THEME : LE PORTAGE NASAL DE STAPHYLOCOCUS AUREUS EN MILIEU CHIRURGICAL A L HOPITAL DU POINT G.

Transcription

1 MINISTERE DE L EDUCATION NATIONALE REPUBLIQUE DU MALI Un Peuple Un But Une Foi UNIVERSITE DE BAMAKO FACULTE DE MEDECINE DE PHARMACIE ET D ODONTO STOMATHOLOGIE THEME : LE PORTAGE NASAL DE STAPHYLOCOCUS AUREUS EN MILIEU CHIRURGICAL A L HOPITAL DU POINT G. Présentée et soutenue par Monsieur Amadou B. DIALLO Devant le Jury de la FACULTE DE MEDECINE DE PHARMACIE ET D ODONTO STOMATHOLOGIE Jury : Président de Jury : Pr. Amadou DIALLO Membre de Jury : Dr. Saïdou MAIGA Membre de Jury : Dr. KEITA Aminata MAIGA Directeur de Thèse : Pr. Ibrahim I. Maiga

2 1 INTRODUCTION Le réservoir naturel de Staphylococcus aureus est l homme. Très rapidement après la naissance, Staphylococcus aureus colonise la peau, le tube digestif et la région périnatale des nouveaux-nés. Un pourcentage élevé de la population reste porteur en permanence ou par intermittence en particulier dans les fosses nasales. A partir des sites de portage et de façon intermittente, il colonise les zones humides (aisselles) ou peut être isolé des mains (47). S. aureus peut également être isolé de la peau et des muqueuses des animaux. Eliminée dans le milieu extérieur, cette bactérie peut survivre longuement dans l environnement (2). S. aureus est très fréquent chez l homme à l état pathogène. Il peut provoquer des suppurations, septicémies, toxi-infections et chocs toxiques (22). Il joue un rôle majeur dans les infections nosocomiales. On constate une multirésistance des souches hospitalières, aux antibiotiques (1). Le portage nasal de S. aureus peut provoquer des infections postopératoires. S. aureus est la première cause des infections du site opératoire (70 %) dans le service de chirurgie viscérale de l hôpital national de Niamey en 2004 (35).C est la deuxième cause de septicémie à l hôpital du Point "G" à Bamako (27). La Mupirocine (Bactroban ) est un antibiotique utilisé sous forme de pommade nasale pour éradiquer le portage nasal à S. aureus essentiellement en milieu hospitalier. Une large étude contrôlée des chercheurs des universités de l Iowa et du Johns Hopkins Institut à Baltimore aux Etats-Unis montre que la mupirocine réduit significativement le nombre d infections nosocomiales à S. aureus parmi les porteurs sains de la bactérie, mais pas le nombre global d infections à S. aureus au site opéré [5].

3 Les objectifs de notre étude étaient : Objectif général Etudier la prévalence du portage nasal de S. aureus chez les malades admis dans les services de chirurgie de l hôpital du Point G Objectifs spécifiques - Etudier la sensibilité des souches isolées aux antibiotiques ; - Déterminer la prévalence des souches résistantes à la méticilline ; - Identifier les séquences types des souches isolées.

4 2. GENERALITES 2.1 Staphylococcus aureus (4, 11, 20, 22) Historique : PASTEUR a observé, en 1879 dans des pus de furoncle et d ostéomyélites «un organisme unique, formé de petits points sphériques, réunis par couple, rarement par quatre, mais très fréquemment associés en petit amas». Les Staphylocoques, qu il venait de décrire sont de cocci à Gram positif très répandus dans la nature (sol, eau, air) et responsables d un grand nombre d infections chez l homme et l animal. Ces bactéries survivent et prolifèrent du fait de leur particulière résistance aux conditions hostiles de l environnement, telles que la chaleur, la sécheresse ou la salinité de l eau. Si l on ajoute à cela la facilité avec laquelle les staphylocoques deviennent résistants aux agents antibactériens, l on percevra la variété et la complexité des propriétés de ce genre bactérien Habitat : S. aureus est un germe ubiquitaire. Il vit à l état commensal sur les muqueuses de l homme et des animaux. Le site de colonisation préférentielle de S. aureus chez l homme est la muqueuse nasale. En effet 30 % des adultes hébergent S. aureus de façon permanente, 50 % de façon intermittente et 20 % ne sont jamais porteurs. A partir des sites de portage, S. aureus colonise les territoires cutanés en particulier, les zones humides ( aisselles, périnée ) et les mains. La transmission manu portée est le mode essentiel de transmission. Le portage intestinal est assez fréquent.

5 2.1.3 Caractères bactériologiques : Morphologie : S. aureus se présente sous forme de cocci en petits amas, de diplocoques ou de très courtes chaînettes, mesurant 0,8 à 1 μm, gardant le Gram. Sur les cultures en milieu solide il se dispose en "grappes de raisin", alors qu en milieu liquide, il est souvent isolé, en diplocoques. Il est immobile, non sporulé et ne possède pas de capsule visible au microscope optique sauf de très rares souches ; d autres souches formant des colonies mucoïdes, sont entourées d une pseudocapsule Caractères culturaux : S. aureus est aérobie anaérobie facultatif et se développe facilement sur les milieux usuels. La température optimale de croissance est de 37 C (10 à 45 C), le ph optimal est 7,5 mais de grandes variations sont tolérées. En bouillon ordinaire, la culture est rapide ; un trouble homogène puis un dépôt sont observés. Sur gélose ordinaire, les colonies sont lisses, rondes, bombées et leur diamètre est de un millimètre. La plupart des souches élaborent un pigment jaune doré ou jaune-citrin non diffusible dans le milieu. Le rôle physiologique de ce pigment n est pas connu Caractères métaboliques et physiologiques : S. aureus possède une catalase mais pas d oxydase. Il est actif sur les hydrates de carbone : le glucose est utilisé en anaérobiose et en aérobiose ainsi que le mannitol. D autres caractères peuvent être recherchés : indole, acétoïne, réduction du tellurite de potassium, production d ammoniaque à partir de l arginine.

