Figure 1 : Elichrom Coryne

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1 Figure 1 : Elichrom Coryne Figure 2 : Phoenix 100 Figure 3 : API Coryne

2 Sommaire Les bactéries du genre Corynebacterium sont des bacilles Gram positif faisant en général partie de la flore physiologique de la peau. Toutefois, ils peuvent provoquer des infections graves chez l Homme. Afin de pouvoir traiter une potentielle infection, il est important d identifier ce genre de bactérie. Le laboratoire Synlab en bactériologie emploie actuellement l API Coryne et le Phoenix pour l identification de celui-ci. Le but de mon travail est de comparer les résultats d identification entre l API Coryne, le Phoenix et une autre méthode appelée Elichrom Coryne afin de savoir quelle méthode serait la plus fiable. Après l obtention de résultats discordants entre ces 3 méthodes, nous nous somme rendus compte qu aucune d elle n était fiable. Nous nous sommes donc penchés sur d autre méthodes supplémentaires d identification tel que Maldi-Tof, le séquençage ainsi que d autres tests conventionels comme le test de CAMP et l O129. Abstract The genus Corynebacteria are defined as Gram positive rods, with the exception of few pathogens most of them are considered as the normal physiological flora of skin. However they could be a cause or could participate in a variety of infections. A reliable identification method is necessary for treatment of such infections. At Synlab bacteriology department the API Coryne from BioMerieux and Phoenix BD system are used for identification of Corynebacteria. This study evaluates a new identification test Elichrom Coryne, and compares the results of the three tests namely API Coryne, Phoenix and Elichrom Coryne. The final results were compared with the results obtained by Maldi- Tof, Ribosomal RNA sequencing, O129 and CAMP-tests. This study shows that there is no agreement between the results obtained by the three tests and neither could be considered as a reliable test for identification of the Corynebacteria.

3 1. INTRODUCTION Généralités Historique Morphologie et caractéristiques biologiques Habitat et mode de transmission Pouvoir pathogène Facteur de pathogénicité Méthode d identification Traitement et prophylaxie Signification clinique OBJECTIF DE L ETUDE MATERIEL ET METHODE Origine des souches bactériennes testées Tests complémentaires Catalase Test de CAMP O API Coryne Phoenix Elichrom Coryne RESULTATS DISCUSSION ET CONCLUSION BIBLIOGRAPHIE Sites internet Supports de cours Images LEXIQUE REMERCIEMENT ANNEXES Annexe I : Description des colonies Annexe II : Résultats obtenus par API Coryne Annexe III : Protocole du Phoenix... 29

4 1.1 Généralités 1. Introduction Historique La découverte des corynebactéries date de 1883 quand Mr. Klebs identifia le bacille diphtérique appelé Corynebacterium diphteriae lors d examens des fausses membranes de patients atteints de croups (angine provoquant un développement des fausses membranes pouvant asphyxier le malade en cas d extension au larynx). Cette bactérie est également appelée bacille coryneforme ou bacille diphtéroïde. [1 ] Morphologie et caractéristiques biologiques Le genre Corynebacterium est composé de bacilles à Gram positif, sous forme de bâtonnet immobile, aérobie, généralement catalase positive, dont le groupement en amas, «en lettre chinoise» ou en palissade est caractéristique. L arrangement en forme de V résulte du mouvement de rupture suivant la division cellulaire. Cette division particulière est la résultante de la composition en double couche de la paroi cellulaire. Les espèces appartenant au genre Corynebacterium sont très diverses. Certaines sont pathogènes pour les animaux et les végétaux, alors que d autres sont des commensaux pouvant parfois se comporter comme des bactéries opportunistes. Certaines espèces sont pathogènes pour l homme, notamment C. diphteriae, agent responsable de la diphtérie. [2,3 ] Le genre Corynebacterium pousse sur gélose au sang après 24 à 48h en aérobie. L aspect des colonies peut varier selon les espèces Habitat et mode de transmission Plusieurs espèces de corynebactéries font partie de la flore normale de la peau et des muqueuses chez les humains et les animaux. Toutefois, certaines espèces provoquent des infections très ciblées. Prenons l exemple de quelques espèces telles que : C. jeikeium : infections chez les patients immunodéprimés, hospitalisés depuis longtemps, porteurs de cathéters, et subissant une antibiothérapie à large spectre. Pouvant provoquer des endocardites infectieuses chez des patients ayant des prothèses de valves cardiaques. C. resistens : septicémie, abcès, infections respiratoire. C. minutissimum : erythrasma. C. amycolatum : infection lors d acte invasif, et de matériel étranger. C. accolens : infection du tractus respiratoire. C. striatum : infection de plaie ou de cathéter

5 C. diphteriae est propre à l espèce humaine. Cette espèce est essentiellement transmise d homme à homme par les sécrétions nasopharyngées et à partir d un contact direct. Le portage de souches non toxinogènes est relativement fréquent, mais des souches toxinogènes importées peuvent aussi circuler chez des porteurs asymptomatiques. La présence très fréquente de corynebactéries commensales au niveau des muqueuses et de la peau complique le diagnostique, notamment direct, et requiert des milieux sélectifs pour isoler C. diphteriae. Dans la diphtérie on reconnaît deux types de manifestation : - Locale : liée a la multiplication du germe au niveau de la porte d entrée. - Générale : liée à la diffusion de la toxine dans l organisme [4,5 ] Pouvoir pathogène L incidence d infections opportunistes dues à des bactéries corynéformes est croissante. Comme décrit précédemment, certaines se rencontrent chez les sujets porteurs de matériel étranger et surtout chez des patients immunodéprimés. Il peut s agir d infections de localisation diverses, en particulier urinaires, lors de septicémies et d endocardites. C. diphteriae est responsable d infections se localisant au niveau de la sphère buccopharyngée. Ce pathogène peut induire la maladie infectieuse appelée diphtérie si l infection est due à une souche toxinogène. La toxine nécrose les tissus avoisinant ce qui favorise l extension locale du germe et induit une réaction inflammatoire particulière avec sécrétion d un exsudat épais caractéristique appelé la fausse membrane. La toxine passe ensuite dans le sang entraînant des signes cliniques graves tels qu une myocardite, paralysie des nerfs crâniens et des nerfs périphériques. D autres souches de C. diphteriae non toxinogène sont responsables d angines non compliquées, d endocardites, d infection cutanée et articulaire. Toutefois, il existe des porteurs asymptomatiques pouvant être contaminés par ces souches. [2,6 ] Facteurs de pathogénicité C. diphteriae doit son pouvoir pathogène à sa capacité à sécréter une toxine qui va provoquer des lésions locales et surtout diffuser dans l organisme. La toxine diphtérique est une protéine dont le gène est porté par un prophage. La toxine est composée de deux sous-unités A et B. Le fragment B permet au fragment A de pénétrer dans la cellule et d exercer son activité. Le fragment A est libéré dans le cytoplasme et bloque, par son activité ADP ribosylase, une enzyme du ribosome qui provoque la translocation de la chaîne polypeptidique en cours de synthèse. L inhibition de la synthèse protéique due à l action de la toxine est à l origine de la mort de la cellule puisqu elles ne sont plus capables de se diviser. [1,2 ] Méthode d identification de Corynebacterium Les tests conventionnels disponibles dans tous les laboratoires de microbiologie permettent de donner de bons indices quant à l identification des corynebactéries.

