Tests biologiques KRL/RESEDA de mesure du potentiel global de défenses antiradicalaires :

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1 Tests biologiques KRL/RESEDA de mesure du potentiel global de défenses antiradicalaires : Outils d évaluation des effets écotoxicologiques directs et indirects des nanoparticules sur la santé Atelier thématique nano-environnement Paris - 19 novembre 2013 Dr Michel Prost PDG Laboratoires Spiral (Couternon, France) Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 1

2 Un Laboratoire d Analyses basé sur la Lune! Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 2

3 SOMMAIRE ole Test biologique KRL o Le Test biologique RESEDA o KRL / RESEDA et la logique du vivant o Stress oxydatif et nanoparticules Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 3

4 Introduction du Test Biologique KRL Il s agit Il s agit d un d un test test biologique biologique simple permettant simple de permettant mesurer la de mesurer la résistance globale chez chez l homme l homme vis-à-vis de vis-à-vis l agression des de radicaux l agression libres. des radicaux libres. Il existe, de nos jours, un intérêt croissant vis-à-vis de la biologie des radicaux libres. Ce n est pas seulement dû à leur rôle dans des phénomènes aigus tels que traumatisme ou ischémie, mais aussi à leur implication dans de nombreuses pathologies chroniques. Il est donc très important de pouvoir définir avec précision l état de défense des individus contre l agression des radicaux libres. Cet état, oxydatif (ou anti-oxydatif) peut aisément être apprécié d un point de vue dynamique par un test Test global global simple simple (brevet SPIRAL). : Brevet M.Prost/Spiral Les radicaux libres constituent des espèces chimiques activées, produites in vivo dans des conditions Les radicaux libres constituent des espèces chimiques activées, produites in vivo biologiques normales, mais des agressions diverses et notamment les rayonnements U.V., le stress, la pollution, dans des l alcoolisme, conditions le biologiques tabagisme, normales, etc. accroissent mais leur des formation, agressions conduisant diverses à et des états pathologiques. notamment En les effet, rayonnements bien que l organisme U.V., le soit stress, naturellement la pollution, protégé l alcoolisme, contre ces radicaux le libres par des tabagisme, systèmes de etc. détoxification accroissent enzymatiques leur formation, ou chimiques, conduisant ces systèmes à des peuvent états pathologiques être débordés, ce débordement étant lié directement aux facteurs génétiques, environnement, mode de vie, pathologie, bref à la capacité de défense de l individu. capacité de défense de l individu. Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 4

5 Ces molécules très réactives exercent leurs effets nuisibles Ces molécules très réactives exercent leurs effets nuisibles : * niveau cellulaire : peroxydation des acides gras polyinsaturés des membranes phospholipidiques d où formation au niveau de peroxydes cellulaire cytotoxiques entraînant phénomènes inflammatoires et mort cellulaire. De plus, les intermédiaires radicalaires oxygénés représentent de véritables activateurs de la carcinogenèse, des maladies cardiovasculaires, etc. au niveau extracellulaire * au niveau extracellulaire : dégradation des principaux constituants d où modification de la perméabilité et de la structure des tissus, notamment de la peau. Ces altérations contribuent à favoriser la sénescence cutanée et le vieillissement en général. Les facteurs de protection de radicaux libres sont de deux catégories Les facteurs de protection de radicaux libres sont de deux catégories : Enzymatiques * Enzymatiques : la superoxyde dismutase (SOD), catalase et le sélénium glutathion peroxydase * Chimiques : les scavengers qui bloquent les radicaux libres, les antioxydants qui limitent les effets des radicaux libres (vitamine C, vitamine A, vitamine E, vitamine K, Se, cystéine, méthionine, ubiquinone, ou coenzyme Q). Chimiques Une approche globale est pourtant nécessaire car même si l on multiplie le nombre de tests spécifiques, les résultats n apporteront jamais une réponse tenant compte de l ensemble des nombreuses variables mises en jeu simultanément chez l être vivant pour sa défense anti-radicalaire. Compte tenu de l ensemble des composés (vitamines, anti-oxydants, pro-oxydants ), des systèmes enzymatiques (glutathion peroxydase, catalase, superoxyde dismutase ) intervenant dans le système de défense anti-radicalaire, tout test spécifique ne peut apporter une appréciation globale de la capacité de résistance d un individu vis-à-vis de l agression des radicaux libres. Une approche globale est pourtant nécessaire car même si l on multiplie le nombre de tests spécifiques, les résultats n apporteront jamais une réponse tenant compte de l ensemble des nombreuses variables mises en jeu simultanément chez l être vivant pour sa défense anti-radicalaire. Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 5