6 Toxines et enzymes diffusibles de S. aureus Toxines staphylococciques : α-toxine ou α-hémolysine C est une protéine de masse moléculaire 33 kda. Synthétisée par 80 à 90 % des souches, elle est inactivée à 60 C et réactivée à 100 C ( effet Arrhénius ). C est une hémolysine active surtout sur les hématies de lapin. Elle est dermonécrotique et létale chez le lapin. Elle provoque la contraction du muscle lisse, la libération d histamine et des troubles circulatoires. Elle entraîne la production d antitoxine. Elle peut être transformée en anatoxine β-toxine ou β-hémolysine Elle est plus souvent fabriquée par les souches animales (94 %) que par les souches humaines (54 %). C est une phospholipase de type C, active sur la sphingomyéline d où son nom de sphingomyélinase. Sa masse moléculaire (MM) est de kda. Elle est active sur les hématies de mouton très riche en sphingomyéline γ toxine ou γ-hémolysine : C est une toxine produite par 50 à 60 % des souches. Elle est formée de deux constituants : I (29 kda) et II (26 kda). Elle lyse les érythrocytes de lapin, de mouton et d homme. Elle est antigénique chez l homme δ-toxine ou δ-hémolysine : C est une protéine de masse moléculaire 103 kda. Elle est thermostable, hydrophobe et faiblement antigénique. Elle lyse les hématies de lapin, de cheval, d homme, de cobaye, les macrophages et les granulocytes.

7 Leucocidine de Panton et Valentine : Elle comporte un composant F (32 kda) et un composant S (38 kda) agissant en synergie. L action se fait sur la membrane cellulaire. Le composant F se combine avec la chaîne d acide gras des phospholipides, le composant S se fixe sur ce complexe et se combine avec les inositoltriphosphates. La leucocidine détruit les granulocytes, les macrophages et les basophiles d homme et de lapin. Elle est antigénique Exfoliatine ou épidermolysine : Il existe deux exfoliatines, A et B. La toxine de type A a une masse moléculaire de 26,9 kda et est d origine chromosomique. La toxine de type B, thermolabile et d origine plasmidique, a une MM de 27,3 kda. L exfoliatine est responsable des différentes formes de staphylococcies cutanées bulleuses. La pathogénie des lésions cliniques dépend de la localisation de la souche et de l état immunitaire du patient. La proportion des sujets possédant des anticorps est de 50 % à l âge de 10 ans et de 80 % à l âge adulte. Ces anticorps sont transmis passivement au nouveau-né Entérotoxines staphylococciques : Elles sont au nombre de 7 : A, B, C1, C2, C3, D et E. les souches entérotoxinogènes de S. aureus provoquent des intoxications alimentaires et l entérocolite aiguë pseudo-membraneuse. Les entérotoxines sont des holoprotéines formées d une seule chaîne d acides aminés. Elles sont d origine chromosomique Toxine du syndrome de choc toxique staphylococcique : Cette exotoxine protéique, appelée toxine du syndrome de choc toxique staphylococcique (TSST-1), est produite par 95 % des souches isolées du vagin. D origine chromosomique, la TSST-1 a une MM de 2 kda. Elle induit la synthèse d anticorps dont la fréquence dans la population augmente avec l âge. La TSST-1 est un mitogène non spécifique des

8 lymphocytes T humains et animaux, qui induit la synthèse d interleukine-1 ; elle est pyrogène et létale (DL50 = 60 μg chez le lapin) Enzymes staphylococciques diffusibles Coagulase libre C est une protéine de masse moléculaire variable selon les souches (31 à 58 kda). D origine chromosomique elle est capable de coaguler le plasma humain ou de lapin citraté, hépariné ou axalaté. Elle induit la formation d anticorps capables d empêcher son action biologique. Elle coagule le plasma autour de la bactérie et la protège de la phagocytose. Elle est à l origine des thrombophlébites suppurées Coagulase liée ou clumping factor C est une protéine de moléculaire 21 kda. C est un constituant de la paroi. Elle est diffusible dans le milieu après autolyse ; elle réagit directement avec le fibrinogène ou des monomères de fibrine. Cette réaction entraîne l agglutination de S. aureus, le clumping factor se fixant sur l extrémité carboxy-terminale de la chaîne du fibrinogène. Le clumping factor est présent chez presque toutes les souches d origine humaine, il est moins fréquent chez les souches d origine animale Fibrinolysine ou staphylokinase Elle active le plasminogène en plasmine et contribue à la dislocation du caillot et à la formation des micro-embols bactériens responsables des métastases septiques. Elle est soit d origine chromosomique soit d origine phagique Nucléase C est une désoxyribonucléase qui a une activité ribonucléasique. La production de désoxyribonucléase thermolabile est très répandue dans les

9 différentes espèces du genre Staphylococcus. Une enzyme thermostable (thermonucléase) est produite par toutes les souches de S. aureus et 5 % des souches de staphylocoques à coagulase négative appartenant aux espèse S. hyicus, S. intermedius, S. lugdunensis et S. schleiferi Hyaluronidase C est une enzyme thermolabile de MM 80 kda. Elle hydrolyse l acide hyaluronique, ce qui favorise la diffusion de S. aureus dans le tissu conjonctif Lipases L attaque des graisses par S. aureus est due à au moins 3 types d enzymes : lipases, estérases, phosphatidases Phosphatases S. aureus élabore des phosphatases alcaline et acide dont le rôle physiologique n est pas connu Protéases S. aureus synthétise 3 types de protéases : sérine-protéase, métalloprotéase et thiolprotéase Lysozyme S. aureus produit un lysozyme qui est en fait une endo-β-nacétylglucosaminidase. Elle lyse la paroi des bactéries (Micrococcus lysodeikticus) Antigènes somatiques

10 Peptidoglycane Le peptidoglycane est peu immunogène. Il est mitogène pour les lymphocytes B et peut induire des cellules immunosuppressives. Il est responsable d effet toxiques, certains ressemblant à ceux de l endotoxine : effet pyrogène, activation du complément et du chimiotactisme, thrombocytopénie, dermonécrose Protéine A C est une holoprotéine de MM 42 kda, caractéristique de S. aureus. Elle est élaborée par plus de 90 % des souches d origine humaine. La protéine A se fixe sur le fragment Fc des immunoglobulines G des sous-classes G1, G2, et G4. Elle active le complément par la voie classique et déclenche la réaction inflammatoire. Elle induit l hypersensibilité immédiate et retardée. Elle est mitogène et cytotoxique. Sa liaison avec l IgG favorise la phagocytose Acides teichoïques Ce sont des polymères de ribitol unis par des liaisons phosphodiesters. Leurs effets biologiques sont encore peu connus. Ils paraissent peu toxiques mais entraînent une hypersensibilité retardée. Les malades élaborent des anticorps anti-acides téichoïques Antigènes de surface S. aureus peut posséder une capsule ou une externe polysaccharidique dénommée «slime», support de propriété d adhésion Pouvoir pathogène naturel S. aureus est fréquemment responsable d infections chez l homme, où les constituants de la paroi, les toxines protéines et les enzymes produits par les souches combinent leur action comme facteurs de virulence.