6 La coloration de Gram, permet d exclure les bactéries ne faisant pas partie du genre Corynebacterium ou au contraire de confirmer ce genre. La morphologie, la taille, le pigment, l odeur et l hémolyse des colonies sont aussi des critères d identification. Tout comme le test de la catalase, de mobilité, d hydrolyse de l urée et de l esculine. Le Camp-test peut aussi être utilisé. Grâce à une beta-hemolysine produite par Staphylococcus aureus et en présence d une souche de corynebactérie CAMP positive, cela induit une augmentation de l effet de la ß-hemolysine du Staphylococcus aureus. Cette réaction permet d observer une hémolyse complète sur gélose au sang en forme de tête de flèche. L API Coryne est un système d identification contenant 49 taxons inclus dans sa base de donnée. Il est aussi utilisé pour l identification des corynebactéries. Nous en parlerons plus précisément dans les chapitres suivants. Le Phoenix est un automate qui identifie une large gamme de bactéries à l aide de cartes réactionnelles multipuits. Il est également capable de réaliser des antibiogrammes dont la gamme d antibiotiques est adaptée aux groupes de bactéries. Le séquençage de la partie 16S ARNr est très fréquemment utilisé pour l identification de bactéries. Afin d identifier l espèce à laquelle appartient une séquence donnée, on détermine quelles sont les séquences de la banque de donnée qui sont les plus proches du point de vue phylogénétique. Pour ce faire, on recherche tout d abord l ensemble des séquences les plus similaires. Pour C. diphteriae en plus de l étude des caractères biochimiques, il est important d effectuer une autre méthode telle que : La culture sur milieu Tinsdale qui montre la présence de colonies noires entourées d un halo brun. Contrairement au corynebactéries commensales qui donnent des colonies noires sans halo brun. [7 ] Traitements et prophylaxie Concernant C. diphteriae, le traitement est une urgence en raison des effets de la toxine. L infection fait l objet de soins intensifs en particulier pour éviter l étouffement lié à l extension de l angine. Le traitement curatif doit comporter avant tout une sérothérapie antitoxique. Plus l administration est précoce plus le traitement est efficace. Il existe aussi un traitement à l aide d antibiotiques tel que les β-lactamines, l amoxicilline ou les macrolides. Toutefois, leur utilité sert à limiter la contamination de l entourage et à accélérer la disparition du germe chez les individus restant porteurs de ce type de germes après guérison. En terme de prophylaxie, il existe un vaccin qui repose sur l administration d anatoxine. Celle-ci est un dérivé de la toxine ayant perdu son activité biologique mais qui conserve son immunogénicité. Ce vaccin a permis une diminution de la diphtérie sans pour autant faire disparaître les souches toxinogènes toujours présentes en Europe de l Est. [5,8 ]

7 1.1.8 Signification clinique Les bacilles à Gram positif qui poussent en aérobiose et qui sont susceptibles d être pathogènes pour l homme ou d être rencontrés dans des prélèvements d origine humaine sont nombreux. La morphologie de certains d entre eux est assez évocatrice pour que d emblée, on puisse les rattacher à un genre bactérien précis : c est habituellement le cas des bactéries appartenant au genre Corynebacterium. Une orientation diagnostique peut être obtenue en considérant la nature du prélèvement et son origine. L estimation de la signification clinique des corynebactéries isolées de divers prélèvements est souvent confuse. Le caractère saprophyte de la plupart des corynebactéries inclus le fait qu elles peuvent être souvent présentées comme contaminant de différent prélèvement. Les bactéries coryneformes doivent être identifiées si elles sont isolées d un site normalement stérile ou en culture pure ou abondante à partir d un site non stérile. Prenons l exemple d un échantillon d urine. Si celui-ci contient uniquement des corynebactéries à > 10 4 /ml ou si elles sont prédominantes et le total des bactéries est de >10 5 /ml, dans ce cas il est donc important d identifier l espèce de ces corynes. Pour les prélèvements urogénitaux, sperme ayant une suspicion d infection à Corynebacterium, nous identifions à l espèce car il peut s agir de C. glucuronolyticum pouvant provoquer des urétrites et l infertilité chez l homme. 2. Objectif de l étude Au laboratoire de bactériologie à Synlab, l identification des corynebactéries se fait à l aide du Phoenix et de l Api Coryne. Cependant, ces méthodes analytiques ne permettent pas d obtenir des résultats corrects à 100%, dans les cas suspects d infection à Corynebacterium. Le but de cette étude est de tenter de mettre en place, à Synlab, une nouvelle méthode d identification, appelée Elichrom Coryne. Puis par la suite, de comparer les résultats d identification de différents moyens d analyse et ainsi, d instaurer au laboratoire, la plus fiable. Toutefois, dans le cas où aucune méthode n est concluante, il est essentiel de se questionner sur l importance de l identification de ces bactéries et quel problème pourrait-on rencontrer dans le cas où nous ne l identifierions pas. Pour ce faire, j ai testé 21 souches de corynebactéries issues de différents prélèvements. Les souches de 1 à 10 proviennent du laboratoire de bactériologie à Synlab et les souches de 11 à 21 proviennent du laboratoire de bactériologie au CHUV. 3. Matériels et Méthodes 3.1 Origine des souches bactériennes testées Les souches utilisées afin d effectuer mon étude proviennent de différents prélèvements. 10 souches provenant du laboratoire de bactériologie à Synlab ont été identifiées à l aide du Phoenix ou de l API Coryne.

