ACPA et Hémopathies Malignes. Alain BERNHEIM INSEM U985 IGR Paris Villejuif FRANCE
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- Marie-Claude Cousineau
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1 ACPA et Hémopathies Malignes Alain BERNHEIM INSEM U985 IGR Paris Villejuif FRANCE
2 Hémopathies malignes Des maladies génomiques de la cellule
3 CELLULE NORMALE Altération ADN Réparation Apoptose Localisation Conséquences = 0 Alteration heritable (non reparée) Conséquences fonctionnelles Translocation, activation dʼoncogène Amplification de gène(s) Perte de gène (Suppresseur tumeur) Phenotype Mutateur Un PROCESSUS RECURRENT Instabilité Génétiqie Nouvelles mutations Progression clonale Cellule hautement Maligne
4 Chromosomal Abnormalities in Human Cancer. Fröhling & Döhner.NEJM, 2008
5 Proliférations malignes en Hématologie MYELOPROLIFERATIONS Syndromes Myéloprolifératifs (ex LMC) Syndromes Myélodysplasiques (ex LMMC) Les Leucémies Aiguës Myéloblastiques (LAM) LYMPHOPROLIFERATION Leucémies Aiguës Lymphoblastiques (LAL) Leucémies Lymphoïde Chroniques (LLC) Myélomes Lymphomes B, T, indolents, agressifs... Lymphomes de Hodgkin
6 Les Leucémies Aiguës Proliférations clonales aiguës de précurseurs hématopoïétiques (blastes) transformés des lignées myéloblastique, érythroblastique ou mégacaryocytaire (L A Myéloblastique) lymphocytaires T ou B (LA Lymphoblastique) En règle une LA envahit la moelle osseuse, sang => syndrome tumoral (++ +LAL) inhibe l hématopoïèse normale => cytopénies conséquences cliniques => découverte de la maladie
7 de Novo Anomalies Quantitatives: +1q -5 ou 5q- -7 ou 7q- +8 Gènes? Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology
8 t-lam (Leucémies secondaires à un traitement) Clinique Anomalies cytogénétiques «spécifiques» Post alkylants (Endoxan) phase pré LA, t-mds latence de 24 mois -5, 5q- -7, 7q- Post anti topoisomerases II (Anthracyclines) Pas de phase préleucémique latence de 6 mois Translocations impliquant MLL: t(11q23,v) CBFB: t(8;21), t(15;17), inv (16) +anomalies non spécifiques : anomalies complexes, +8 caryotype normal
9 CGH array haute résolution dans des t-lam et des p-lam Préciser les points de cassures des CNA (Copy Number Alteration) Isoler des Régions Minimales Critiques (RMC). Pointer des gènes candidats au sein de RMC Comparer les résultats entre t-lam et p-lam Résolution théorique attendue : 12 kb pour 244k 7,5 kb pour 400k
10 Lame 244k oligonucléotides (50-60 mers, isothermiques) synthétisés in situ par impression 12x12 pixels en rouge et en vert 60 µm
11 Caryotypes et FISH effectués au diagnostic t-lam (n = 36) p-lam (n = 49) -5 ou 5q- 8% (3) 2% (1) 7 ou 7q- 22% (8) 8% (4) Translocations 31% (12) 29% (15) An. Complexes 19% (7) 18% (9) NN 17% (7) 41% (22) Pas de mitose 3% (1) 2% (1) Moelle ou sang préservés à -180 C lors du diagnostic
12 acgh t-aml p-aml acgh 244K / 400K Agilent Prérequis : - blastes 60% des cellules de l échantillon - culture 24h post décongélation avant préparation de l ADN - contrôles préanalytiques des ADN au Qubit et Bioanalyzer Mise en culture des fibroblastes médullaire: échec emploi d ADN témoin commercial Mélange d ADN de individus Emploi du même ADN commercial Segmentation des données (Bioinformatique): Tous les sujets ont eu un profil car la qualité des lames est bonne Bonne corrélation caryotypes / acgh
13 Caryogramme simple t-9-7 Bonne corrélation caryotype acgh
14 LES CNV (Copy Number Variation) CNV = Polymorphismes mendéliens de gains ou de perte Fréquents, Dispersés Présence de gènes et mirna dans des CNV Devant une anomalies du nombre de copies < 2 Mb: - est ce un CNV ou un CNA? Pour y répondre: Répétition de même point de cassure dans la série détection d un CNV de l ADN du témoin Consultation data base
15 Principaux CNV observés dans les t-lam et les p-lam bld 18
16 TRANSLOCATIONS RECIPROQUES Non visibles en acgh ++++ t(9;11)(p21;q23), remaniement de MLL (FISH)
17 TRANSLOCATIONS RECIPROQUES, mais... Aucune translocation équilibrée n est visible sauf deux cas avec t(8;21) : p-aml: perte d 1Mb en 8q21.3q22.1 <93,15-94,17> incluant les 2 premiers exons de RUNXT1 acgh 244K t-aml: gain en 21q22.1qter <35,00-45,21> par duplication de cette région confirmée en FISH. Invisible au karyotype acgh 244K
