PROTOCOLE Réf : TILING array Arabidopsis

Transcription

1 Page : 1 / 6 Amplification d ARN messagers (Kit AMBION MessageAmpII arna Amplification #1751) Le kit est composé de réactifs enzymatiques (-20 C) et d un kit de purification (température ambiante). Si les concentrations en ARN totaux sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse Utiliser l ARN contrôle du kit selon le nombre d échantillons et la méthode d extraction. A partir d ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN total (1µg) + eau qsp 5.5 µl Préparer le mix (prévoir 5% en plus) à température ambiante, mettre l enzyme à la dernière minute: T7-oligo-dT : 0.5 µl 10X First Strand Buffer*: 1µl *Tendance à cristalliser lors de la congélation : préchauffer à 42 C. dntp Mix : 2µl RNase Inhibitor : 0.5µl ArrayScript (RT) 0.5µl Ajouter 4.5µl de mix aux 5.5µl d ARN (vol final = 10µl), agiter légèrement et centrifuger brièvement. Incuber 2h dans un bain-marie sec à 42 C +/- 2 C. Centrifuger brièvement, puis mettre sur glace. Allumer le bain-marie humide à 16 C +/- 2 C dans la chambre froide. Préparer le mix (prévoir 5% en plus) en mettant les enzymes à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free 31.5µl 10X 2 nd Strand Buffer 5µl dntp Mix 2µl RNase H. 0.5µl DNA Polymérase 1µl Ajouter 40µl de ce mix aux 10µl précédents (vol final = 50 µl). Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16 C +/- 2 C. Centrifuger brièvement, puis mettre sur glace. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à 20 C en attendant la purification Purification des cdna (à température ambiante): Ajouter 50 µl d'eau RNase free aux échantillons afin d obtenir un V f = 100µl Allumer un bain-marie à sec et le régler à 55 C +/- 2 C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer Ajouter 250µl de cdna Binding Buffer dans les 100µl d [ADN + eau], mélanger par pipetage Déposer le tout sur une colonne cdna Centrifuger 1 minute à g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Déposer 500 µl de Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5 µl d'eau RNase-free à 55 C +/- 2 C Incuber 2 min à température ambiante et remettre l'eau à 55 C +/- 2 C Centrifuger 2 min à 10000g à température ambiante Répéter l'élution avec 5 µl d'eau RNase-free à 55 C +/- 2 C(éteindre le bain-marie). Possibilité de garder les échantillons après cette étape à 20 C.

2 Page : 2 / 6 Transcription in vitro pour la synthèse d arna (prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP (75mM) 2µl CTP (75mM) 2µl GTP (75mM) 2µl UTP (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le re-dissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Ajouter 12 µl de ce mix à l éluat contenant les cdna, environ 8 µl (vol final = 20 µl). Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37 C +/- 2 C. Centrifuger brièvement, puis mettre sur glace. Possibilité de conserver à 20 C avant la purification. Purification des arna : Ajouter 80 µl d eau RNase free aux échantillons afin d obtenir un V f = 100µl. Allumer un bain-marie et le régler à 55 C +/- 2 C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter 350µl arna Binding Buffer dans les 100µl précédents, mélanger par pipetage Ajouter 250µl EtOH 100%, mélanger par pipetage. Déposer l échantillon sur le centre d une colonne arna (placé dans un tube de 2 ml non fournit) Centrifuger 1 minute à g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Déposer 650µl de Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un nouveau tube arna collection tube (fournit) Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 55 C +/- 2 C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 55 C +/- 2 C Centrifuger 2 minutes à g à température ambiante Répéter l'élution avec 50 µl d'eau RNase-free à 55 C +/- 2 C (éteindre le bain-marie). Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification: Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au Ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, demander conseil au responsable d équipe. Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage. Précipitation : Compléter le volume de l éluât à 200µl avec de l H2O RNase free Ajouter 20 µl de Na Acetate 3M, ph 5,2 et Ajouter 4µl d Acrylamide Ajouter 500 µl d'ethanol 96,2%, agiter au vortex Précipiter 1 heure à -20 C +/- 2 C Centrifuger 30 minutes g à 4 C +/- 2 C Vider le surnageant et ajouter 1 ml d'éthanol à 70 %, agiter au vortex pour décoller le culot Centrifuger 10 minutes à g à 4 C +/- 2 C vider l éluât par retournemnet et pipeter le liquide résiduel (P20) après une centrifugation de 5 sec. Laisser le culot sécher à l'air libre (tube ouvert) sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.