8 Les corynebactéries ont ensuite été isolées sur une gélose Columbia au sang et incubées 48h à 37 C en aérobiose, puis inoculées dans un bouillon BHI A-T avec la même incubation que pour la gélose au sang. Le bouillon est ensuite conservé dans une chambre froide à 4 C. Dû à un manque de souches bactériennes fournies par le laboratoire Synlab, nous sommes entrés en collaboration avec le département de bactériologie du CHUV afin de pouvoir augmenter le nombre de souche à tester. Finalement, 11 souches supplémentaires provenant du CHUV m ont permis de réaliser cette étude. Celles-ci ont été identifiées au Maldi-Tof puis isolées de la même manière que pour les 10 souches précédentes. Mise en culture Afin de m assurer qu il n y ait pas eu de contamination des bouillons, j ai premièrement fait une coloration de Gram sur chacun d eux puis, j ai ensuite mis les 21 souches de bactéries en culture. Nom : Référence : Lot : Fournisseur : Oxoid Date de péremption : Incubation : 48h à 37 C en aérobiose Confirmation de la souche à tester Après isolement, j ai fais une coloration de Gram des colonies obtenues sur gélose au sang ainsi qu une catalase qui, est généralement positive chez les corynebactéries. Après avoir confirmé l appartenance de la souche à identifier au groupe des bacilles à Gram positif, j ai ensuite décrit chacune des colonies soit ; Leur taille, leur forme, leur couleur, l aspect ainsi que l hémolyse. (Cf. annexe I : Description des colonies) 3.2 Tests complémentaires Catalase Principe de la méthode Selon la fiche technique du kit ID color catalase, certaines bactéries produisent une catalase qui est une enzyme de nature ferroprotéique capable de catalyser l hydrolyse de H 2 O 2 en libérant de l O 2. 2H2O2 2H2O + O2 La plupart des micro-organismes aérobies possèdent une catalase, en particulier les bacilles Gram négatifs aérobies. Son absence est donc un critère d'identification intéressant. Par exemple, parmi les coques Gram + aérobies, seuls les Streptococcaceae sont catalase négative. Lactobacillus et Erysipelothrix sont les seuls groupes de bacilles Gram + aérobies non sporulés dépourvus de catalase.

9 !"#$%&'(")$%*''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''+$,-,./'#%'#.0/12%' 34%'-5/6%' ' ''''''''''''''''#6)%27$%'8944':',-$./'8948' ' Réactifs et matériel Matériel du coffret : Nom : ID color catalase (ID-ASE) Référence : Lot : Fournisseur : Biomérieux Date de péremption : Matériel non fournis : - Lame porte-objet Anse en plastique Mode opératoire!!! Prélever une colonie avec une anse puis la déposer sans l étaler sur une lame propre et sèche. Laisser tomber une goutte de réactif ID-ASE sur le dépôt Observer immédiatement Contrôle de qualité effectué le Souche contrôle : Références : Lot : Fournisseur : Staphyloccocus aureus ATCC C701OL Oxoid Lecture et interprétation Figure 4 : image prise le au laboratoire Synlab Test de catalase avec la souche contrôle Staphyloccocus aureus ATCC Réaction positive faisant apparaître des bulles dû au dégagement de gaz O2 Catalase + Figure 5 : image prise le au laboratoire Synlab Test de catalase avec une souche d entérocoque Réaction négative ne faisant pas apparaître de bulles Catalase ' P'

10 3.2.2 Test de CAMP Principe de la méthode C. striatum donne, sur gélose au sang de mouton, des colonies entourées d'une zone étroite d'hémolyse à bords net. Ceci est dû à l augmentation de la β-hémolyse du Staphylococcus aureus en présence de certaines espèces de corynebactéries. Alors que C. amycolatum et C. pseudodiphteriticum donnent une réaction négative. Matériel Nom : Référence : Lot : Fournisseur : Oxoid Date de péremption : - Staphylococcus aureus ATCC - Anse en plastique - Etuve à 37 C aérobie Mode opératoire Faire une strie de Staphylococcus aureus productrice de toxine staphylococcique sur une gélose au sang de mouton Faire une strie de la souche à tester perpendiculairement à la strie de Staphylococcus aureus, sans la toucher. Incuber 24 à 48h en aérobiose à 37 C Contrôle de qualité effectué le Souche contrôle : Staphyloccocus aureus ATCC Références : C701OL Lot : Fournisseur : Oxoid Lecture et interprétation Figure 6 : image prise le au laboratoire Synlab Test de CAMP avec la souche contrôle Staphyloccocus aureus ATCC et la souche n 1 de C. striatum. Réaction positive se traduisant par l'observation d'une zone d hémolyse «en écaille», «en coin» ou en «croissant» à bords nets dans la zone d'intersection des deux stries.

11 3.2.3 O129 Principe de la méthode Cette méthode d identification est utilisée pour les coryne afin de différencier C. amycolatum qui est résistant au test et C. striatum qui est sensible. Cette technique d identification est faite à l aide d un disque imprégné d un composé vibriostatique O129. Le disque est déposé sur l ensemencement de la souche à tester. Durant l incubation, le disque diffuse la substance dont il est composé. Si la souche est sensible à O129 après l incubation cela se manifeste par une zone d inhibition autour du disque. Dans le cas contraire, nous observons une croissance de bactéries autour du disque. Matériel Nom : Référence : Lot : Fournisseur : Oxoid Date de péremption : Nom : O129 (150µg) Référence : DD Lot : Fournisseur : Oxoid Date de péremption : Ecouvillons - Etuve à 37 C aérobie Mode opératoire Réaliser une suspension de bactérie avec la souche à tester dans une fiole de NaCl 0.85%. Ensemencer une gélose au sang à l aide d un écouvillon (façon antibiogramme) Déposer un disque O129 Incuber à 37 C en aérobie pendant 24 à 48h Lecture et interprétation Figure 7 : image prise le au laboratoire Synlab Test de O129 avec la souche n 1 de C. striatum. La souche est sensible à O129. Après incubation, manifestation d une zone inhibitrice autour du disque

