten dans la maladie coealique. Perte de réponse pour le peptide natif tandis que la réponse pour le peptide déaminé est conservée. Le polymorphisme HLA-DQ8 β57 peut induire une forte réponse contre un peptide sans charge négatif en recrutant des TCR qui expriment une charge négative en position 3 du CDR3β.

9 Rôle du polymorphisme HLA-DQ8 β57 dans la réponse des cellules T anti-gluten dans la maladie coealique. L instabilité des complexes entre le peptide natif et HLA-DQ8 β57 est compensée par la présencede résiduschargés négativementdans la boucle du CDR3β. La reconnaissance du peptide natif impose des recrutements stricts conduisant à limiter le TCR utilisé, alors que le peptidedéaminé recrute un large répertoiretcr.

10 Conclusion intermédiaire La poche 9 de l allèle HLA-DQ8 dépourvue en Asp 57 canonique a le potentiel d interagir avec un peptide ayant un résidu acide et aussi avec des TCR ayant une charge négative dans leurs boucles CDR3β. Les TCR spécifiques au gluten chargés négativement dans leurs régions CDR3β stabilisent le complexe formé d un HLA-DQ8 β57 et d un peptide natif. Les peptides déaminés n imposent pas de contrainte de charge sur le TCR leur permettant ainsi de recruter un répertoire T additionnel. La capacité de présenter des peptides natifs et déaminés et de recruter des répertoires TCR cross-réactifs est directement liée au polymorphisme de la position β57. Cela peut sous-tendre une remarquable association de l HLA-DQ8 β57 avec une sévère immunopathologie chez la souris et chez l homme.

11 Conclusion intermédiaire

12 IL-15 induit la cytolyse médiée par NKG2D dans les CTL intraépithéliaux NKG2D est peu exprimé dans les CTL intraépithéliaux. L'exposition à l'il-15 permet une surexpression de NKG2D à la surface des CTL intraépithéliaux. L'exposition à l'il-15 durant 48h, permet aux CTL intraépithéliaux d'acquérir la capacité de lyser des cellules exprimant MIC par l'intermédiaire de NKG2D. La lyse des cellules cibles est diminuée en présence d'un Ac anti NKG2D

13 IL-15 permet la cytolyse médiée par NKG2D dans les cellules effectrices mais pas dans les cellules naïves ou mémoires. Cellules naïves et mémoires du sang périphérique stimulées pendant 3 semaines à IL-15. => pas de lyse médiée par NKG2D des cellules cibles. Cellules naïves et mémoires du sang périphérique pré-stimulées avec un Ac anti CD3 pendant 24h puis incubées pendant 3 semaines à IL-15. => forte lyse des cellules cibles par les cellules naïves et mémoires médiée par NKG2D. => L'activation de la voie de cytolyse de NKG2D médiée par l'il-15 est restreinte au stade effecteur des cellules T. L'IL-15 active cette voie seulement si les cellules ont été récemment restimulées par leur récepteur à l'antigène.

14 Les cellules intraépithéliales de patients malades entraînent une lyse TCRindépendante Les CTL d'un patient malade (AC) expriment 4-20 fois le niveau normal de NKG2D. Le niveau de NKG2D diminue dans les GFD. Chez les patients coeliaques, NKG2D est exprimé à un niveau comparable à celui observé après pré-stimulation des CTL normaux intraépithéliaux avec de l'il-15 pendant 48h.

15 Les cellules intraépithéliales de patients malades entraînent une lyse TCRindépendante Les CTL intraépithéliaux de patients coeliaques induisent une mort NKG2Ddépendante de différentes lignées intestinales épithéliales exprimant le ligand de NKG2D: MIC. Ils ne permettent pas la lyse des K562 (cibles des cellules NK) qui expriment un faible niveau de MIC. Les CTL ne possèdent pas le récepteur des NK requis pour lyser les K562. L'exposition in vivo à l'il-15 des CTL intraépithéliaux chez un patient coeliaque permet l'acquisition d'une activité cytolytique médiée par NKG2D ressemblant à l'activité des cellules NK. Les CTL sont transformés en LAK: Lymphokine Activated Killers.