6 Les sources cellulaires de radicaux libres Adapté de LJ Machlin et al., FASEB J, 1987 Xanthine oxydase Hémoglobine Reticulum endoplasmique Cytochrome P450 et b5 DNA Noyau Lysosome "Oxygen burst "/ NADPH oxydase Myeloperoxydase Oxydases Flavoprotéines Peroxysomes Mitochondrie Lipoxygénase Peroxydase Membranes lipidiques Peroxydation lipidique Métaux de transition Chaîne respiratoire Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 6

7 Les protections cellulaires contre les radicaux libres Polyphénols Ubiquinone Catalase -carotène Superoxyde dismutase (Cu/Zn) Glutathion peroxydases (Se) Reticulum endoplasmique Vitamine E Peroxysomes DNA Membranes lipidiques Noyau Lysosome Mitochondrie -carotène Vitamine C Vitamine E Vitamine C Glutathion réduit Thioredoxine Superoxyde dismutase (Mn) Vitamine E -carotène Polyphénols Adapté de LJ Machlin et al., FASEB J, 1987 Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 7

8 Production de radicaux libres - Chaîne respiratoire - NADPH oxydase (Macrophages) - Système de détoxification hépatique : Cytochrome P450 - Autres systè mes redox : Oxydases et peroxydases Défenses antiradicalaires Enzymatiques : Superoxyde dismutases, Catalase, Glutathion peroxydase Chimiques : Oligoéléments : Cu, Mn, Zn, Se Albumine, Acide urique, Bilirubine, Glutathion, Vitamines C, E, Caroténoïdes, Polyphénols Protéines de réparation Déséquilibre entre la production et la destruction des radicaux libres Stress Peroxydation des lipides. Oxydation des glucides et des protéines. Altération de l ADN. Pathologies Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 8

9 Hémolyse (%) Principe du test KRL Erythrocyte Cellule lysée Attaque radicalaire Flux lumineux % Hémolyse 100% Hémolyse % Hémolyse Temps (min) Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 9

10 Défenses antioxydantes : Un Système complexe RO Vit C GSSG NADPH 6P-gluconate Glutaredoxine GRed G6PDH ROH DHA GSH NADP G6P GSSG GPX Sélénium 2 H 2 O H 2 O 2 Cuivre Zinc Manganèse 2 O 2 - O 2 SOD 2 H + H 2 O 2 2 H 2 O +O 2 2 H 2 O 2 Catalase Fer RO -, ROO Vit E Vit C NADH Ascorbate Réductase ROH, ROOH Vit E Vit C NAD Ubiquinone Ubiquinone oxydée GSH Vit E radical Réductase Vit E GSSH Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 10

11 Principales Cibles des Radicaux Libres & Pathologies associées ORGANISME VISION SYSTEME CERVEAU, MUSCLES PEAU RESPIRATOIRE DIGESTIF & SYSTEME ARTICULATION & CARDIOVASCULAIRE Cancers, Cataracte, NERVEUX Arthrite Rides, mélanomes, rhumatoïde, maladies cirrhoses, rétinopathies, autoimmunes, dégénérescence diabètes, Stress inflammations brûlures, psychologique, cancers, eczéma, maladie Syndrome locales maculaire de Crohn colites, Asthme, emphysème, métabolique, (DMLA) Syndrome musculaires, de tendinites fibrose Down, pulmonaire Parkinson, Alzheimer, varices, scléroses syndrome multiples, de SLA détresse respiratoire de l adulte, athérosclérose, dommages de reperfusion, 11 Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon

12 Hémolyse (%) Altérations des défenses antiradicalaires érythrocytaires chez les rats diabétiques 100 Témoins Diabétiques Temps (min) Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 12

13 Hémolyse (%) Altérations des défenses antiradicalaires érythrocytaires chez des patients athéroscléreux 100 Témoin 80 Patient 1 Patient Patient Temps (min) Blache, D. and M. Prost. Free radical attack: Biological test for human resistance capability. In Proceedings of the IX College Park Colloquium on Chemical Evolution (29-31 October 1989): A Lunar-Based Chemical Analysis Laboratory (LBCAL). C. Ponnamperuma and C. W. Gehrke, editors. NASA, Washington D.C., pp Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 13