3 Page : 3 / 6 Marquage au Cy3/ Cy5 par Rétro-transcription des arna Marquage au Cy3 et au Cy5 donc prévoir 2 tubes par échantillon minimum. Si un échantillon intervient dans plusieurs comparaisons, il faut le marquer plusieurs fois et pooler les marquages après dosage au nanodrop. La cyanine 3 est rose, la cyanine 5 est bleue. arna (5 µg) + H2O 8µl Préparer le mix suivant sur glace (prévoir 5% en plus): Random nonamers 1µg/µl 2µl RNase Out 40U/µl 0.5µl Ajouter 2.5 µl de ce mix aux 8µl d ARNa, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Dénaturer à 65 C +/- 2 C dans le bloc chauffant pendant 10 minutes. Pendant ce temps, préparer le pré-mix suivant (prévoir 5% en plus) et le garder sur glace : First strand buffer 5X 4µl DTT 0.1 M 2µl 10 mm dntp/2mm dctp 1µl Séparer le mix en 2 et ajouter dans chaque et par échantillon : Cy3 ou Cy5 dctp 1 nmol 1.5µl Superscript II RT 200 U/µl 1µl Refroidir l'échantillon sur glace et ajouter 9,5 µl du mix adéquat (Cy3 ou Cy5). Incuber 1 heure dans un bain-marie à sec à 42 C +/- 2 C à l abri de la lumière. Rajouter 1 µl de Superscript II RT 200 U/µl et incuber 1 heure à 42 C +/- 2 C à l abri de la lumière. Possibilité de conserver à 20 C avant la dénaturation et purification. Dénaturer l échantillon en ajoutant 2µl de NaOH 2.5 M (préparée extemporanément à partir de NaOH 10M conservé au réfrigérateur) et incuber dans le bloc chauffant à 37 C +/- 2 C pendant 15 minutes. Ajouter 10µl de MOPS 2M et refroidir sur glace. Purification des cibles (Kit Qiaquick QIAGEN Cat. N 28106) Mettre du TE à chauffer à 37 C +/- 2 C Ajouter 160µl de buffer PB à l'échantillon Agiter en pipetant et déposer sur une colonne Centrifuger la colonne 1 minute à g à température ambiante Jeter le surnageant et laver la colonne : Ajouter 750µl de buffer PE et centrifuger 1 minute à g à température ambiante Jeter le surnageant et relaver la colonne : Ajouter 300µl de buffer PE et centrifuger 1 minute à g à température ambiante Jeter le surnageant Re-centrifuger la colonne 30 secondes à g à température ambiante pour la sécher Transférer la colonne dans un tube de 1,5 ml Déposer 21µl de TE 7,5 à 37 C +/- 2 C sur la colonne et remettre le TE à 37 C +/- 2 C Incuber 1 min Centrifuger la colonne 1 minute à g à température ambiante Rajouter 21µl de TE 7,5 à 37 C +/- 2 C sur la colonne Incuber 1 min Centrifuger la colonne 1 minute à g à température ambiante

4 Page : 4 / 6 Quantification des cibles au Nanodrop Connexion sur l'ordinateur portable : USER : INRA, pas de mot de passe. Double-cliquer sur l'icone du nanodrop (ND-1000). Sélectionner votre login dans la liste et taper votre mot de passe. Cliquer sur la fonction désirée : microarray Lever le bras du nanodrop en le tenant par la partie métallique, JAMAIS PAR LE FIL NOIR et mettre la petite mousse de côté. Déposer 1,5µl d'eau sur le piédestal. Rabattre le bras doucement et ne pas appuyer une fois en position horizontale. Lancer l'auto-calibration comme demandé par le logiciel en cliquant sur OK. Une fois la procédure de calibration terminée, relever le bras et essuyer le piédestal ainsi que le bras avec un kim wipe. Déposer 1,5µl de TE sur le piédestal et cliquer sur "Blank" (ou appuyer sur la touche F3) Relever le bras et essuyer le piédestal et le bras. POUR CHAQUE ÉCHANTILLON (commencer par lire les échantillons marqués au Cy5): Entrer le nom de l'échantillon dans la fenêtre Déposer 1,5µl d'échantillon sur le piédestal et cliquer sur "Measure" (ou appuyer sur la touche F1) Dès la lecture terminée, relever le bras et essuyer le piédestal et le bras. APRÈS la dernière mesure, essuyer avec un kim wipe humidifié avec de l'eau. Reposer la petite mousse et remettre le bras en appui dessus SANS FORCER. Le tableau de résultats se trouve dans C:\nanodrop data\votre_login (raccourci sur le bureau) Se connecter sur ADT et copier le fichier dans le dossier voulu. Ouvrir le fichier Macros_et_fonctions3.xls (\\Netapp1\adt\CATMA\Macro), à partir de ce fichier ouvrir le fichier issu du nanodrop et lancer la macro «nanodrop». Copier le tableau obtenu dans le fichier suivit-projet_nom-du-projet.xls, onglet «résultats marquages». Préparer le tableau des pools et des précipitations. Interprétation des résultats Les volumes nécessaires pour 40 pmoles doivent être < 20µl. Les résultats des échantillons marqués au Cy5 sont globalement moins bons que ceux marqués au Cy3. Si un échantillon a été marqués plusieurs fois, car il intervient dans plusieurs comparaisons, il est important de pooler les marquages avant l étape suivante.