11 Les infections suppuratives S. aureus est le type même de la bactérie pyogène. Les infections superficielles cutanées, sous-cutanées et muqueuses comprennent les furoncles, anthrax, panaris, impétigos, abcès, cellulites ou lymphangites. Toutes les atteintes cutanées (plaies traumatiques ou chirurgicales, brûlures, ulcères) sont des facteurs favorisants ces infections, de même que les facteurs d atteinte générale comme le diabète, les thérapies immunosuppressives, et les déficits de l immunité cellulaire. S. aureus est également responsable d infection de la sphère ORL (Sinusites, otites, angines, mastoïdites). Les infections profondes surviennent soit par extension directe d une infection superficielle, soit par diffusion hématogène de bactérie à l origine de septicémies. Ainsi, S. aureus est la principale cause d ostéomyélites, mais il peut également être responsable de méningites, d endocardites infectieuses, d arthrites, d abcès pulmonaire ou d abcès du cerveau. La staphylococcie maligne de la face est un syndrome secondaire à un furoncle de l aile du nez Les infections associées à la diffusion de toxines spécifiques. S. aureus est aussi responsable d intoxications alimentaires causées par l ingestion d entérotoxines thermostables préalablement fabriquées dans un aliment contaminé et mal conservé. L incubation est courte de 1 à 6 heures, en général 3 heures après le repas. Le malade apyrétique présente d abord des vomissements, puis des douleurs abdominales, de la diarrhée, parfois un collapsus cardio-vasculaire. Les exfoliatines sont responsables du syndrome de la peau ébouillantée chez les enfants, de la maladie de Ritter chez les nouveaux-nés et de l impétigo bulleux. Le syndrome de choc toxique staphylococcique est secondaire à la diffiusion de la toxine du syndrome de choc toxique (TSST-1) ou

12 d entérotoxines (entérotoxine B). Il se caractérise par une fièvre avec hypotension artérielle, une érythrodermie une desquamation diffuse, parfois limitée aux paumes et voûtes plantaires et de façon variable par l existence de diarrhées, céphalées, frissons et conjonctivites. Ce syndrome a été observé sous forme épidermique chez des femmes en période menstruelle utilisant des tampons ayant un fort pouvoir d absorption. D autres sites colonisés par des souches de S. aureus productrices de cette toxine peuvent être à l origine de chocs survenant chez les hommes et les femmes. Chez les malades atteints de SIDA, le tableau clinique peut être sensiblement différent avec prédominance de lésions érythémateuses extensives chroniques Diagnostic bactériologique des infections à Staphylococcus aureus Prélèvement Le prélèvement doit s effectuer de préférence sur deux écouvillons pour permettre l examen direct et la culture. L inspection de la zone à prélever est indispensable, elle conduit à repérer les traces purulentes qui devront être échantillonnées. En leur absence, le prélèvement devra être effectué au fond de la plaie ou aux endroits où celle-ci est peu accessible à des contaminations ; il faut au besoin écarter les berges. Une désinfection locale avec un antiseptique efficace est recommandée pour éviter une contamination Diagnostic Morphologie des colonies Après 24 h d incubation à 35 C, les colonies de S. aureus ont une taille de 2 à 3 mm de diamètre pouvant atteindre 7 mm si l incubation est prolongée de 48 à 72 h. Elles sont opaques, convexes et d aspect crémeux. Elles peuvent être blanches ou avoir toutes les nuances d une pigmentation jaune,

13 surtout si l incubation est prolongée (48 heures) et le milieu gélosé laissé ensuite à température ambiante 3 jours. Certains staphylocoques, cultivés sur milieu gélosé au sang de mouton, sont hémolytiques et en particulier S. aureus qui produit une hémolysine-α dans 85 à 95 % des cas Acidification du mannitol. La majorité (94 %) des souches de S. aureus contrairement à la plupart des autres staphylocoques fermentent le mannitol avec production d acide. Cette propriété est exploitée dans le milieu de Chapman contenant 7,5 % de NaCl, rendant le milieu sélectif pour les bactéries du genre Staphylococcus, et du mannitol qui est acidifié par S. aureus Recherche de la coagulase libre. C est le test principal d identification de S. aureus. Le test en tube consiste à incuber pendant 3 à 4 heures à 35 C, 0,5 ml d un inoculum de 10 8 UFC/ml en bouillon cœur-cercelle de 18 h mélangés avec 0,5 ml de plasma de lapin. Un anticoagulant est préalablement ajouté dans le plasma, soit du citrate (biomérieux, réf. 5 S 181), soit de l EDTA (Difco, réf ). L apparition d un caillot est observée après une incubation de 1 à 4 h. Des réactions faussement positives peuvent être dues à l action de protéases ou pseudo-coagulases qui sont généralement inhibées par l EDTA. Si le test de coagulase permet l identification d environ 99 % des souches de S. aureus, certaines ne produisent pas de coagulase libre et l identification de l espèce est dans ce cas réalisé par d autres tests Recherche du facteur d affinité pour le fibrinogène ou coagulase liée ou clumping factor Ce récepteur, présent à la surface de S. aureus, permet de constituer un agrégat bactérien en présence de fibrinogène en solution ou sur des particules inertes. Il est recherché par agglutination à l aide de globules rouges sensibilisés avec du fibrinogène.