16 Surexpression de MIC dans les cellules épithéliales de l'intestin (IEC) chez les patients coeliaques. MIC est un ligand du récepteur NKG2D (récepteur des cellules NK). Il est constitutivement présent à la surface des IEC du colon mais présent à un faible niveau dans les IEC de l'intestin grêle normal. 25% des IEC expriment un haut niveau de MIC à leur surface chez les patients coeliaques, mais pas chez les patients normaux ou GFD (Gluten Free Diet). Corrélation entre l'induction de MIC sur les IEC de l'intestin grêle et l'ingestion de gluten chez les patients coeliaques.

17 NKG2D humain est associé à DAP10 Données précédentes: chez la souris la lyse via NKG2D est dépendante de DAP12. DAP12 est un adaptateur possédant un motif ITAM qui permet de recruter et d'activer par phosphorylation ZAP 70 et donc d'induire une cytolyse, la synthèse de cytokine ainsi qu'une prolifération cellulaire. NKG2D humain est-il également associé à DAP12? NKG2D co-précipite avec DAP10 mais pas avec DAP12. Contrairement à CD3, NKG2D ne peut pas induire la phosphorylation de ZAP 70, la signalisation NKG2D n'implique pas de molécules adaptatrices portant des motifs ITAM. => NKG2D ne peut pas provoquer la prolifération et la sécrétion de cytokines des CTL. Il peut exercer des fonctions de co-stimulation et est capable de provoquer la cytolyse directe

18 Voie de signalisation induite dans la cytolyse médiée par NKG2D dans les CTL humains? Test des effets de différents inhibiteurs de kinases sur la cytolyse médiée par NKG2D et celle médiée par CD3. La combinaison des inhibiteurs de JNK et MEK1/2 a un effet additif mais pas synergique sur la lyse médiée par NKG2D. Ces deux voies sont donc distinctes.

19 Voie de signalisation induite dans la cytolyse médiée par NKG2D dans les CTL humains? NKG2D/DAP10 activent-ils ERK et JNK? Après stimulation de NKG2D, pic du niveau de phosphorylation de ERK à 5 min et à 15 min pour JNK et retour à un niveau basal après 30 min. Phosphorylation de ERK est diminuée dans les cellules prétraitées avec la wortmannin et l'inhibiteur de MEK1/2 mais pas avec l'inhibiteur de p38. Au contraire la wortmannin ne bloque pas l'activation de JNK. NKG2D induit la phosphorylation de ERK et l'activation de JNK. La fonction catalytique de la PI3-K est essentielle pour ERK mais pas pour l'activation de JNK.

20 Effet de l'il-15 sur la voie de signalisation de NKG2D. Lors d'une stimulation par l'il-15 de CTL intraépithéliaux normaux, on observe une augmentation des transcrits de NKG2D et DAP 10 (facteur 10).

21 Effet de l'il-15 sur la voie de signalisation de NKG2D L'IL-15 peut-il induire la phosphorylation de ERK dans les CTL intraépithéliaux normaux? Après 5 min de stimulation à l'il-15 on observe une phosphorylation de ERK mais pas en présence d'il-7. Prétraitement des CTL intraépithéliaux normaux avec les inhibiteurs de PI3-K et MEK1/2 entraîne une absence de phosphorylation de ERK. L'inhibiteur de p38 n'a pas d'effet. ==> L'IL-15 promeut la signalisation et la cytolyse médiée par NKG2D en coordonnant l'augmentation du niveau d'expression de NKG2D et de DAP 10 et en induisant la phosphorylation de ERK par un processus PI3-K dépendant.