14 Temps de demi-hémolyse (min) Effet de l'exposition au soleil sur le potentiel de défense antiradicalaire Sans exposition N =26 Exposition occasionnelle N = 134 Exposition régulière N = 24 Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 14

15 Hémolyse (%) Temps de demi-hémolyse (min) Influence de l exercice physique sur le potentiel de défense antiradicalaire P < 0.01 Non-sportifs 130 Sportifs occasionnels Sportifs réguliers 100 N = 46 N = 66 N = Avant Bien que les sportifs réguliers semblent mieux protégés, une diminution du potentiel de défense antiradicalaire globale est mesurée après un effort physique prolongé Temps (min) Après Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 15

16 Temps de demi-hémolyse (min) Temps de demi-hémolyse (min) Influence de la consommation de fruits et de compléments vitaminiques 160 Pas de prise de 150 P < 0.01 compléments vitaminiques P < 0.01 P < 0.01 N = 165 N = 19 N = 53 N = 77 N = 54 Prise de compléments vitaminiques < 1 fruit/jour 1 fruit/jour > 1 fruit/jour 140 Non-fumeurs P < N = 115 N = 25 N = 44 Fumeurs occasionnels Fumeurs réguliers Effet du tabac sur le potentiel global de défense antiradicalaire Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 16

17 Temps de demi-hémolyse (min) Effet du stress psychologique sur le potentiel global de défense antiradicalaire Stress au travail Stress dans la vie Faible Modéré 130 Elevé P < P < 0.01 Faible Modéré Elevé N = 77 N = 81 N = 26 N = 92 N = 81 N = 11 Lesgards, JF., P. Durand, M. Lassare, P. Stocker, G. Lesgards, A. Lanteaume, M. Prost., and MP. Lehucher- Michel Assessment of lifestyle effects on the overall antioxidant capacity of healthy subjects. Environ. Health Perspect. 110: Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 17

18 Test KRL marqué CE Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 18

19 SOMMAIRE o Le Test biologique KRL ole Test biologique RESEDA o KRL / RESEDA et la logique du vivant o Stress oxydatif et nanoparticules Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 19

20 Absorbance Test KRL : Valeurs normales 1,3 Cinétique d'hémolyse 1,2 Latence 1,1 Hématies 1,0 0,9 0,8 Latence ST-SALCh ,7 0,6 Temps de demi-hémolyse Temps de demi-hémolyse Graph-HB 0,5 0,4 0,3 0,2 Sang total 0, Temps (min) Hématies zone "normale" : Sang total : zone "normale" Résistance du sang total Résultats Valeurs 'normales' Commentaires Temps de demi-lyse (min) : 95,7 84,0 101,0 T 1/2 normal Temps de latence (min) 76,6 70,0 87,0 Latence normale Vitesse max (mua/min) -30,4 Résistance des hématies Résultats Valeurs 'normales' Commentaires Temps de demi-lyse (min) : 69,5 66,0 75,0 T 1/2 normal Temps de latence (min) 55,3 52,0 61,0 Latence normale Vitesse max (mua/min) -37,4 Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 20

21 Evaluation du potentiel de défense antiradicalaire global d'un patient cancéreux avant et après une séance d'ict T1/2 (min) P < T 1/2 (min) MOY ± SEM (n = 12) PS 1 30/08 avt ICT T 1/2 = ± 0.33 PS 2 31/08 ap ICT T 1/2 = ± 0.30 PS 3 01/09 ap ICT T 1/2 = ± Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 21

22 Pourcentage de la résistance antiradicalaire du sang (%) Effet d un traitement antioxydant sur l efficacité antiradicalaire de cochettes au cours du stress de la mise-bas * * * * * # 20 Témoins Traités Témoins Traités Témoins Traités Jour 0 Jour 19 Jour 29 Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 22

23 Test RESEDA : Réserves de Défenses Antiradicalaires R2 R3 Groupements antiradicalaires en réserve Glucosidase (R1) Sulfatase (R2) Glucuronidase (R3) Tapez une équation ici. Libération de réserves antiradicalaires + + RESEDA : Réserves de Défenses Antiradicalaires - Brevet M. PROST - Octobre 2003 Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 23

24 Test RESEDA : Réserves de Défenses Antiradicalaires RESEDA KRL hématies R2 R3 R1 KRL sang total Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 24

25 SOMMAIRE o Le Test biologique KRL o Le Test biologique RESEDA okrl / RESEDA et la logique du vivant o Stress oxydatif et nanoparticules Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 25