14 Recherche de la protéine A La technique de détection consiste à rechercher l agglutination sur lame de S. aureus en présence d une goutte d hématies de mouton sensibilisées par du sérum de lapin anti-hématies de mouton ou de particules de latex recouvertes d IgG. La protéine A est détectée chez plus de 90 % des souches de S. aureus Recherche de la nucléase thermostable (DNase) La nucléase thermostable (DNase) est une 5 phospho-diéstérase active sur les ADN et les ARN. Après avoir chauffé à 100 C pendant 15 min une culture de 18 h en bouillon cœur cervelle (ou de 3-4 h si la culture est réalisée en bain d eau (agité) le surnageant est déposé dans un puits réalisé dans un milieu gélosé contenant de l ADN et du bleu de toluidine (ADN toluidine, Sanofi Diagnostic Pasteur, réf 53555). La nucléase est détectée par l apparition d une zone rose de métachromasie autour du puits. Elle est produite par 95 % des souches de S. aureus. La nucléase de S. aureus a une spécificité antigénique différente de celle des autres espèces de staphylocoque et peut être inhibée si un anti-sérum spécifique est ajouté dans le milieu de détection Recherche simultanée de plusieurs caractères de S. aureus Pour pallier la déficience possible des tests comme le facteur d affinité pour le fibrinogène ou de la protéine A, certains kits commercialisés combinent plusieurs réactions (Tableau I). La sensibilité des souches de S. aureus résistantes à la méticilline est de 95 % par le réactif Pastorex Staph Plus et de 95,4 % avec le réactif Slidex Staph-Kit. Tableau I : Exemples de réactifs commercialisés permettant la détection simultanée de plusieurs caractères de S. aureus.

15 Caractères détectés Facteur Polysacchar Différents kits d affinité pour fibrinogè ne Protéin e A i-des capsulaires sérotypes 5 et 8 Antigèn e 18 Pastorex Staph-Plus (Sanofi Diagnostics Pasteur, réf 36536) Slidex StaphKit (biomérieux Réf ) Staphlex ( Uniphth réf ) Sensibilité à la novobiocine La détermination de la sensibilité à la novobiocine permet d individualiser trois espèces résistantes chez l homme. Le test peut être réalisé en étudiant la croissance bactérienne autour d un disque de novobiocine (Sanofi Diagnostics Pasteur, réf 56350).

16 Utilisation de galeries biochimiques. La détermination d espèce peut être réalisée à l aide de galerie biochimiques d identification. Les systèmes couramment utilisés en France sont les suivants : API Staph (biomérieux, réf ) : 19 tests, 19 espèces identifiées, ID 32 Staph (biomérieux, réf ) : 26 tests, 24 espèces identifiées, (Gam + Identification GPI) card (Viteck System, biomérieux) : 29 tests, 15 espèce identifiées. Microscan Pos Combo et rapid Pos Comb ( Sanofi Diagnostics Pasteur) : 18 et 24 tests, 21 et 24 espèces identifiées. Ces galeries permettent aussi la détermination de la sensibilité aux antibiotiques. Ces systèmes permettent une identification correcte dans plus de 90 % des cas pour la majorité des espèces reconnues par les bases de données respectives Techniques utilisant les sondes nucléiques. A côté du ribotypage qui permet une identification d espèce des staphylocoques, un kit commercialisé par Gen Probe (Amccuprobe System, Ge-Probe, Biotechnie, Rungis, France) permet l identification de l espèce S. aureus avec détection en chimioluminescence des ARN ribosomiques spécifiques de cette espèce. 2.2 Les antibiotiques actifs sur Staphylococcus aureus (10, 13, 14, 18, 23, 24, 26, 30, 32, 33, 37, 39, 41-43) Les β-lactamines Structures de quelques molécules.

17 Pénicilline G O N COOH CH 2 C NH CH 3 NH 2 O S CH 3 Ampicilline O N COOH CH C NH CH 3 NH 2 O S CH 3 Céfalotine COOH O N CH 2 O C CH 3 CH2 CO NH S S

18 Oxacilline O N COOH C NH CH 3 CH 3 N CH S O Mécanisme d action Les beta-lactamines agissent en inhibant la synthèse du peptidoglycane Mécanisme de résistance Deux mécanismes de résistance ont été décrits pour Staphylococcus aureus : La production de bêta-lactamases La modification de cible La production de bêta-lactamases (pénicillinase) La pénicillinase de Staphylococcus aureus est spécifique de l espèce, plasmidique et transmissible. Elle lui confère une résistance aux pénicillines G, V et A, aux carboxypénicillines et aux uréido-pénicillines. Plus de 90 % des S. aureus isolés des produits pathologiques en milieu hospitalier sont producteurs de pénicillinase.

19 Quatre groupes de bêta-lactamases (A, B, C, D) ont décrits chez Staphylococcus aureus dont les gènes sont le plus souvent portés par des plasmides [3]. Elles sont pour la plupart inductibles (leur production est accrue en présence de faible concentration de certaines bêta-lactamines comme la pénicilline G), plus rarement constitutives (leur production est d emblée maximale). Les inhibiteurs de bêta-lactamases tels que l acide clavulanique, le sulbactam permettent de restaurer la sensibilité du germe aux pénicillines du groupe A, les céphalosporines en général et l imipénème. Les inhibiteurs de bêta-lactamases sont utilisés en association pour protéger les molécules normalement hydrolysées La modification de cible Elle est aussi appelée résistance intrinsèque. Elle correspond à la résistance à la méticilline. Les premières souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline ont été observées en Angleterre, puis en France au début des années 60. La particularité de cette résistance est due à son expression «hétérogène» : en moyenne 1 bactérie sur 10 4 à 10 6 exprime la résistance. Certaines souches sont extrêmement hétérogènes mais pour d autres la résistance s exprime pour la presque totalité de la population (souches dites «homogènes»). Différents facteurs peuvent modifier l expression de cette résistance Mécanisme de résistance Staphylococcus aureus résiste à la méticilline par production d une PLP (protéines de liaison aux pénicillines) modifiée (PLP2a) qui a une affinité diminuée ( 10 à 500 fois) pour la méticilline. La résistance à la méticilline est croisée à toutes les bêta-lactamines.