12 Figure 8 : image prise le au laboratoire Synlab Test de O129 avec la souche n 4 de C. amycolatum. La souche est résistante à l O129. Après incubation, manifestation d une croissance bactérienne autour du disque. 3.3 API Coryne Principe de la méthode Selon la fiche technique du kit API Coryne c est un système standardisé pour l identification en 24 heures des bactéries coryneformes utilisant des tests biochimiques miniaturisés, ainsi qu une base de données spécifiques. Ce test se compose d une galerie constituée de 20 microtubes contenant des substrats déshydratés pour la mise en évidence d activités enzymatiques ou de fermentations de sucres. Les microtubes sont inoculés avec une suspension dense de bactéries. Les réactions produites pendant la période d incubation se traduisent par des changements de couleurs spontanés ou révélés par l adjonction de réactifs. Les tests de fermentations sont inoculés avec un milieu enrichi contenant un indicateur de ph. La fermentation des substrats entraine une acidification qui se traduit par un changement de couleur de l indicateur coloré. Après la période d incubation, la lecture de ces réactions se fait à l aide du catalogue analytique. Réactifs et matériel Matériel du coffret : Nom : API Coryne Référence : Lot : Fournisseur : Biomérieux Date de péremption : Contient : Galeries API Coryne Ampoules d API GP Medium Ampoules d API Suspension Medium, 3ml Ampoule McFarland, point 6

13 Réactifs et matériel non fournis : Nom : NIT1+ NIT2 Référence : Lot : Fournisseur : Biomérieux Date de péremption : Nom : ZYM A Référence : Lot : Fournisseur : Biomérieux Date de péremption : Nom : ZYM B Référence : Lot : Fournisseur : Biomérieux Date de péremption : Nom : PYZ Référence : Lot : Fournisseur : Biomérieux Date de péremption : Huile de paraffine ID color catalase (ID-ASE) Densimat Logiciel d identification apiweb TM Pipettes Ecouvillons Etuve à 37 C aérobie Equipement général de laboratoire de bactériologie Mode opératoire Préparation de la galerie : Répartir un peu d eau dans la boîte d incubation pour créer une atmosphère humide. Placer la galerie dans la boîte d incubation. A l aide d un écouvillon, prélever des colonies (de 24 à 48h) et réaliser une suspension d opacité supérieure à celle du point 6 de Mc Farland dans l ampoule d NaCl. Dans les onze premiers tests de la galerie répartir la suspension précédente o pour les tests NIT à ESC : environ µl dans chaque cupule. o pour le test URE : remplir uniquement le tube. o pour le test GEL : remplir tube et cupule Dans les neuf derniers tests de la galerie (tests 0 à GLYG) :

14 o Transférer le reste de la suspension, soit environ 0,5 ml dans une ampoule d API GP Medium. o Répartir cette nouvelle suspension dans les tubes uniquement. Remplir les cupules des tests soulignés URE, 0 à GLYG avec de l'huile de paraffine. Refermer la boîte d'incubation. Incuber 24 heures (±2 heures) à 36 C ± 2 C en aérobiose. Lecture et interprétation Lecture de la galerie après incubation : Ajouter les réactifs : o Test NIT: 1goutte de NIT1 et NIT2 o Test PYZ : 1 goutte de PYZ o Tests PyrA, PAL, ßGUR, ßGAL, GLU, ßNAG: 1 goutte de ZYM A et B. Attendre 10 minutes, puis lire toutes les réactions en se référant au tableau de lecture. Interprétation : Détermination du profil numérique : Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et une valeur 1, 2 ou 4 est indiquée pour chacun. En additionnant à l'intérieur de chaque groupe les valeurs correspondant à des réactions positives, on obtient 7 chiffres qui constituent le profil numérique ; la réaction de catalase qui constitue le 21ème test est affectée de la valeur 4 lorsqu'elle est positive. Identification : Entrer les résultats dans le Mini API 3.4 Phoenix Principe de la méthode Selon la fiche technique du l automate, le système de microbiologie automatisé BD Phoenix est conçu pour identifier et effectuer un test de sensibilité aux antibiotiques sur des bactéries significatives d un point de vue clinique. Le système Phoenix donne des résultats rapides pour la plupart des bactéries anaérobies à Gram positif, ainsi que pour la plupart des bactéries aérobies et anaérobies facultatives à Gram négatif d origine humaine. Afin d identifier différents types de bactéries, cet automate utilise des substrats chromogéniques et fluorogéniques ainsi que des substrats à source de carbone. L appareil permet d effectuer au maximum 100 tests d identification. La galerie est formée d un côté ID, contenant des substrats déshydratés pour l identification des bactéries, et d un côté AST contenant des concentrations variées d antibiotiques. Le côté ID de la galerie comporte 51 puits dont 45 pourvus de substrats biochimiques déshydratés et 2 puits de contrôle de fluorescence. Les galeries Phoenix sont inoculées avec un inoculum standardisé. Une fois inoculées les galeries sont placées dans l instrument et incubées en continu à 35 C.

15 Réactifs et matériel Appareil : Nom : Phoenix PX 100 Fournisseur : Becton, Dickinson and company N de série : PX 1472 Mise en service : Matériel requis : Nom : Galeries Phoenix Référence : Lot : Fournisseur : Becton, Dickinson and company Date de péremption : Nom : Bouillon d inoculum Phoenix Référence : Lot : Fournisseur : Becton, Dickinson and company Date de péremption : Mode opératoire - Portoir pour galeries Phoenix - Néphélomètre PhoenixSpec - Pipette et embouts de 25 µl - Ecouvillons - Anse à inoculation Placer la galerie sur le portoir avec les puits d inoculation dirigés contre le haut. Prélever sur la gélose au sang des colonies de même morphologie à l aide d un écouvillon. Mettre les colonies en suspension dans le bouillon d inoculum (ID) Phoenix, puis homogénéiser la suspension. Mesurer une turbidité de MacFarland à 0.5 l aide du néphélomètre. Inoculer la galerie ID, en versant le bouillon ID dans l orifice de remplissage du côté ID de la galerie. (Conserver une partie du bouillon ID afin de vérifier la pureté de l inoculum, puis l ensemencer sur une gélose adéquate). Refermer l orifice avec le couvercle puis lancer l identification sur l automate, (Cf. Annexe III : Protocole du Phoenix).