5 Page : 5 / 6 Précipitation des cibles Mélanger 40 pmoles des 2 échantillons de chaque comparaison (Cy3/Cy5) et ajouter dans cet ordre : H20 qsp 200µl 20µl NaAc 3M/pH 5.0 4µl d'acrylamide 5 µg/µl 500µl d éthanol 96,2% Mélanger au vortex Précipiter 1 heure à -20 Centrifuger à 14000g 30 minutes à 4 C Jeter le surnageant Ajouter 1 ml d éthanol 70 % Mélanger au vortex pour décoller le culot qui doit être violet. Centrifuger à g 10 minutes à 4 C, vider l éluat par retournement et pipeter le liquide résiduel (P20) après une centrifugation de 5 sec. Sécher le culot à l'air 15 minutes (tube ouvert), à l obscurité et resuspendre avec 5.6µl de «Sample Tracking Controls (STCs)» Il en existe 12 différents (numérotés : 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 18 et 20). Utilisé 1 différent pour chacun des 12 pools qui serviront à hybrider les 12 chambres de la lame. Laisser resupendre 15 minutes sur glace. Mélanger par vortex puis centrifuger en centrifugeuse de paillasse. Incuber 1 minute à 95 C puis centrifuger en centrifugeuse de paillasse. Hybridation Allumer la station d hybridation et le bain à 95 C. Préparer le tampon d hybridation 2X et le préchauffer à 42 C. Volumes pour 1 lame (3 chambres) : SSC 20x 25.8µl Formamide 25.8µl Utiliser de la formamide aliquotée (-20 C) Equilibrer à 42 C puis ajouter le SDS, il ne faut pas que ce dernier précipite SDS 10% 1µl Préparer le cocktail d hybridation. Volumes pour 1 lame (3 chambres): Tampon d hybridation 2X 40.7µl H2O DEPC 16.3µl Oligo d alignement 3.3µl Ajouter 5.6µl de ce cocktail aux 5.6µl précédents. Mélanger par vortex puis centrifuger en centrifugeuse de paillasse. Incuber au moins 5 minutes à 42 C. Le chargement des échantillons doivent être fait dans les 30 minutes suivant la sortie du mixer de son emballage pour éviter la formation de bulles durant le dépôt ou durant l hybridation. Ouvrer le PMAT (Precision Mixer Alignement Tool). Fixer le mixer sur la partie supérieure du PMAT à l aide des 2 clips d alignement. Code barre en bas et à l envers. Placer la lame sur la partie inférieure du PMAT code barre vers soi et vers le haut. Décoller l autocollant du mixer à l aide de la pince fournie. Fermer le PMAT.

6 Page : 6 / 6 Appliquer une pression au centre du mixer (via la fenêtre du PMAT) et sur toute la surface du PMAT. Ouvrir le PMAT et enlever la lame sur laquelle est collé le mixer. Placer la lame-mixer dans la station d hybridation à 42 C 5 minutes pour faciliter l adhésion. Sortir la lame-mixer de la station d hybridation. Exercer une pression modérée sur le mixer à l aider de la raclette (Mixer Brayer) afin d adhérer la colle sur toute la surface encollée et d éliminer les bulles. Remettre la lame-mixer dans la station d hybridation à 42 C. Centrifuger en centrifugeuse de paillasse les échantillons et la placer dans la station d hybridation. Déposer 18µl de chaque échantillon à l aide de la pipette Gilson Microman. Fermer les puits à l aide des petits autocollants. Allumer le panneau supérieur de la station d hybridation et sélectionner le mode B. Vérifier que le système reconnait les lames de chaque emplacement occupé. Laisser hybrider toute la nuit. Lavages Les lavages se font 1 lame à la fois. Préparer les tampons suivants dans les bacs en plastique : Tampon 1: DTT 1M 27µl Tampon I 10X Tampon 1 : DTT 1M 27µl Tampon I 10X Tampon 2: DTT 1M 27µl Tampon II 10X Tampon 3: DTT 1M 27µl Tampon III 10X Chauffer le tampon I à 42 C au micro-onde. PAS PLUS DE 42 C. Verser une partie du tampon dans la boite en plastique et y mettre une lame-mixer. Décoller délicatement le mixer. Agiter délicatement la lame quelques secondes avec la main. Placer la lame dans le portoir à lame puis mettre le tout dans le bac en plastique I avec le reste de tampon. Tampon 1 : Agiter vigoureusement secondes. Tampon 1 : Agiter vigoureusement 2 minutes. Tampon 2 : Agiter vigoureusement 1 minute. Tampon 3 : Agiter vigoureusement secondes. Très rapidement, sécher la lame avec la centrifugeuse de paillasse à lame durant 2 minutes. Stocker les lames à l obscurité jusqu au scanning (dans la même journée).