20 Autres mécanismes de résistance. D autres mécanismes de résistance ont été décrits pour la méticilline : Hyperproduction de bêta-lactamases Elle se caractérise par une inhibition partielle des pénicillines du groupe M et des céphalosporines La tolérance La tolérance se définit comme l aptitude d une bactérie à résister à l action bactéricide et/ou bactériolytique d antibiotiques actifs sur la paroi bactérienne en cours de biosynthèse alors que sa sensibilité n est pas modifiée. Il y a augmentation du rapport CMB/CMI, d au moins 32 fois. Cette tolérance serait en relation avec une dérégulation du système autolytique (muréine-hydrolase). Elle est rencontrée chez les bactéries à gram positif (staphylocoque doré, streptocoque, pneumocoque) Phénotypes de résistance Classiquement, on distingue 3 phénotypes de résistance aux bêta-lactamines chez Staphylococcus aureus selon que les souches sont sensibles ou non à la méticilline : PéniS-métiS : souches pénicilline sensibles et méticilline sensibles. PéniR-métiS : souches pénicilline résistantes et méticilline sensibles. Ces souches produisent une pénicillinase acquise plasmidique et inductible qui leur confère une résistance aux pénicillines G et V, aux amino-, carboxy- et uréido-pénicillines ; elles restent sensibles aux autres bêta-lactamines et aux inhibiteurs de bêta-lactamases. PéniR-métiR : ces souches en plus de la production d une pénicillinase, sauf pour de rares souches, produisent une PLP modifiée (PLP2a) qui a une affinité diminuée pour la méticilline. Ce type de résistance est

21 chromosomique, inductible ou constitutive et implique une résistance croisée à toutes les bêta-lactamines in vitro mais aussi in vivo. La détection des souches méticilline résistantes au laboratoire se fait par l adjonction d un disque d oxacilline (diamètre diminué : oxacilline résistant sur l antibiogramme) En France, les SARM appartiennent en majorité aux sérotype III ou 18. Les SARM sont de plus toujours résistants à la streptomycine, aux tétracyclines, aux sulfamides et généralement à l érythromycine (inductible) Les aminosides Structures des aminosides Phosphorylation Acétylation Phosphorylation SUCRE AMINE SUCRE AMINE R 6 OH R 5 4' R 35" O R 4 2' 4" 2" 1' O R 3" 1" OH O 5' R NH OH O 2 NH 2 6' R 8 Phosphorylatio Acétylation Acétylatio n R1 Adénylation 1 3 R 9 - NH 2.désoxystreptamine

22 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 Gentamicine : CH3 CH3 H NH2 H H H NH2 H Nétilmicine : CH3 CH3 H NH2 H OH H NH2 C2H5 Tobramycine: H H CH2OH NH2 H OH H NH2 H Amikacine : H H CH2OH OH OH OH H NH2 COCHOHCH2CH2NH2 Kanamycine [29] CH2 OH H 2 N O OH O OH OH NH 2 H 2 N O O CH2 OH NH2 OH OH

23 Streptomycine [29] NH C NH OH CH NH 2 HC O CH HO OH O H CH 3 NH C H NH C C OH O O H C OH C C H NH NH 2 OH C H CH 3 C H CH Mécanisme d action: Les aminosides inhibent l initiation de la synthèse protéique au niveau des ribosomes (sous-unité 30 S) et chaque aminoside semble agir au niveau d une protéine ribosomale particulière.

24 Mécanisme de résistance Les résistances aux aminosides sont dues surtout à la production par le staphylocoque d enzymes de modification des aminosides appartenant à trois classes : acétyltransférase (ACC), nucléotidyltransférase (ANT) et phosphotransférase (APH) codées par des gènes acquis plasmidiques ou transposables. Chaque enzyme est dénommée en fonction de la molécule qu elle modifie, ce qui se traduit par un phénotype de résistance Phénotypes de résistance. Sept phénotypes de résistance ont été décrits chez Staphylococcus aureus : - Phénotype S : Il correspond à la résistance isolée à la streptomycine. Cette résistance est due soit à la production d une enzyme APH(3") ou ANT(6) ou ANT (9), soit à une mutation ribosomale. - Phénotype KNm : Résistance à la fois à la kanamycine et à la néomycine (paramomycine et framycétine). Elle est due à la production d une enzyme APH(3') de type III. Cette enzyme modifie partiellement l amikacine. [26,83] - Phénotype KTG (Kanamycine-Tobramycine-Gentamicine) : Il confère une résistance totale à ces trois molécules et une résistance partielle à l amikacine et à la nétilmicine, soit une résistance à tous les aminosides utilisable en pratique clinique [72]. Elle est due à la production d une enzyme bifonctionnelle APH (2") + AAC (6'). - Phénotype KT : Ce phénotype confère une résistance totale à la kanamycine et à la tobramycine et une résistance partielle à la néomycine. Elle est due à la production d une ANT (4')(4"). - Phénotype S+KNm :

25 Il confère une résistance à la streptomycine, à la kanamycine, à la néomycicne et une résistance partielle à l amikacine. - Phénotype S+KTG : Il confère une résistance à la streptomycine à la kanamycine, à la tobramycine, à la gentamicine et une résistance partielle à la nétilmicine. - Phénotype S+KNm+KTG : Il confère une résistance à la totalité des aminosides. Toutefois la résistance pour l amikacine et la nétilmicine n est que partielle Fréquence de résistance. Plus de 90 % des souches résistantes à l oxacilline sont résistantes à la streptomycine, à la kanamycine, à la gentamicine et à la tobramycine. La résistance à la gentamicine et à la tobramycine doit être considérée comme croisée à la nétilmicine et à l amikacine quel que soit le résultat de l antibiogramme en raison du mécanisme commun de résistance. En effet la résistance à l amikacine et à la nétilmicine ne s exprime que chez 10 % des souches sur l antiogramme alors qu elles conduisent à des échecs cliniques Macrolides-linosamides-streptogramines (MLS) Structures des molécules testées.

26 Erythromycine CH 3 O HO N H 3 C OH HO CH 3 O O Desosamine OH CH 3 H 3 C CH 3 CH 3 H 5 C 2 O O OCH 3 CH 3 O OH Cladinose O Erythronolide CH 3 :fonction lactone Lincomycine CH 3 CH 3 CH 2 CH 2 HO CH N CH 3 C NH CH HO O HO OH

27 Synergistines Les synergistines comprennent deux antibiotiques commercialisés : la pristinamycine (P) et la viginiamycine (V), isolées respectivement en 1955 à partir de Streptomyces pristinaespiralis et en 1954 à partir de Streptomyces virginae. Un dérivé sémi-synthétique de la P dénommée RP 59500, utilisable par voie parentérale, est actuellement en cours d évaluation clinique. La RP est un dérivé sémi-synthétique de la pristinamycine, soluble dans l eau, associant un dérivé 5-delta thiométhyl de la PIA et un dérivé 26-sulphanyl de la PIIB avec rapport PIA/PIB de 30/70. Formule des constituants des synergistines : Pristinamycine (P) Formule Virginiamycine (V) Formule PIA C45-H54-O10-N8 PIB C44-H52-O10-N8 VS C43-H49-O10-N7 PIC C44-H52-O10-N8 PILA C28-H35-O7-N3 VM C28-H35-O7-N3 PIIB C28-H37-O7-N3 La pristinamycine est divisée en groupe I et groupe II : Constituants Composition du poids (%) Groupe I Groupe II Pristinamycine IA Pristinamycine IB Pristinamycine IC Pristinamycine IIA Pristinamycine IIB