22 Conclusion intermédiaire IL-15 induit la cytolyse médiée par NKG2D dans les CTL intraépithéliaux. L'activation de la voie de cytolyse de NKG2D médiée par l'il-15 est restreinte au stade effecteur des cellules T. L'IL-15 active cette voie seulement si les cellules ont été récemment restimulées par leur récepteur à l'antigène. L'exposition in vivo à l'il-15 des CTL intraépithéliaux chez un patient coeliaque permet l'acquisition d'une activité cytolytique médiée par NKG2D ressemblant à l'activité des cellules NK. Les CTL sont transformées en LAK: Lymphokine Activated Killers. Il y a une surexpression de MIC dans les cellules épithéliales de l'intestin (IEC) chez les patients coeliaques. IL y a donc une corrélation entre l'induction de MIC sur les IEC de l'intestin grêle et l'ingestion de gluten chez les patients coeliaques.

23 CONCLUSION NKG2D humain est associé à DAP10, NKG2D ne peut pas provoquer la prolifération et la sécrétion de cytokines des CTL. Il peut exercer des fonctions de co-stimulation et est capable de provoquer la cytolyse directe. NKG2D induit la phosphorylation de ERK et l'activation de JNK. La fonction catalytique de la PI3-K est essentielle pour ERK mais pas pour l'activation de JNK. L'IL-15 promeut la signalisation et la cytolyse médiée par NKG2D en coordonnant l'augmentation du niveau d'expression de NKG2D et de DAP 10 et en induisant la phosphorylation de ERK par un processus PI3-K dépendant. ERK est activé dans les CTL coeliaques, cette activation peut être au moins en partie provoquée par l'il-15.

24 Schéma bilan

25 LA MALADIE COELIAQUE 1

26 Introduction Maladie coeliaque ou intolérance au gluten : maladie auto-immune qui peut être associée à d autres maladies auto-immunes comme le diabète. C est un désordre complexe de l intestin grêle causé par une réponse immunitaire inappropriée suite à l ingestion de gluten présent dans le blé, l orge et le seigle. Gluten : ensemble de protéines dont une fraction est appelée la gliadine. Riche en proline et glutamine. La haute composition en proline le rend résistant à la digestion enzymatique, expliquant la persistance de peptides intacts. Les molécules HLA sont capables d exprimer les peptides du gluten mais les LT CD4 spécifiques du gluten ne sont retrouvés que chez les personnes portant l allèle HLA-DQ2 ou 8. Caractérisée par : - atrophie villositaire de la muqueuse intestinale - hyperplasie des cryptes - infiltration lymphocytaire de l épithélium et de la lamina propria Amène à une malabsorption des nutriments et/ou une diarrhée chronique. Traitement : régime sans gluten 2

27 Introduction Fréquence de la maladie chez les apparentés de premier degré de personnes atteintes : 10 % Taux de concordance chez les jumeaux monozygotes : 70 à 90 % comparé à un taux chez les jumeaux dizygotes de 10 à 30 % Prédispositions génétiques : - 95% des personnes atteintes expriment l allèle HLA-DQ2 ou 8 - autres facteurs génétiques comme : * CTLA4 : impliqué dans la réponse T * RGS1 : impliqué dans l activation des LB * TAGAP : impliqué dans l activation des LT * SH2B3 : adaptateur intracellulaire du TLR, impliqué dans l activation des LT Facteurs environnementaux : - exposition précoce au gluten pendant l enfance - infection précoce avec des virus entéropathiques pendant l enfance - changement de la flore intestinale 3

28 Cause de la maladie Allèle HLA-DQ8 : en position β57 absence d un acide aspartique créant donc une charge positive dans la poche P9. Transglutaminase tissulaire TG2 : nécessite une inflammation pour être activée Transglutaminase tissulaire : TG2 La TG2 charge donc négativement le gluten au niveau de résidus glutamine. 4

29 Cause de la maladie Pourquoi, chez les porteurs de l allèle HLA-DQ8, les peptides de gluten entraînent une réaction immunitaire exagérée? Immunisation de souris humanisées pour HLA-DQ8 avec le peptide natif ou modifié sur des cibles de TG2 (position 229 et 237). Compétition peptide natif et déamidé : réponse dominante avec le peptide déamidé Q : peptide natif E : peptide déamidé 5