16 Contrôle de qualité effectué le Souche contrôle : Staphyloccocus aureus ATCC Références : Lot : Fournisseur : Biomerieux Souche contrôle : Enterococcus faecalis ATCC Références : C703OL Lot : Fournisseur : Oxoid Lecture et interprétation Cf. Annexe III : Protocole du Phoenix 3.5 Elichrom Coryne Principe de la méthode Micro-méthode conçue pour identifier en 24 heures les principales bactéries corynéforme rencontrées en pathologie humaine. Elichrom est un système prêt à l emploi utilisant une galerie de 20 puits contenant des substrats sous forme déshydratés. L identification est basée sur la présence ou non d enzymes visualisées par des réactions colorées. Réactifs et matériel Matériel du coffret : Nom : Elichrom Coryne Référence : Lot : Fournisseur : Elitech Microbiology reagent Date de péremption : Contient : Suspension Coryne 2,5 ml : standarditation de l inoculum TC Coryne 2,5 ml : contrôle de dilution McFarland RM Coryne 2 ml : révélation après incubation du test RM Elichrom Coryne : galeries de 20 puits contenant les substrats déshydratés

17 Matériel non fournis : Matériel : Huile de paraffine Densimat Gélose Columbia au sang Pipettes stériles Etuve à 37 C aérobie Ecouvillons Equipement général de laboratoire de bactériologie Mode opératoire Préparation de la galerie : A l aide d un écouvillon, prélever des colonies (de 24 à 48h), puis les décharger dans un milieu suspension Coryne. La standardisation de l inoculum peut être réalisée de différentes façons : - Par rapport au flacon TC Coryne : ajuster l opacité du milieu...suspension Coryne ensemencé à celle du TC Coryne. - A l aide d un densiomètre : la turbidité du milieu de...suspension ensemencé doit être égale à 4 ou 4,5 MacFarland. Distribuer 100 µl de suspension Coryne ensemencé et standardisé dans chacun des 20 puits de la galerie. Distribuer 2 gouttes d huile de paraffine sauf dans le puits 10 (RM), incuber 24 heures (±1 heures) à 37 C en aérobiose. Lecture et interprétation Lecture de la galerie Après incubation : Lire toutes les réactions en se référant au tableau de couleur. Interprétation : L interprétation des résultats est réalisée par un système de codes. Pour établir le code, les caractères sont regroupés en quadruplets ou quintuplets. A chaque caractère est attribuée une note de zéro si l élément est négatif. Si l élément est positif, sa valeur dépend de sa position dans le quadruplet ou quintuplet. Dans un même regroupement, les valeurs sont additionnées, on obtient ainsi un code de 8 chiffres. Celui-ci sera recherché dans le livre de codage. Test RM optionnel : peut-être proposé dans le livre de codage en cas d identification multiple. Après incubation, ajouter 100 µl de réactif RM Coryne dans le puits 10 (RM). Pour ce caractère RM, affecter la valeur zéro pour le négatif et 1 pour le positif.

18 Identification : Elle est réalisée à partir d une base de donnée d'identification qui se trouve dans le livre de codage. 4. Résultats Afin de faciliter l interprétation des résultats, nous les avons concentrés dans le but de pouvoir les présenter sous forme de tableaux.

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20 Tableau 1 : Seuls les résultats ayant eu une valeur T (justesse) élevée à la lecture au mini API on été intégrés dans la première colone API Coryne. Dans le cas ou le résultat des 4 méthodes (n incluant pas le séquençage) nous donnaient C. striatum ou C.amycolatum, nous n avons pas différencié les 2 espèces car dans la majorité des identifications, les résultats obtenus étaient C. striat/c.amyc. [*1] L identification finale a été attribuée a chacune des souches si au minimum 2 méthodes sur les 4 (API Coryne, Elichrom Coryne, Phoenix et Maldi-Tof) donne le même résultat d identification. Afin d avoir un golden standard pour certaines souches et dans le cas où elles n ont pas eu d identification finale en corrélation avec ces 4 méthodes, nous les avons envoyées à séquencer. Comme présenté dans le tableau, les souches concernées sont ; 1, 2, 5, 7, 8, 10, 14, 17, 20. [*2] Chacune de ces colonnes représentent si oui (+) ou non (-) l identification finale (donnée soit par séquençage soit par le même résultat de 2 analyses) est en corrélation avec la méthode. [*3] Le ratio et le pourcentage de réussite ont été représentés sur 19 échantillons car 2 souches sur les 21 totales n ont pas pu donner d identification finale et ne peuvent donc pas être inclues dans les résultats. D après les résultats des 19 souches identifiées, voici la justesse de chacun: API Coryne Elichrom Coryne Phoenix Maldi-Tof a identifié correctement 7 souches au genre et à l espèce (et 12 souches au genre). Ce qui lui confère 37% de résultats corrects. a identifié correctement 13 souches au genre et à l espèce (et 6 souches au genre). Ce qui lui donne 68% de résultats corrects. a identifié correctement 10 souches au genre et à l espèce (et 3 souches au genre). Ce qui lui donne 52% de résultats corrects. a identifié correctement 19 souches au genre et à l espèce. Il a donc donné 100% de résultats corrects.