28 Mécanisme d action Les MLS inhibent les synthèse protéiques au niveau du ribosome en se fixant sur la sous-unité 50 S. Ce sont des molécules bactériostatiques Mécanisme de résistance La résistance plasmidique est la plus fréquente. Le mécanisme habituel est une modification de la cible par une méthylase (méthylation de l ARNr 23 S) diminuant ainsi l affinité de ces antibiotiques pour le ribosome Phénotypes de résistance. BUU-HOI a défini 5 phénotypes : - Phénotype sensible: souche sensible à tous les MLS - Phénotype MLS B : Constitutif : souche résistante à tous les macrolides (M), aux lincosamides(l) et aux streptogramines B. Inductible : souche résistante à l érythromycine, sensible aux autres macrolides, aux lincosamides et aux streptogramines. - Phénotype LS A : souche sensible aux macrolides, résistante aux lincosamides (L) et à la streptogramine A. Ces souches sont apparues en France dés Elles sont rarement isolées. La résistance SA confère la résistance à l association SA+SB. Mais pour certaines souches le niveau de résistance est bas et difficilement détectable sur l antibiogramme. - Phénotype L : souche résistante uniquement à la lincomycine. Ce phénotype de résistance fut décrit d abord chez Staphylococcus aureus d origine animale et chez Staphylococcus spp. Il a été récemment trouvé chez de rares Staphylococcus aureus d origine humaine. - Phénotype MLS B associé à S A :

29 Ces souches sont résistantes à tous les antibiotiques du groupe MLS. Le mécanisme de résistance est lié à la production d une acétyltransférase inactivant les streptogramines B. Les gènes conférant la résistance à S A et S B sont localisés sur les plasmides qui confèrent également la résistance à la kanamycine, la tobramycine et l amikacine par production d une 4,4"- aminoside adényltransférase [ANT(4)( 4")]. La fréquence d isolement de ces souches est de l ordre de 1 % Mutants chromosomiques. Les mutants chromosomiques résistants aux MLS peuvent être sélectionnés sous traitement. Il s agit soit des souches poussant en petites colonies déficientes pour lesquelles la résistance aux MLS est souvent associée à celles aux aminosides et au chloramphénicol, soit des souches poussant normalement mais résistantes à un seul antibiotique, érythromycine Les quinolones : la péfloxacine Structure Péfloxacine : H 3 C N CH 2 CH 3 N N COOH F O

30 Mécanisme d action Les quinolones sont des antibiotiques bactéricides qui agissent en inhibant spécifiquement l ADN-gyrase, enzyme bactérienne nécessaire à la réplication de l ADN entraînant la mort de la bactérie. Ces antibiotiques se fixent sur le complexe ADN-gyrase au niveau de la sous-unité A de l enzyme Mécanisme de résistance La résistance aux quinolones se fait exclusivement par mutation chromosomique entraînant soit une altération de la sous-unité A de la gyrase qui perd ainsi son affinité pour les quinolones, soit une perte de la perméabilité de la membrane bactérienne Fréquence de résistance : Les staphylocoques résistent à la péfloxacine dans environ 18 % des cas La fosfomycine Fosfomycine: H H C C H 3 C PO 3 H 2 O

31 Mécanisme d action La fosfomycine agit au début de la synthèse du peptidoglycane en inhibant la pyruvyltransférase qui est une enzyme impliquée dans la synthèse des précurseurs Mécanisme de résistance La résistance est chromosomique, suite à une perturbation des mécanismes actifs transmembranaires mais peut être plasmidique. La fosfomycine est utilisée en thérapeutique avec d autres antibiotiques Acide fusidique : Structure L acide fusidique est le seul antibiotique de structure stérolique. Acide fusidique: CH 3 CH 3 COOH H HO H 3 C CH 3 O C CH 3 O CH 3 HO CH 3

32 Mécanisme d action L acide fusidique agit sur la synthèse protéine en inhibant le facteur d élongation, ce qui bloque la traduction de l ARN messager au niveau de la sous-unité 50 S du ribosome Mécanisme de résistance Chez Staphylococcus aureus, la résistance à l acide fusidique est due à une mutation chromosomique, ce qui justifie l emploi de cet antibiotique en association Les tétracyclines : la doxycycline Structure Doxycycline : CH 3 OH N(CH 3 ) OH COONH 2 OH O OH O

33 Mécanisme d action Les tétracyclines inhibent la synthèse des protéines au niveau des ribosomes par liaison avec les protéines de la sous-unité 30 S mais peut être aussi en moindre proportion avec la sous-unité 50 S Mécanisme de résistance La résistance plasmidique est due à l expulsion de l antibiotique de la cellule, donc à une concentration intrabactérienne insuffisante. Toutefois la résistance à la minocycline est d origine chromosomique et est associée à la tétracycline Les sulfamides (sulfaméthoxazole) et timéthoprime Structures sulfaméthoxazole : O NH 2 S NH O N CH 3 O

34 Triméthoprime : CH 3 O NH 3 CH3O CH 2 N CH 3 O NH 2 N Mécanisme d action Les sulfamides agissent au niveau d une enzyme, la dihydroptéroate synthétase (DHPS), qui catalyse la formation d acide ptéroïque à partir d acide para-amino-benzoïque (PABA) de ptéridine inhibant ainsi la synthèse de l acide dihydrofolique (DHF). Il existe une compétition entre sulfamides et PABA pour la DHPS. En cas d apport exogène de PABA (milieu de culture), la quantité de sulfamides nécessaires pour inhiber la DHPS sera importante. Le triméthoprime se fixe sur une autre enzyme, la dihydrofolate réductase (DHFR) et empêche la formation de l acide tétrahydrofolique (THF) nécessaire à la synthèse de l ADN à partir des précurseurs, grâce en particulier à une enzyme, la thymidine synthétase. En présence de triméthoprime et pour échapper à l action de celui-ci, les bactéries sont capables d effectuer la synthèse de l ADN directement à partir de la thymidine lorsque celle-ci est présente dans le milieu. Ce mode d action permet de comprendre l importance des qualités requises pour un bon milieu de culture.

