α-amylasi SALIVA Détermination enzymatique de l'α-amylase dans la salive.
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1 α-amylasi SALIVA Détermination enzymatique de l'α-amylase dans la salive. IVD LOT Voir l étiquette externe Σ = 96 tests RÉF DKO075 USAGE PRÉVU Le coffret α-amylase Salive est un dosage cinétique colorimétrique pour la détermination quantitative de l'amylase dans la salive. 1. SIGNIFICATION CLINIQUE L'amylase est le nom donné aux enzymes hydrolysant l'amidon. Les enzymes hydrolysant les polysaccharides sont classés comme saccharides. Même si différentes amylases -indiquées par différentes lettres grecques- existent, elles agissent toutes sur les liens α-1,4-glycosidiques. Les α-amylases sont des enzymes métalliques complètement incapables de fonctionner en l'absence de calcium. L'α-amylase hydrolyse les carbohydrates à chaîne longue en maltotriose et maltose à partir de l'amylose, ou maltose, glucose et «dextrines limites» à partir de l'amylopectine. Chez les animaux, il s'agit de la principale enzyme digestive. Même si elle est diffuse dans de nombreux tissus, l'amylase est présente avant tout dans les sucs pancréatiques et la salive, chaque région présentant une isoforme différente. L'amylase salivaire hydrolyse l'amidon en maltose et dextrine. Cette isoforme est dénommée ptyaline. La ptyaline agit sur les grandes molécules insolubles d'amidon chez les amides solubles (amylodextrine, érythrodextrine, acrodextrine) qui seront ensuite scindées en amides plus petits et en maltose. La ptyaline agit sur les liens α(1,4) glycosidiques linéaires, mais l'hydrolyse complète requiert un enzyme en mesure d'hydrolyser les liens ramifiés. L'amylase salivaire est désactivée dans l'estomac par l'acide gastrique. L'α-amylase pancréatique hydrolyse en mode aléatoire les liens α(1-4) glycosidiques d amylose en libérant de la dextrine, du maltose et des molécules de glucose. 2. PRINCIPE LA MÉTHO L'amylase humaine catalyse l'hydrolyse du 2-chloro- 4 nitrophényl-α-maltotrioside (CNP-G3) en polymères de glucose et les p-nitrophényloligosaccharides à chaîne courte avec formation de 2-chloro-4-nitrophénol (CNP). L'augmentation d'extinction est évaluée par photométrie à 405 nm et est proportionnelle à l'activité de l'amylase présente dans l'échantillon. 3. REACTIFS, MATERIAUX ET INSTRUMENTS 3.1. Réactifs et matériaux fournis dans le coffret 1. Réactif A (1 flacon, 32 ml) CNP-G3 2 mmol/l, tampon de Good 100 mmol/l, agents de stabilisation et de conservation RÉF DCE Tampon d'essai conc.5x (1 flacon, 50 ml) Tampon Hepes 200 mm ph 7,4 ; BSA 0,5 g/l RÉF DCE049/ Microplaque RÉF DMZ Réactifs nécessaires non fournis dans le coffret Eau distillée Matériaux et instruments auxiliaires Distributeurs automatiques. Lecteur pour microplaques (405 nm). Remarques Conserver tous les réactifs à 2 8 C, à l'abri de la lumière. 4. PRÉCAUTIONS D'USAGE Après l'ouverture, les composants du coffret doivent être conservés à 2 8 C à l'abri de la lumière ; ne pas utiliser les composants après la date de péremption. Le coffret doit être exclusivement utilisé à des fins diagnostiques in vitro. Éviter le contact avec les réactifs qui pourraient être toxiques à l'ingestion. Ne pas pipeter avec la bouche.