21 !"#$%&'(")$%*''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''+$,-,./'#%'#.0/12%' 34%'-5/6%' ' ''''''''''''''''#6)%27$%'8944':',-$./'8948' ' Tableau 2 : Comme vu précédemment, j ai effectué l O129 afin de départager l identification finale entre C. striatum qui est sensible au test et C. amycolatum qui est résistant. Le test a donc été effectué sur les souches suivantes ; 1*, 2*, 3, 4, 6, 8*, 9, 11, 12, 13, 15, 17, 18*, 19. Une autre analyse supplémentaire tel que le test de CAMP a été utilisé afin d avoir une identification plus précise à l espèce. Celui-ci a été réalisé sur les souches suivantes ; 1, 2, 3, 4, 6, 8*, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18*, 19, 21. *Nous avons par la même occasion effectué ces 2 tests supplémentaires sur les souches séquencées afin d évalué la fiabilité de la méthode par séquençage. ' 84'

22 Si nous comparons les résultats du test de CAMP et de l O129 entre eux, nous constatons que chacun d eux donne la même identification à l espèce. Nous pouvons donc affirmer que ces 2 tests conventionnels sont fiables. Cependant, les résultats obtenus par séquençage et ceux obtenus par les 2 tests supplémentaires ne corrèlent pas dans tout les cas. Les souches 1 et 8 montrent bien une discordance de l identification à l espèce. 5. Discussion et conclusion L identification de Corynebacterium à l espèce est recommandée dans les cas où l endroit infecté est normalement stérile, et s il est retrouvé seul et/ou nombreux dans un prélèvement. Toutefois, les résultats de mon étude démontrent qu il n existe aucune méthode sûre et valable pour l identification précise pour ce type de bactérie. Les tests supplémentaires que nous avons utilisés permettent de donner une bonne orientation quant au type de bactérie concerné, cependant ils doivent être complémentaires à d autres analyses. Les méthodes traditionnelles recommandent des tests dont la majorité ont été incorporés dans les kits commercialisés. Nous avons comparé 4 de ces tests ; API Coryne, Elichrom Coryne, Phoenix, Maldi-Tof et vérifié les résultats avec 3 autres tests ; séquençage comme golden standard, O129, CAMP. Nos résultats montrent que la grande majorité de ces tests donne une identification insuffisante avec 37% de résultats corrects pour API Coryne, 68% pour Elichrom Coryne, 52% pour Phoenix. A l exception de 100% pour Maldi-Tof. Comme décrit dans le tableau, la méthode de séquençage n a pas réussit a identifier 2 souches soit ; 1 et 8. Cela signifie que la base de donnée est incomplète et ne peut donc pas donner un résultat pour tous types de bactéries. Le test de CAMP et l O129 ne confirment pas toutes les identifications obtenues par le séquençage, ainsi, mettant en doute la fiabilité de cette méthode. Le Maldi-Tof donne la meilleure identification à l espèce et corrèle au mieux (100%) avec la méthode de séquençage. Toutefois, nous avons mentionné le manque de fiabilité du golden standard et donc cela met aussi en doute les résultats du Maldi-Tof. Voici une liste des prix des méthodes employées : API Coryne : Une galerie : Il faut aussi tenir compte des différents réactifs de révélation qui ne sont pas inclus dans le prix final. Phoenix : Automate : 79'900.- Une galerie Phoenix :

23 Elichrom Coryne : Une galerie : Envoi pour le séquençage : Identification d une souche : Finalement, par les résultats obtenus et le prix à investir pour chacune des analyses le laboratoire Synlab n investira pas dans une nouvelle méthode d identification. La question que nous pouvons nous poser est : quel est l intérêt d identifier à l espèce des corynebactéries? L identification à l espèce est utile pour l étude épidémiologique, dans le cas où il y a des résistances à certains antibiotiques et pour leur pouvoir pathogène. Les seule souches de Corynebacterium que l on connaît comme étant des «vrais» pathogènes sont C. diphteriae et C. glucuronolyticum. Les autres souches font partie de la flore physiologique de notre peau mais peuvent aussi participer dans diverses infections. Certes par la difficulté d identifier à l espèce, les résultats ne sont souvent pas fiables. Par ce fait, pouvons-nous nous contenter d envoyer un rapport de germe comme coryne sp. avec un antibiogramme en ayant exclu C. diphteriae dans les prélèvement de gorge et C. glucuronolyticum dans les prélèvements uro-génitaux? D un point de vue personnel, la réalisation de ce travail de diplôme a été très intéressante. Cela m a permis d approfondir mes connaissances théoriques et d acquérir un esprit critique face aux différents résultats obtenus. Par ce fait, il m a appris à avoir une certaine autonomie dans mes démarches analytiques. Certes, il m a été difficile de transcrire mes données par le fait de n avoir jamais eu l habitude d avoir des résultats aussi discordant les uns des autres. Mais cela m a permis d avoir une autre vision pour la réalisation d un travail tel que celui-ci.

24 6.1 Sites internet 6. Bibliographie 1) Corynébactéries. ( ) Techmicrobio, Microbiologie technique jean-noël Joffin. [Page Web]. Accès : emid=106&ad35eba78c3fd38e4ae385bf4ca6fcdb=847bf9494a e19428b4 964 (Consulté le ) 6) Les infections microbiennes. Icar. [Page Web]. Accès : infections%20 microbienne s.htm (Consulté le ) 8) La Diphtérie. (Mars 2011). Institut Pasteur. [Page Web]. Accès : (Consulté le ) 6.2 Livre 2) Nauciel, C. &Vildé J.-L. (2005). Bactériologie médicale, (2 e édition). Paris : Masson 3) Madigan, M. & Martinko, J. (Août 2007). Biologie des micro-organismes, (11 e édition). Pearson Education 7) Murray, P.-R. Jo Baron, E. Jorgensen. J.-H. Pfaller, M.-A. Yolken, R.-H. (2003). Manual of clinical microbiology, (8 e édition). ASM Press : Washington, D.C. 5) Denis, F. Ploy, M.-C. Martin, C. Bingen, E. & Quentin, R. (2007). Bactériologie Médicale, Techniques Usuelles, (2 e édition). Paris : Masson 6.3 Supports de cours 4) Riegel, P. (Avril 2007). Les corynébactéries d intérêt médical. [Présentation power point]. Genève : BioMérieux