26 Domaines d application du test KRL Les médicaments, leurs métabolites et les cosmétiques peuvent avoir une action antioxydante en aidant les organismes à se défendre contre l agression radicalaire ou au contraire pro-oxydante en favorisant la formation de radicaux libres. De nombreux nutriments au pouvoir antioxydant, reconnu sont apportés par l alimentation et les compléments alimentaires: Vit. A, C, E, oligo-éléments, sélénium, caroténoïdes, polyphénols, La connaissance de l efficacité réelle d aliments ou de compléments contre l agression des radicaux libres leur apporte une valeur ajoutée considérable. La mesure biologique du potentiel global de défense antiradicalaire chez l homme, l animal ou la plante peut être réalisée dans un cadre de prévention ou de suivi de traitement. Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 26

27 Stress Oxydatif Mécanismes de Défense Elevage et Stress Oxydatif Sélection des espèces plus résistantes au stress Optimisation des conditions d élevage, amélioration de l alimentation, complémentation Optimisation des conditions d abattage, diminution du stress Amélioration des propriétés organoleptiques de la viande Amélioration de la conservation des viandes et dérivés Agriculture et Stress Oxydatif Sélection des espèces plus résistantes au stress Diminution des traitements phytosanitaires Optimisation des traitements : Conservation des oligo-éléments, des vitamines, des polyphénols Amélioration de la conservation des fruits et légumes Amélioration de la conservation des produits à base de plante Forêt & plantes naturelles et Stress Oxydatif Sélection des espèces plus résistantes au stress Impact de la pollution (air, eaux, sols) Etude des défenses mises en œuvre par certaines plantes contre les agressions diverses dont le stress oxydatif Amélioration des défenses intrinsèques des plantes Faune et Stress Oxydatif Suivi de l état de santé des animaux d après leur potentiel global de défense antiradicalaire Comparaison inter-espèces Impact de la pollution des villes et des campagnes Sauvegarde des espèces en voie de disparition Elevage Bovin, avicole, porcin Agriculture céréales, épices Environnement Forêts Patrimoine Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 27

28 SOMMAIRE o Le Test biologique KRL o Le Test biologique RESEDA o KRL / RESEDA et la logique du vivant ostress oxydatif et nanoparticules Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 28

29 Problématique des nanoparticules en santé humaine et animale Nanoparticules Inhalation Ingestion Contact Poumons Système digestif peau, oreille, œil KRL Inflammation Stress oxydatif Génotoxicité RESEDA foie, rein, rate, système cardiovasculaire, cerveau Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 29

30 Nanoparticules et stress oxydatif Nanoparticules d oxyde métallique et nanotubes de carbone Activation des facteurs proinflammatoires?? Différents Mécanismes Production d espèces réactives de l oxygène (ERO) KRL Stress oxydatif RESEDA Oxydation des biomolécules, altération du matériel génétique, apoptose Effet dépendant de la taille (surface spécifique), de la nature chimique, de la forme cristalline des nanoparticules et de la présence d impuretés Les connaissances dans ce domaine sont encore très incomplètes Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 30

31 Effet de nanoparticules de TiO 2 sur le Test KRL RS : TiO 2 Rutile standard bâtonnet AC : TiO 2 Anatase cube Essais réalisés avec des nanoparticules confiées par le Pr Corinne Chanéac Chimie de la Matière Condensée de Paris UMR 7574 Site Collège de France Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 31

32 Effet de nanoparticules de TiO 2 sur le Test RESEDA Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 32

33 Capacité antioxydante de nanocristaux de quercétine (Test KRL) 204 nm 640 nm PCS : photon correlation spectroscopy E : 204 nm; A : 640 nm R. Chen, M. Prost, L. Greiner, R. H. Müller, C. M. Keck. Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 33

34 La capacité antioxydante de nanoparticules chargées en Coenzyme Q10 Hormesis effect < 100 nm ~225 nm usnlc : ultra-small lipid nanocarriers < 100 nm; NLC : nanostructured lipid carriers ~225 nm; NE : nanoemulsion Baisaeng, N., Prost, M., Durand, P., Müller, R.H., Keck, C.M. "In vitro evaluation of antioxidant potential of coenzyme Q 10 -loaded ultra-small lipid nanocarriers" Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 34

35 Nous vous remercions de votre attention 3 rue des Mardors F Couternon, France laraspiral@wanadoo.fr michelprost.spiral@wanadoo.fr Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 35

36 Système KRL Test Dr Michel Prost - Laboratoires Spiral Couternon 36