2 5. PROCÉDURE 5.1. Préparation du tampon d'essai Diluer le flacon entier de tampon d'essai conc. 5x. dans 200 ml d'eau distillée ou déionisée. Maintenir à 2 8 C jusqu'à la date d'échéance rapportée sur l'étiquette du flacon Préparation de l'échantillon Pour le prélèvement de l'échantillon, il est conseillé d'utiliser des éprouvettes en verre de centrifugation et une paille en plastique. Faire couler la salive à travers le tuyau de pipe dans l'éprouvette en verre, la congeler et la décongeler pour favoriser la précipitation des mucines. Centrifuger l'échantillon pendant 15 minutes à 3000 t/min. Ne pas utiliser des éprouvettes en plastique ou des dispositifs disponibles en commerce parce qu'ils altèrent le résultat de l'analyse. Diluer le surnageant liquide de 10 µl à 1 ml avec du tampon d'essai dilué (réactif 2). Mettre à agiter délicatement sur un agitateur rotatif pendant au moins 5 minutes. Si le dosage n'est pas effectué le jour même du prélèvement, conserver l'échantillon à -20 C PROCEDURE Amener tous les réactifs à température ambiante, soit C. Si un nombre élevé d'échantillons doit être dispensé manuellement, il est conseillé de charger un nombre maximal de quatre bandes à la fois. Préparer les puits de la microplaque pour chacun des échantillons à tester. Reposer chaque bande inutilisée dans le sachet. Échantillon Blanc Échantillon dilué 10 μl --- Eau distillée μl Réactif A 300 μl 300 μl Laisser incuber à 37 C pendant 3 min immédiatement après la distribution des réactifs. En fin d'incubation, déposer la microplaque dans le lecteur à température ambiante (22-28 C) et relever la variation d'absorbance (ΔA) à 405 nm deux fois, la première fois au bout de 1 minute et la deuxième fois au bout de 5 minutes à compter de la fin de l'incubation en soustrayant l'absorbance du blanc à chaque lecture. 6. CONTRÔLE QUALÉ Chaque laboratoire devrait analyser les échantillons dans la gamme des niveaux élevés, normaux et bas de α-amylase pour vérifier les prestations de l'analyse. Ces échantillons devraient être traités comme inconnus et les valeurs déterminées devraient être dans chaque test effectué. Les tableaux de contrôle de la qualité devraient être observés afin de suivre les prestations des réactifs fournis. Des méthodes statistiques appropriées devraient être employées pour vérifier la tendance. Le laboratoire devrait définir des limites d'acceptabilité des prestations d'analyse. La déviation significative par rapport aux prestations établies peut indiquer un changement non observé des états ou une dégradation expérimentale des réactifs du coffret. Des réactifs frais doivent être utilisés pour déterminer le motif des variations. 7. LIMATIONS LA PROCÉDURE 7.1. Prestations de l'analyse Il est important que le temps de réaction de chaque puits soit le même aux fins de la reproductibilité des résultats. Les lecteurs de microplaques mesurent les DO dans le sens vertical. Ne pas toucher le fond des puits. 8. RÉSULTATS Calculer ΔA/Min.= [(A 5 min A 1 min ) / 4] Calcul : α-amylase (U/mL) : A/min x TV x DF MMA x SV x LP avec : ΔA/Min = différence d'absorbance par minute TV = volume total de l'essai (0,310 ml) DF = facteur de dilution MMA = coefficient d'absorbance (extinction) millimolaire du 2-chloro-p-nitrophénol (12,9) SV = volume de l'échantillon (0,010 ml) LP = chemin optique en centimètres = 0,95 (spécifique pour la microplaque reçue avec le coffret) ΔA/min x 0,310 x 100 = ΔA/min X 253 = U/mL (*) 12,9 x 0,010 x 0,95 (*) = activité d'α-amylase dans l'échantillon Remarque : la microplaque fournie dans le coffret n'est pas traitée chimiquement et son usage prévu est celui de récipient de réaction. La réaction pourrait, d'une autre façon, être conduite dans un récipient différent (par exemple, sur des cuvettes pour spectrophotométrie), et il est donc important de déterminer le bon chemin optique LP, ou la distance parcourue par la radiation lumineuse à travers l'échantillon ; il est en général de 1 cm pour les cuvettes standard.