25 6.4 Images Figure 1 : Elitech group. [Page Web]. Accès : (Consulté le ) Figure 2 : BD. [Page Web]. Accès : (Consulté le ) Figure 3 : Biomérieux. [Page Web]. Accès : RD&doc=SWT_CLN_PRD_G_PRD_CLN_4&pubparams.sform=9&lang=fr_ch (Consulté le ) 7. Lexique Maladie de croups : Toux rauque causée par la diphtérie membraneuse. Erythrasma : Commensal : Taxon : Prophage : Translocation : Saprophytes : Chromogène : Phylogénétique : Infection cutanée localisée dans les creux axillaire plis inter-fessier provoquant une marque délimitée par une couleur rougeâtre. Adjectif désignant un organisme qui vit aux dépens d un autre sans lui causer de dommage. En taxinomie, un taxon est une entité qui est censée regrouper tous les organismes vivants possédant en commun certains caractères diagnostiques bien définis. Forme non infectieuse d un phage sous laquelle celui-ci est perpétué à l interieur d une bactérie sans provoquer la mort de celle-ci. Mouvement du ribosome le long de l ARNm qui permet de Terme qualifiant des bactéries qui ne se développent pas dans l organisme vivant et qui se nourrissent de matières mortes. Participent à la dégradation des ces matières organiques. Substances incolores qui, dans certaines conditions, donnent des produits colorés La classification phylogénétique est un système de classification des êtres vivants qui a pour objectif d étudier des degrés de parentés entre les espèces et qui permet donc de comprendre leur histoire évolutive.

26 8. Remerciement Mes remerciements au Dr F. Piran, qui m a permis de réaliser cette étude au sein du laboratoire de bactériologie à Synlab-BBR. Je remercie également toute l équipe du laboratoire de bactériologie pour leur disponibilité et leurs précieux conseils.

27 9.1 Annexe I 9. Annexes Description des colonies 9.2 Annexe II Résultats obtenus par API Coryne

28 9.2 Annexe II Résultats obtenus par API Coryne

29 9.3 Annexe III Protocole du Phoenix Description et généralités: La première chose à savoir, c est qu il faut toujours laisser le Phoenix et son ordinateur allumés. Pour allumer l écran du Phoenix lorsqu il est en veille, appuyer sur n importe quelle touche du Phoenix ou du clavier caché. Si la liaison entre le Phoenix et l Epicenter est rompue, un symbole s affiche sur l écran du Phoenix. La procédure à suivre est alors la suivante : 1) Eteindre le Phoenix (bouton vert sur la droite de l appareil) 2) Vérifier que le câble réseau (câble gris avec l inscription "Cross-Over") soit bien branché 3) Fermer Epicenter 4) Ouvrir Epicenter 5) Rallumer le Phoenix Si le problème n est pas résolu, appeler le technicien (cf fiche technique, document réf.54463) Le Phoenix fait une lecture des galeries qui dure 7 minutes toutes les 20 minutes. Pendant cette opération une icône apparaît sur l écran du Phoenix avec un nombre qui signifie la durée restante en minutes. Certaines lectures sont plus primordiales que d autres, ce qui signifie que s il est en cours de lecture, certaines fois il nous autorisera à ouvrir la porte du Phoenix et d autres fois non. La température normale du Phoenix est comprise entre 34.5 et 35.5 C. Si l appareil est trop chaud, il sonne. Pour le rafraîchir, on peut placer un ventilateur sur la droite du Phoenix, en dessus de l écran, dirigé sur la grille d aération. Si sa température reste au-dessus de 35.5 C, les lectures ne seront pas bonnes. Le Phoenix peut supporter de perdre 2 lectures mais pas 3. Ce qui signifie qu au bout d une heure la lecture des galeries s arrêtera. En cas de panne de courant, l onduleur fournira suffisamment d énergie au Phoenix pour qu il puisse lire les galeries pendant 30 minutes, ce délai passé, le Phoenix pourra supporter de perdre 2 lectures mais pas 3. Ce qui signifie qu au bout d une heure et 10 minutes après le début de la panne, a lecture des galeries s arrêtera. Le Phoenix garde environ 3'000 galeries en mémoire, Epicenter lui est illimité.

30 Dans Epicenter on peut à tout moment savoir combien de galeries sont dans le Phoenix : 1) Cliquer sur la 4 ème icône depuis la gauche : 2) Cliquer sur le "OK" de la nouvelle fenêtre 3) Voici la signification des symboles (Sachant qu un emplacement est bloqué par le thermomètre interne.) Tout comme la couleur des LED dans le Phoenix nous indique : 1) Vert = libre 2) Orange = en cours 3) Rouge = défectueux, bloqué Les galeries : Nom NID NMIC/ID NMIC UNMIC/ID UNMIC PID PMIC/ID PMIC Utilisation Identification des bacilles Gram négatif et des Moraxella catarrhalis Identification et antibiogramme des bacilles Gram négatif Antibiogramme des bacilles Gram négatif Identification et antibiogramme des bacilles Gram négatif urinaires Antibiogramme des bacilles Gram négatif urinaires Identification des coccis et bacilles Gram positif Identification des coccis et bacilles Gram positif et antibiogramme des coccis Gram positif Antibiogramme des coccis Gram positif Pour détecter les ESBL, le Phoenix teste CAZ, CAZ+CLA, CTX, CTX+CLA et CPD. Sur le carton de chaque sorte de galeries sont notés les tests et les antibiotiques testés. Les galeries se conservent à température ambiante, la réserve de bouillon se conserve dans la chambre froide et les indicateurs se conservent au frigo. Chaque carton de galeries que l on reçoit, doit être introduit dans le Phoenix en suivant cette procédure :