18 t-4 244K Caryogramme «complexe» 45,XX,dup(2)(q22;q34),del(3)(p21), t(5;13)(p15;q14),t(6;8)(p21;q24), +i (7q),der(7)t(7;15)(q10;q10),der(12)t(12;17)(p13;q11), -15,-17[18] dup(2)(q14.3q32.3),t(5;13)(p15;q14), t(6;8)(p21;q24),- 5q31.3q32,+i(7)(q10), der(7)t(7;15)(q10;q21.3),der(12)t(12;17)(p12.1;q11),- 12p11.2p12.1,- 15pterq21.2, - 17p11.2p13.3,- 17q23.2
19 RESULTATS Profil d un caryotype complexe en acgh 2x400K Dans la série 400k: un cas de t-aml avec amplification : En acgh : le gain est très fort avec un ratio égal à 3.19 en position <131,15-131,58>. Le point de cassure passe par MLL Confirmation par FISH (5 à 9 copies par cellule) Région 11q24.2q24.3 : gènes ETS1 et FLI1 ETS1 :Facteur transcriptionnel, impliqué dans la différencaition cellulaire et l hématopoïèse FLI1 :Friend leukemia virus integration 1
20 Anomalies de nombre de copies t-aml 244k t-aml 400k p-aml 244k p-aml 400k 80% (27A/2N) 85% (6A/1N) 70% (25A/11N) 100%A (12 A) Gains 1,3 [36] 6,1 [43] 1,4 [34] 3,6 [43] Pertes 2,3 [63] 9,8 [53] 1,2 [30] 4,2 [50] Pertes > Gains Pertes des t-lam> celles des p-lam
21 RMC (Région Minimale Critique) Rouge : fréquence la plus élevée Blanc : fréquence nulle
22 RMC (Région Minimale Critique) 5q- et 7 q- : plusieurs régions, Nombreux gènes candidats +8q24.2 : région distale à MYC corrélation avec +8? -17q11.2 : NF1(Neurofibromatose 1, AD) rôle connu dans la LMMC juvénile altéré dans 7% (39 cas/560 ) des p-aml dans la littérature
23 Perte de RUNX1-21q22.1 en position <35,11-35,15> RUNX1 perdu dans 6 cas 4 t-lam dont deux homozygote (1 perte & 1 mutation) 2 p-lam Souvent masquée ou cryptique => LAM à caryotype normal Confirmée +++ dans les séries publiées Retrouvée +++ dans les MDS/LAM post Anémie de Fanconi Délétion/Mutations de RUNX1 dans Maladies Plaquettaire Familiale, maladie AD, prédisposant aux MDS et LAM
24 RESULTATS : +21q et caryotypes complexes + 21q11.2qter < > Gènes ETS2 et ERG ETS2 = v-ets erythroblastosis virus E26 oncogene ERG = ets-related isoform 1 Ne sont retrouvés que dans les p-aml à caryotypes complexes 18/560 (dont 3 dans la série 1) L overexpression d ETS2 est corrélée à l amplification de la région Région connue sur la base d abac
25 Dans les Leucémies Aiguës Lymphoblastiques (LAL) Anomalies de nombre + structure fréquentes dans les LAL Difficultés d obtention de mitoses optimales ACPA, examen de 1ère intention dans les LAL conjointement avec le caryotype (Pr J Soulier, Hôpital St Louis, com. personnelle) Rôle pronostic +++
26 ACPA dans les Lymphomes Non Hodgkiniens 8q24 Translocations immunoglobuline14q32 18q21 11q13 3q27 Non visible en règle par ACPA MYC BCL2 CCND1 BCL6 Visibles en caryotype et/ou FISH ================================================= Anomalies additionnelles = CNA détectés +++ Les remaniements - des Immunoglobulines - des Récepteurs T sont détectables+++ (selon les matrices) car monoclonaux
27 CNV somatiques restreints aux lymphocytes B 14q32 : IGH <105,43-105,89 Mb> 2p12 : IGK <89-89,11 Mb> LY47 t(8;22)(q24;q11) 22q11 : IGL <21,37-21,56 Mb> Toujani et al, 2009
28 Myélome Multiple Caryotypes souvent complexes, parfois difficiles à obtenir FISH t(4;14) ACPA +++ d après J Corre et H Avet-Loiseau, 2011
29 Intérêt de l ACPA dans les Hémopathies Malignes? Les translocations équilibrées ne sont pas visibles Existence de remaniements cryptiques signifiants Le nombre de CNA dépend fortement de la résolution Trépied caryotype, FISH et acgh (myélome...) Absence des LOH qui représenteraient 20% des remaniements dans les proliférations myéloïdes Rôle pronostic extrapolé du caryotype non négligeable Prise en charge financière...
30 Remerciements U 985 INSERM P Dessen N Itzhar S Toujani Pathologie moléculaire IGR A Valent N Auger D Fauvet UGF IGR V Lazar T Robert C Richon B Job Canceropôle et taxe apprentissage IGR Hématologie clinique S de Botton JH Bourhis Discussions J Soulier C Bastard S Romana F Nguyen Khak
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