3 9. VALEURS RÉFÉRENCE Adultes (normales) 80,0 U/mL Fourchette absolue : U/mL 10. PARAMÈTR CARACTÉRISTIQU Précision Intra-essai La variabilité à l'intérieur du même coffret a été déterminée en répliquant (16x) la mesure de deux échantillons différents de salive. La variabilité intraessai est de < 1,5 % Inter-essai La variabilité entre dosages différents a été déterminée en répliquant la mesure de trois échantillons différents de salive avec deux coffrets appartenant à des lots différents. La variabilité interessai est de < 1,5 % Sensibilité La concentration minimale de α-amylase mesurable est de 2,5 U/mL avec une limite de confiance de 95% Corrélation Le coffret de α-amylase (Diametra) a été comparé à un coffret analogue disponible en commerce. La courbe de régression est : y = 1,19 x + 2,55 r = 0,998 (r 2 = 0,996) 11. DISPOSIONS RELATIV À L'ÉLIMINATION D DÉCHETS Les réactifs doivent être jetés conformément aux lois en vigueur. BIBLIOGRAPHIE - Tietz NW. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd ed. Philadelphia: WB Saunders Company: (1995) - (IFCC) Approved Recommendation on IFCC Methods for the measurement of catalytic concentration of Enzymes _Part 9 - Clin Chem Lab Med 36(3): (1998) Éd. 04/2010 DCM075-2 DiaMetra S.r.l. - Siège social : Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italie Tél Fax Fabricant : Via Giustozzi 35/35a Z.I. Paciana FOLIGNO (PG) Italie Tél Fax Courriel : info@diametra.com
4 DIA.METRA SRL Mod. PIS NOTICE D'INFORMATION Spiegazione dei simboli Explanation of symbols Explication des symboles Significado de los simbolos Verwendete Symbole Explicaçao dos simbolos In vitro Diagnostikum Producto sanitario para diagnóstico in vitro Dispositif médical de diagnostic in vitro In vitro Diagnostic Medical Device Dispositivo medico-diagnostico in vitro Dispositivos medicos de diagnostico in vitro Hergestellt von Elaborado por Fabriqué par Manufacturer Produttore Produzido por RÉF Bestellnummer Nûmero de catálogo Références du catalogue Catalogue number Numero di Catalogo Número do catálogo yyyy-mm Herstellungs datum Fecha de fabricacion Date de fabrication Date of manufacture Data di produzione Data de produção yyyy-mm-dd Verwendbar bis Establa hasta (usar antes de último día del mes) Utiliser avant (dernier jour du mois indiqué) Use by (last day of the month) Utilizzare prima del (ultimo giorno del mese) Utilizar (antes ultimo dia do mês) Biogefährdung Riesgo biológico Risque biologique Biological risk Rischio biologico Risco biológico Gebrauchsanweisung beachten Consultar las instrucciones Consulter le mode d emploi Consult instructions for use Consultare le istruzioni per l uso Consultar instruções para uso Chargenbezeichnung Codigo de lote Numéro de lot Batch code Codice del lotto Codigo do lote Σ = xx Ausreichend für n Tests Contenido suficiente para n tests Contenu suffisant pour n tests Contains sufficient for n tests Contenuto sufficiente per n saggi Contém o suficiente para n testes Cont. Inhalt Contenido del estuche Contenu du coffret Contents of kit Contenuto del kit Conteúdo do kit Min Max Temperaturbereich Límitaciôn de temperatura Limites de température de conservation Temperature limitation Limiti di temperatura Temperaturas limites de conservação
5 DIA.METRA SRL Mod. PIS NOTICE D'INFORMATION SUGGTIONS POUR LA RÉSOLUTION D PROBLÈM / DÉPANNAGE ERREUR CAUS POSSIBL / SUGGTIONS Aucune réaction colorimétrique du dosage - non dispensation du réactif A - contamination du réactif A - erreurs dans l'exécution du dosage (par ex., distribution accidentelle des réactifs en provenance de mauvais flacons, etc.) Réaction trop faible (DO trop basse) - réactif A non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original) - temps d'incubation trop court, température d'incubation trop basse Réaction trop intense (DO trop élevée) - réactif A non approprié (par ex., ne provenant pas du coffret original) - temps d'incubation trop long, température d'incubation trop élevée Valeurs inexplicablement hors plage - contamination des pipettes, embouts ou récipients, CV% intra-essai élevé - les réactifs et/ou les bandes n'ont pas atteint la température ambiante avant usage - conditions d'incubation non constantes (temps ou température) - dilatation des temps de distribution - variabilité intrinsèque des opérateurs
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