31 1) Dans Epicenter, cliquer sur la 2 ème icône depuis la gauche 2) Faire un clic droit dans le grand carré blanc en bas à gauche de la fenêtre qui s ouvre 3) Sélectionner "Lots de galeries Phoenix" 4) Cliquer sur le codes-barres en haut à droite de la fenêtre 5) Scanner les 4 codes-barres de la boîte (dans n importe quel ordre) Si un carton a déjà été scanné, Epicenter averti et il faut effacer la ligne correspondante. Ensemencer les galeries : Ne pas partir de plaques de plus de 3 jours pour faire des Phoenix. Chaque jour il faut tester le standard à 0.5 McF (marge acceptée : 0.45 à 0.55), noter le résultat et signer la feuille" Contrôle journalier du standard du néphélomètre Phoenix " (cf. document réf ). 1) Ouvrir les galeries dont on a besoin et les poser sur un rack noir 2) Pour chaque galerie, sortir un bouillon ID 3) Pour les galeries avec un antibiogramme, sortir également un bouillon AST 4) Dans chaque bouillon AST, mettre une goutte d indicateur (on peut mettre la goutte en avance : 2 heures à la lumière et 8 heures à l abri de la lumière) 5) Faire un 0,5 McF dans le bouillon ID (si la quantité de matériel est insuffisante, on peut faire un McF 0,25, mais pour le dire au Phoenix il faut couvrir à l aide d un marqueur noir la cupule A17 de la galerie) (si on a dépassé le 0,5 McF, on peut diluer avec du NaCl à 0,9 %, mais il faudra ensuite éliminer l excédent de liquide pour éviter que les puits B17 et C17 qui contrôlent la fluorescence ne baignent dans le liquide) 6) Transférer 25 ul du bouillon ID au bouillon AST (50 ul si le McF est de 0,25), homogénéiser (attention à ne pas faire de mousse dans les bouillons, cela peut entraîner de faux résultats) Avec 0,5 McF, une identification dure environ 3 heures et un antibiogramme 8 heures. Avec 0,25 McF, une identification dure environ 15 heures et un antibiogramme 16 heures. 7) Verser entièrement le bouillon ID dans la partie gauche de la galerie 8) Verser entièrement le bouillon AST dans la partie droite de la galerie

32 !"#$%&'(")$%*''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''+$,-,./'#%'#.0/12%' 34%'-5/6%' ' ''''''''''''''''#6)%27$%'8944':',-$./'8948' ' (les galeries ainsi inoculées doivent être insérées dans le Phoenix dans les 30 minutes qui suivent) 9) Mettre un bouchon sur chaque trou 10) Coller l étiquette du patient par-dessus 11) Une fois la galerie inoculée, scanner son codes-barres dans le trou central du Phoenix (il reconnait le type de galerie) 12) Scanner ensuite notre étiquette patient 13) Noter "VA" après le n du patient s il s agit d un cas de varia, "HM" pour une hémoculture, "SE" pour selle et ne rien rajouter pour un cas d urine 14) Vérifier le n d isolat 15) Ajouter le nom du germe s il est connu 16) Cliquer sur la touche noire en dessous de la disquette 17) Appuyer sur la touche à la gauche de l écran pour insérer une galerie dans le Phoenix nix x 18) Lorsqu on peut ouvrir la porte, un symbole de cadenas ouvert s affiche 19) Insérer délicatement la galerie en mettant les bouchons contre nous Validation des résultats : (à faire avant d avoir ôté les galeries du Phoenix) Si le Phoenix a eu un problème d interprétation des galeries ou de non croissance, il affichera cher eraa er sur son écran un drapeau jaune. Pour faire disparaître cette alerte, appuyer sur la touche en-dessous du bonhomme qui se cache les yeux. 1) Se loguer dans Epicenter (= Cliquer sur la première icône en haut en partant de la gauche) 2) Cliquer sur la 4ème icône (une fenêtre s ouvre avec l état su système) 3) Cliquer sur OK (une fenêtre s ouvre avec le descriptif des places libres ou occupées dans le Phoenix) 4) Cliquer sur la deuxième ligne (en vert = nombre de galeries terminées mais encore présentes dans l appareil) Une fenêtre s ouvre avec la liste des échantillons ' H8'

33 5) Clic droit sur n importe quel ligne, puis "Sélectionner des lignes", puis "Tous" 6) Faire un clic droit et choisir "Afficher les détails de l isolat", la fenêtre de validation s ouvre 7) Examiner la tête de l ampoule en-haut de l écran : = tout va bien, pas de problème = il y a une ou plusieurs règles en attente de validation (cliquer dans la case devant "Visualiser les règles déclenchées par Expert" et valider) = il y a un conflit d isolat (2 isolats du même patient ont été introduits sous le même n ) (il faut alors sacrifier un des deux isolats en cliquant sur "Résoudre conflit" puis en cliquant sur celui que l on veut sauver) 8) Pour revenir aux résultats cliquer sur la case devant "Visualiser les détails de l isolat" 9) S il y a un "X" à la place du résultat d un antibiotique, on peut le changer en "S", "I" ou "R" en cliquant à côté du "X", un menu déroulant s ouvre alors pour qu on choisisse 10) Si on doit changer le nom du germe, cliquer sur le menu déroulant à côté de "Organisme" à gauche et choisir le bon germe. Une fois que c est fait, la plupart des antibiotiques disparaissent de l écran, il faut actualiser. Pour ce faire, cliquer sur la grosse flèche dirigée contre la droite puis sur la grosse flèche dirigée contre la gauche (= marche avant - marche arrière) 11) Pour valider : cocher la case qui se trouve devant "Final" puis, pour passer au dossier suivant en cliquant sur la grosse flèche dirigée contre la droite. 12) Une fois que tous les résultats ont étés validés, cliquer sur "Fermer" (on revient à la liste de tous les échantillons) 13) Il faut vérifier dans la partie gauche de l écran que tous les échantillons aient été validés (un échantillon non validé est représenté par une flèche bleue non entourée, tandis qu un échantillon validé est une flèche bleue entourée d un rond noir). 14) Impression : sélectionner toutes les lignes, faire un clic droit et choisir "Rapport labo échantillon". Puis sélectionner les identifications seules, faire un clic droit et choisir "Rapport clinique" Les résultats validés vont alors tous s imprimer automatiquement. 15) Sortir les galeries du Phoenix et les jeter.

34 Rechercher un résultat (après que la galerie ait été sortie du Phoenix) et l imprimer : 1) Cliquer sur la 2 ème icône en haut en partant de la gauche. 2) Sous "N d examen" tout en haut de la fenêtre, taper notre n de dossier (AAMMJJXXXX suivi d un espace et de VA ou SE ou HM) 3) Presser la touche "tabulateur" du clavier 4) Cliquer sur "Isolat" 5) Cliquer sur "Visua. données" 6) Sélectionner la ligne 7) Clic droit et choisir "Rapport labo échantillon" ou sur "Rapport clinique" pour une identification seule 8) Cliquer sur "Ap. avant impr. " puis sur "Imprimer"

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