35 Mécanisme de résistance Résistance aux sulfamides La résistance aux sulfamides peut être due soit à une mutation chromosomique, soit à une acquisition d un plasmides de résistance. Cette résistance concerne tous les sulfamides sans exception Résistance au triméthoprime De nombreux mécanisme de résistance ont été décrits au cours des 10 dernières années. Il s agit soit de mutation chromosomique, soit de résistance codée par des plasmides. Ces mécanismes valent également pour les dérivés du triméthoprime Les phénicolés : le chloramphénicol Structure OH CH 2 OH O 2 N CH CH NH C CHCL Mécanisme d action Il bloque la synthèse des protéines en se fixant sur la sous-unité 50 S du ribosome, : inhibant ainsi la formation de la liaison peptidique Mécanisme de résistance La résistance est de nature plasmidique par surproduction d une acétyltransférase. Cette enzyme transforme le chloramphénicol et le thiamphénicol en dérivés diacétylés inactifs. Mais l enzyme est inductible :

36 sa surproduction par la bactérie est dépendante de l exposition de l antibiotique Les Glucopeptides : Vancomycine structure C 66 H 75 CL 2 N 9 O Mode d action Chez les bactéries à Gram positif, les glycopeptides diffusent au sein de la paroi bactérienne qui est constituée à 90 % de peptidoglycane, et se fixent à leur substrat : les disaccharides-pentapeptides. Cette fixation a pour première conséquence d inhiber l action des carboxypeptidases et des transpeptidases qui ne peuvent plus exciser la D-alanine termiale du disaccharide-pentapeptide et assurer la liaison du D-alanyl subterminal au résidu peptidique d un disaccharide-pentapeptide déjà polymérisé au sein du peptidoglyclane. De plus compte tenu de leur masse moléculaire particulièrement élevée les glycopeptides empêchent le rapprochement du disaccharide-pentapeptide et de la partie terminale du peptidoglycane, et inhibent l action des transglycosylases qui permettent de créer une entre les fractions glucidiques des disaccharides-pentapeptides. Les glycopeptides provoquent ainsi un arrêt de la synthèse du peptidoglycane et de la croissance bactérienne Mécanisme de résistance

37 La bactérie libère au niveau de sa paroi un disaccharide-pentapeptide possédant un D-alanine-D-lactate terminal non reconnu par le glycopeptide dont l action est ainsi inhibée. Enfin, il s agit d un mécanisme inductible. VanS est sécrété au niveau de la surface externe de la membrane cytoplasmique et reconnaît la présence dans son environnement de glycopeptides. Un message transmembranaire est alors relayé au niveau cytoplasmique par VanR qui induit la lecture de gène de résistance et la synthèse de VanA, H, X, Y, ainsi que de VanZ dont le rôle reste non élucidé. 2.3 Les différentes associations d antibiotiques pour le traitement des infections à Staphylococcus aureus Arguments de prescription : L obtention d un effet synergique, recherchée dans les deux principales raisons pour la prescription d une association d antibiotiques. Les autres indications s inscrivent dans la possibilité de réduction de la durée du traitement, de diminution des doses de chaque antibiotique afin de réduire le risque d effets toxiques ou d améliorer l effet antibactérien en profitant des effets pharmacodynamiques de chaque antibiotique Comportement in vitro et dans les modèles expérimentaux des principales associations anti-staphylococciques. Le choix des associations est guidé par la pratique des tests in vitro dont les techniques d études permettent d apprécier l effet bactériostatique ou bactéricide d une association. Il est à noter que les résultats des tests in vitro, parfois discordants selon les techniques utilisées, nécessitent une validation in vivo obtenue par le modèle expérimental et par la pratique clinique. Selon les diverses associations, il en résulte trois groupes de comportements :

38 _Associations habituellement synergiques _Associations habituellement additives ou indifférentes _Associations antagonistes Synergie.Oxacilline + gentamicine (C).Glycopeptides + gentamicine (C).β-lactamines + fosfomycine (B+C).Glycopeptides + β-lactamines (B+C).Sulfaméthoxazole + triméthoprime (B+C).Streptogramines (B+C).Amoxicilline + acide clavulanique*.pipéracilline + tazobactam* addition ou indifférence.glycopeptides + fosfomycine (B+C) ou rifampicine (B+C).Fluoroquinolones + Glycopeptides Ou aminosides ou β-lactamines (B+C).Acide fusidine + rifampicine ou Glycopeptides ou fosfomycine (B+C) Antagonisme

39 .Rifampicine + oxacilline ou fluoroquinolones ou glycopeptides.acide fusidique + ou fluoroquinolones (B+C).clindamycine + gentamicine (C).érythromycine + Spiramycine ou clindamycine si MLS B (B) B: en bactériostase C: en bactéricidie *: par inhibition de la β- lactamase MLS B : résistance aux macrolides, lincosamides et streptogramines

40 3. Méthodologie 3.1 Cadre d étude Présentation du Mali Le Mali est un pays soudano-sahélien situé au cœur de l Afrique Occidentale, avec une superficie de km² et une densité brute de 8,2 habitants/km². En 2001, sa population est de habitants répartis comme suit : 0-14 ans : 47,2 % ; ans : 49,8 % ; > 65 ans : 3 %. Il a des frontières communes avec l Algérie au Nord, le Niger à l Est et Nord-Est, le Burkina Faso et la Côte d Ivoire au Sud, la Guinée au Sud- Ouest et le Sénégal et la Mauritanie à l Ouest. Dans son ensemble le pays est caractérisé par une température moyenne très élevée (37 C). On distingue une saison des pluies très courte de juin à septembre et une saison sèche d octobre à mai avec alternance de froid (de novembre à février) et de chaleur (de mars à mai). On rencontre au Mali plusieurs groupes ethniques, les Bambaras, les Peuhls, les Sonrhaïs, les Mossis, les Dogons, les Bozos, les Touareg, les Maures. La population est beaucoup plus concentrée vers le Sud. Les taux de mortalité et morbidité sont très élevés, ce qui s explique aisément par la situation d extrême pauvreté dans laquelle vivent les populations. Le système de santé est constitué de trois niveaux de prestations : Secteur primaire Secteur secondaire Secteur tertiaire La situation épidémiologique actuelle au Mali se caractérise par une prédominance des maladies infectieuses et parasitaires, notamment le paludisme, les infections broncho-pulmonaires, les diarrhées et déshydratations, les méningites, l infection par le VIH/SIDA.

