Séance de révision : validation de la préparation d un milieu de culture

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1 T BTK AT de biotechnologies Séance de révision : validation de la préparation d un milieu de culture L objectif de la séance est de préparer un milieu de culture en bouillon qui sera utilisé après autoclavage pour repiquer une souche de levures. Le respect des dates limites de péremption et des consignes de préparation des milieux de culture est indispensable en microbiologie pour permettre un bon développement des germes que l on ensemencera. Il est donc impératif de vérifier certains paramètres comme par exemple, la concentration de la source principale de carbone, pour valider un milieu. Suite à la préparation du milieu de culture, vous devrez réaliser différents contrôles : -un contrôle de la concentration en glucose du bouillon préparé, -un contrôle de fertilité des milieux par ensemencement. Liste des documents ressources : -Fiche fournisseur du milieu de culture, -Fiche fournisseur du kit enzymatique de dosage du glucose, -Fiche technique d usage du matériel (pipettes, balance ) Jour 1 I-Préparation du milieu de culture On préparera un bouillon Sabouraud, qui sera réutilisé en J2 pour étudier des levures. A l aide de la fiche fournisseur des milieux de culture, calculer la pesée de poudre à prélever pour préparer 200 ml de bouillon Sabouraud Remarque : les préparations seront effectuées par groupe de 4 élèves. - Préparer 200 ml de bouillon Sabouraud : procéder à la pesée de poudre de bouillon Sabouraud, puis dissoudre dans un bécher à l aide d eau distillée stérile. - Prélever 8 x 10 ml que vous introduirez dans 8 tubes en verre avec bouchon à vis (2 tubes par élève du groupe). Les tubes seront immédiatement autoclavés pour être récupérés en fin de séance. ATTENTION : ne pas jeter l excédent qui sera utilisé pour le contrôle de la concentration en glucose. Remarque : annoter vos tubes et flacons de façon explicite et nette avec un marqueur indélébile. Documents de travail Lycée SENGHOR EVREUX - 1

2 II-Repiquage d une souche de levures On dispose d une souche de Saccharomyces cerevisiae isolée sur gélose Sabouraud inclinée. A partir d une colonie, préparer une suspension dans 1 ml d eau physiologique stérile, puis : -vérifier la pureté de la suspension par ré-isolement sur gélose Sabouraud. -ensemencer un des deux bouillons Sabouraud préalablement préparés et autoclavés : pour cela introduire stérilement une anse de la suspension dans le bouillon et homogénéiser (le second tube non ensemencé sera conservé à température ambiante jusqu en J2). Incuber les milieux à 30 C 24 à 48H. III-Contrôle de la concentration en glucose du bouillon Sabouraud 1-Préparation de la gamme d étalonnage A partir d une solution mère de glucose fournie à 4 g/l, préparer en tube à hémolyse des solutions étalons filles à 1 g/l, 2 g/l et 3 g/l de glucose (volume total à préparer = 2 ml). Calculer les volumes de prise d essai de solution mère et proposer le protocole pour préparer les solutions filles. Dans une série de 5 microcuves spectrophotométriques, réaliser la gamme d étalonnage selon le mode opératoire suivant : Microcuves Solution glucose à 1 g/l 10 µl Solution glucose à 2 g/l 10 µl Solution glucose à 3 g/l 10 µl Solution glucose à 4 g/l 10 µl Eau distillée 10 µl Solution réactionnelle 1 ml / cuve -Recouvrir les microcuves de parafilm. Homogénéiser par retournement. -Laisser évoluer à température ambiante pendant 20 min (coloration stable 1h) -Lire l'absorbance à 505 nm contre le blanc. 2-Dosage du glucose dans le bouillon Sabouraud 2.1-Réflexion préliminaire autour du protocole -D après la fiche technique du fournisseur, quelle est la concentration prévisible en glucose du bouillon Sabouraud? -Quelle est la limite de détection maximale en glucose que nous permet notre gamme d étalonnage? -Que peut-on proposer pour réaliser le dosage du bouillon dans de bonnes conditions? Documents de travail Lycée SENGHOR EVREUX - 2