30 Cause de la maladie Etude du répertoire TCR impliqué dans la réponse immunitaire Q : peptide natif E : peptide déamidé La plupart des LT reconnaissant le peptide natif utilisent préférentiellement un jeu limité de chaîne Vβ : Vβ11, Vβ5 et Vβ14. Les LT reconnaissant le peptide déamidé expriment un large répertoire de TCR avec aucune préférence de chaîne. 6

31 Cause de la maladie Etude de la séquence des TCR des LT impliqués Q : hybridomes dérivés d une immunisation avec peptide natif E : hybridomes dérivés d une immunisation avec peptide déamidé CDR3β des TCR de cellules T d hybridomes réactifs au gluten natif ont une charge négative conservée (aspartate : D ou glutamate : E) et pas ceux réactifs au gluten déamidé. Modèle possible : les TCR contre les peptides sans résidus acides restreints à HLA-DQ8 peuvent utiliser une charge négative dans le CDR3β du LT pour stabiliser les complexes CMH-peptide via les interactions charge-charge. 7

32 Cause de la maladie Etude de la charge sur le TCR Q : peptide natif E : peptide déamidé TCR wt : stimulation avec E et Q réponse TCR rendu neutre sur un aa conservé (E Q) : uniquement réponse quand stimulation avec E TCR rendu neutre sur un aa non conservé (D N) : stimulation avec E et Q réponse Enlever la charge négative du TCR sur 1 aa conservé empêche la réponse avec le peptide natif charge négative du TCR importante pour le peptide natif. 8

33 Cause de la maladie Etude de la charge sur le CMH II Q : peptide natif E : peptide déamidé HLA-DQ8 wt (sans charge -) : réponse quand stimulation avec E et Q HLA-DQ8 D57 (avec charge -) : réponse uniquement quand stimulation avec E HLA-DQ8 peut provoquer de fortes réponses contre les peptides non chargés négativement en recrutant des TCR qui expriment une charge négative au niveau de CDR3β. 9

34 Cause de la maladie Les peptides de gluten natif recrutent une population de LT qui est crossréactive et hétéroclithe contre les peptides déamidés. Une fois l inflammation déclenchée TG2 est activée pour produire le peptide déamidé. Quantification de la réponse LT CD4 La fréquence de LT reconnaissant le peptide déamidé est largement augmentée après immunisation avec une mixture de peptides natifs et déamidés. 10

35 Cause de la maladie Le peptide de gluten natif est présenté par HLA-DQ8 qui permet le recrutement de LT avec un répertoire restreint de TCR. Ces TCR possèdent un acide aminé chargé négativement conservé au niveau de la région CDR3β ce qui permet de stabiliser le complexe pcmh-tcr. Engendre une inflammation qui permet d activer TG2 qui déamide le peptide de gluten et laisse apparaître des charges négatives. Le peptide déamidé qui à une affinité plus élevée pour HLA-DQ8 est présenté à un large répertoire de TCR qui n a plus besoin d être chargé négativement. Ceci active un grand nombre de populations de LT CD4 et augmente l inflammation. 11

36 Cause de la maladie Développement d anticorps : - anti-transglutaminase tissulaire (IgA) - anti-gliadine (IgA et IgG) 12

37 Problèmes immunitaires engendrés Etudes récentes : large expression des récepteurs de la famille NKG2 sur LTc effecteurs révèle un nouveau mécanisme régulant les fonctions cytolytiques dans le tissu micro-environnant. Etude de l expression de NKG2D sur les LTc intraépithéliaux. Le patient coeliaque à un niveau nettement supérieur de NKG2D qui diminue considérablement après un régime sans gluten et avoisine la situation normal. LTc intraépithéliaux de patients ceoliques sur-expriment NKG2D. 13

38 Problèmes immunitaires engendrés Etudes antérieures : L exposition des LTc à l IL-15 sur-régule l expression de NKG2D Observation de l expression de NKG2D à la surface des LTc intraépithéliaux TCRαβ+ quand incubés avec des cytokines IL-15 permet l augmentation de l expression de NKG2D à la surface des LTc intraépithéliaux. Mesure du % de lyse spécifique : pré-incubation avec IL-15 Avec anti-cd3 : lyse via l activation du TCR Avec anti-nkg2d : lyse via l activation de NKG2D L augmentation de la lyse correspond bien à l expression progressive de NKG2D. 14