41 3.1.2 Présentation de l Hôpital du Point "G" [16] Localisation : L Hôpital du Point "G" est la première et la plus grande importante formation sanitaire auparavant, qui a été créée dans la colonie du Haut Sénégal Niger appelée plus tard le Soudan Français. Il est situé sur la colline du Point G à quelques 7 km du centre de la ville de Bamako, voisine de la colline du Point F appellation qui a fini par ne plus être perçue en face du vocable Koulouba (grande colline). Les travaux de construction de l hôpital du Point G ont commencé en 1906, mais ne sont devenus fonctionnels qu en L hôpital dès la première année de construction comportait : - Un bloc opératoire, un laboratoire, une pharmacie, une radiologie, un pavillon de médecine générale, un pavillon de chirurgie générale destinés à l administration coloniale. - Un pavillon de chirurgie générale et de médecine destinés aux autochtones quel que soit leur rang social. - Le pavillon dit «les contagieux» est destiné aux malades atteints de tuberculose ou d autres maladies contagieuses. - Une maternité, une lingerie, une buanderie, une écurie, etc.. De 1912 à 1958 la gestion de l hôpital a été assurée par un médecin militaire commandant ou lieutenant colonel. Ce dernier est secondé par un administrateur gestionnaire. En 1958, date de sa démilitarisation, l hôpital a reçu son premier directeur civil non médecin nommé Rossi Jean. De 1959 à 1975 l hôpital a subi des transformations à savoir construction d un nouveau bloc opératoire, d une radiologie, d un bloc administratif, de deux pavillons de chirurgie générale baptisés aux noms de deux illustres médecins maliens Tidiani Faganda TRAORE et Sominé DOLO, d un complexe culinaire, d un service de psychiatrie. A partir de 1970 une nouvelle forme de gestion est apparue avec la nomination d un médecinchef dit coordinateur des dépenses d un adjoint administratif dit sous

42 coordinateur des dépenses. A cette équipe s ajoute un gestionnaire qui est chargé de la comptabilité en la matière Structures et Fonctionnement de l Hôpital du Point "G" Information et Infrastructures : L hôpital du point "G" est un établissement médical qui, progressivement, agrandit ses infrastructures. L hôpital comporte aujourd hui des services de médecine et de chirurgie répartis entre 27 pavillons selon les spécialités et les catégories d hospitalisation. Les différents services ont en commun un plateau technique qui comprend les services de radiologie, de pharmacie, de biologie, et de bloc opératoire avec service d anesthésie et de réanimation. L hôpital d une manière générale a la capacité d hospitaliser beaucoup de malades Fonctionnement de l Hôpital du Point"G": L Hôpital du Point "G" est constitué des fonctionnaires de l état, des agents conventionnaire, des manœuvres, des contractuels qui sont repartis entre les différents services administratifs et techniques. Les travailleurs ont pour souci de sauvegarder la vie humaine, c est pour cela, ils ont introduit la garde au niveau des services pour pouvoir subvenir aux besoins des malades qui arrivent en dehors des heures ouvrables. Au niveau des services de médecine, la garde assure les premiers soins et l hospitalisation des urgences.

43 Les Organes administratifs de l hôpital La commission administrative : La Direction Le Comité de gestion La commission administrative Elle est créée selon le décret n 1971/PGRM du 28/05/1984 fixant l organisation et les modalités du fonctionnement des hôpitaux centraux. Cette commission est chargée de : - Définir l orientation générale de l hôpital c est ainsi qu elle discute et adopte le rapport d activité de l exercice écoulé de la direction de l hôpital et le projet du budget de l année à venir ; - Prendre des mesures propres pour améliorer les conditions de travail à l intérieur de l hôpital ; - Désigner un comité permanent d appui chargé d apporter à la direction de l hôpital toute assistance pour l exécution de ses recommandations La direction de l hôpital du Point "G" L hôpital du Point "G" est dirigé par un médecin directeur nommé par arrêté du ministère de la santé. Il a pour rôle de coordonner et de contrôler les activités des divisions. C est pourquoi il présente le rapport d activité et le projet du budget de l hôpital. Il est assisté par un adjoint qui le remplace an cas d absence ou empêchement.

44 La Division technique : Elle assure le diagnostic et le traitement des maladies: elle participe à la formation continue du personnel, à l organisation des stages des étudiants et élèves en rapport avec la division administrative et financière. Elle comprend : - Un Bureau d administration et du personnel - Un Bureau du matériel - Un Bureau des entrées - Un Bureau de l alimentation - Un Service social L hôpital est composé de 27 pavillons dont douze (12) pavillons de médecine. - Médecine A - Médecine B - Médecine C - Médecine D - Médecine E - Cardiologie A - Cardiologie B - Maladies Infectieuses - Pneumo-Phtisiologie - Néphrologie et l unité d hémodialyse - Neurologie - Rhumatologie - Psychiatrie - Radiologie - Chirurgie A (Chirurgie II + Pavillon T.F. TRAORE) - Chirurgie B (Chirurgie I + Pavillon Sominé DOLO) - Une unité de coelio-chirurgie - Gynécologie-Obstérique - Bloc Technique

45 - Urgences et Réanimation - Urologie - Pharmacie - Laboratoire de Biologie médicale et Hygiène hospitalière - Morgue Le Comité de Gestion: Il est consultatif et aide le Directeur dans sa tâche. Il comprend : Le Directeur Général (DG) de l hôpital qui est le président des membres - Le Directeur général adjoint (DGA) - Le Surveillant général - Le Chef du Service social - Les Chefs de Service - Deux (2) délégués des comités syndicaux de l hôpital (syndicat national et syndicat autonome des cadres médicaux) Il se réunit 2 fois par an par voix consultative sur convocation du Directeur général pour les prises de décision par la commission administrative Présentation du laboratoire de biologie médicale et hygiène hospitalière Description du service Notre étude s est déroulée au laboratoire de biologie médicale de l hôpital du Point "G". Ce laboratoire est situé au sud de l hôpital. Il a la même date de création que l hôpital (1906). Il n est devenu fonctionnel qu en 1912.