3 2.2-Préparation du bouillon Sabouraud pour permettre le dosage -Préparer 20 ml de bouillon Sabouraud dilué selon vos propositions précédentes. -Réaliser le dosage spectrophotométrique (2 essais) du bouillon Sabouraud dilué dans les mêmes conditions que la gamme d étalonnage. 3-Exploitation Questions de compréhension du protocole : Le dosage du glucose met en jeu deux enzymes : la glucose oxydase et la peroxydase. -Indiquer le nom et la formule chimique développée des substrats de la glucose oxydase. -Indiquer le nom des produits de la réaction à la peroxydase mise en jeu dans ce kit. -Expliquer l intérêt de produire à partir de glucose de la quinonéimine? -Dans ce dosage une des réactions est dite «réaction principale», l autre «réaction indicatrice». Expliquer ces expressions et identifier parmi les deux réactions mises en jeu, laquelle est principale, laquelle est indicatrice. Exploitation des résultats expérimentaux - Tracer sur papier millimétré la courbe d étalonnage A à 505 nm = f (ρ Glucose). - Que pensez-vous de la qualité de l alignement de votre gamme d étalonnage? Quelles sont les sources d erreurs techniques possibles qui permettent d expliquer ces erreurs d alignement? - Pour chacun des essais, déterminer la concentration massique en glucose dans le bouillon dilué puis calculer la concentration massique en glucose dans le bouillon non dilué. - Comparer la concentration massique en glucose du bouillon obtenue expérimentalement et le résultat théorique attendu. Donnée : Sr (concentration en glucose du bouillon pur) = 0,2 g/l Jour 2 I-Repiquage de la levure (suite) A partir de la gélose et du bouillon Sabouraud ensemencés, réaliser un examen macroscopique. Conclure sur la pureté de votre suspension en J1 et sur la fertilité du Bouillon Sabouraud préparé. Documents de travail Lycée SENGHOR EVREUX - 3

4 II-Numération des levures cultivées en bouillon 1-Mode opératoire A partir de la culture en bouillon Sabouraud, préalablement homogénéisée : -Réaliser une mesure d absorbance à 600 nm, contre un blanc adapté (si l absorbance mesurée dépasse 0,6 recommencer après dilution de la culture). -Réaliser une numération sur lame de Malassez : Au préalable, à l aide des données 1 et 2, prévoir la dilution éventuelle de la culture pour obtenir entre 10 et 100 levures par rectangle de la chambre. A l aide de la culture ou de sa dilution, faire la mise en chambre, laisser sédimenter au moins 5 min, puis réaliser le comptage sur 10 rectangles dans la chambre. 2-Exploitation -Après numération sur lame de Malassez, calculer la concentration en levures dans le bouillon (en levures / ml). -En intégrant les résultats de la mesure d absorbance et de la numération sur lame de Malassez, exprimer la relation entre absorbance et concentration en levures : 0,1 d absorbance en bouillon Sabouraud <-> xxxx levures / ml -Comparer les résultats expérimentaux et les résultats théoriques extraits de la fiche technique du Mac Farland. Données : 1- La lame de Malassez comporte 100 rectangles de comptage. Le volume total de la chambre de comptage correspond à 1 µl. 2- Extrait de la fiche technique du Mac Farland Etalon Mac Farland Concentration bactérienne x 10 6 /ml (1) Densité optique théorique à 550 nm 0, , , , ,75 (1) La concentration bactérienne varie avec la taille des micro-organismes. Les chiffres indiqués représentent une moyenne valable pour les bactéries. Pour les levures, de taille plus grosse, il faut diviser ces concentrations par 30 environ. Documents de travail Lycée SENGHOR EVREUX - 4

5 III-Contrôle de la qualité du pipetage avec une P1000 Afin de vérifier que les erreurs d alignement de la droite d étalonnage tracée en J1 ne sont pas liées aux pipettes automatiques, on vérifiera par exemple une P1000. L'objectif est de vérifier que le volume délivré correspond bien au volume affiché sur la pipette. On évaluera deux qualités la P1000 : - la justesse : aptitude à délivrer un volume le plus proche possible du volume réglé exprimée par la moyenne d'une série de mesures. - la fidélité : aptitude à délivrer des volumes les plus proches possibles les uns des autres exprimée par l'écart-type de la série de mesures. Remarque : vous réaliserez le contrôle de la P1000 que vous avez utilisé pour concevoir votre gamme d étalonnage. 1-Mode opératoire Le contrôle sera réalisé par méthode gravimétrique : il consiste à peser, à l aide d une balance de précision, des échantillons d'eau prélevés à la pipette. On pèse successivement dans un bécher de 100 à 200 ml, des volumes d'eau distillée prélevés à la pipette. Tous les ajouts se font dans le même récipient, sans le vider, en annulant la valeur de la pesée précédente par le tarage de la balance avant chaque nouvelle mesure. La P1000 ayant été utilisée précédemment pour prélever 1 ml de solution réactionnelle dans la gamme d étalonnage, on réglera la pipette sur ce volume maximal pour faire le contrôle. On réalisera 5 pesées successives en utilisant le même cône après une mise en milieu préalable. 2-Exploitation A partir des résultats des 5 pesées, calculer la moyenne (en µl) et l écart type* (en µl). Conclure sur la qualité de la pipette à l aide de l extrait ci-contre de la fiche constructeur qui recense les erreurs systématiques (systematic error) et les erreurs aléatoires (random error) maximales tolérées. Au regard des résultats, que penser des erreurs techniques expliquant les résultats de l alignement de la courbe d étalonnage? * Formule de l écart-type : S ou σ (utiliser n-1 au lieu de n au dénominateur lorsque le nombre d échantillons testés est inférieur à 30). Documents de travail Lycée SENGHOR EVREUX - 5

6 Extrait de la fiche de contrôle des pipettes Gilson Documents de travail Lycée SENGHOR EVREUX - 6