39 Problèmes immunitaires engendrés NKG2D a plusieurs ligands dont MIC, ULBP et HLA-E Etude de l expression de MIC par cytométrie de flux sur des cellules épithéliales intestinales. MIC faiblement exprimé à la surface des cellules épithéliales intestinales normales mais fortement exprimé chez les patients coeliaques. Après un régime sans gluten le taux redevient normal. L ingestion de gluten et l induction de MIC sont donc corrélées. 15

40 Problèmes immunitaire engendrés Etude de l activité cytolytique de LTc intraépithéliaux de biopsies sur des cellules. Fig3B L expression de MIC permet la lyse par les LTc de patients coeliaques. Après régime sans gluten les LTc ne sont plus capables de lyser. 16

41 Problèmes immunitaire engendrés 17

42 Problèmes immunitaire engendrés 18

43 Problèmes immunitaire engendrés Voie de signalisation NKG2D lie l immunité innée et adaptative car déclenche la cytotoxicité médiée par les lymphocytes antigène-spécifique et induit une fonction cytolytique directe indépendante du TCR dans les cellules effectrices CD8. Chez la souris, dans les cellules NK, mort médiée par NKG2D dépendant de DAP12 (contient un motif ITAM donc recrute et active ZAP70/Syk). Chez l homme NKG2D associé à DAP12? NKG2D co-précipite avec DAP10 et non DAP12. DAP10 n induit pas la phosphorylation de ZAP70 la signalisation NKG2D n implique pas d adaptateurs comprenant des motif ITAM. 19

44 Problèmes immunitaire engendrés Voie de signalisation Observation de l effet de plusieurs inhibiteurs de kinase sur la mort des cellules médiée par NKG2D. Inhibiteur PLCg : U73122 Inhibiteur MEK1/2 : PD98059 Inhibiteur p38 : SB Inhibiteur PI3kinase : wortmanin et lys Inhibiteur JNK : SP MEK1/2 JNK Voie JNK et MEK ont un effet sur la lyse médiée par NKG2D Supprime la lyse médiée par NKG2D et CD3 Supprime la lyse médiée par NKG2D 20

45 Problèmes immunitaire engendrés Voie de signalisation Voie ERK et MEK activées par NKG2D/DAP10? Inhibiteur PI3 kinase empêche la phosphorylation de Erk. Inhibiteur PI3 kinase n empêche pas l activation de JNK. ERK phosphorylé et JNK activé. NKG2D peut médier la phosphorylation de ERK et l activation de JNK et la fonction catalytique de la PI3 kinase est essentielle pour ERK mais pas JNK. 21

46 Problèmes immunitaire engendrés Voie de signalisation Sur-régulation de la phosphorylation de Erk dans les cellules épithéliales et les LTc intraépithéliaux coeliaque? Patient coeliaque : sur-régulation de la phosphorylation de Erk Après régime sans gluten : retour à la normal 22

47 Problèmes immunitaire engendrés Voie de signalisation Résumé IL-15 NKG2D + MIC PI3 Kinase ERK JNK LYSE 23

48 Conclusion La présentation du peptide natif par HLA DQ8 à un groupe de LT restreint entraîne une réaction d inflammation qui va activer TG2. La déamidation du gluten permet une présentation plus efficace par HLA DQ8 à un répertoire de LT plus large ce qui provoque une inflammation beaucoup plus importante. Les LT activés produisent des cytokines et activent la production d anticorps anti-tg2 et antigliadine. Les cellules épithéliales de l intestin ainsi que les cellules dendritiques et les macrophages, stimulés par l entrée du gluten, expriment MIC (ligand NKG2D) et sécrètent de l Il-15 qui va activer le récepteur NKG2D à la surface des cellules épithéliales intestinales et entraîner la lyse des cellules épithéliales. 24