Kit drépanocytose Réf. DREPAN

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1 Page /0 Kit drépanocytose Réf. DREPAN A RECEPTION DU COLI :! Vérifier la composition du colis indiquée cidessous! tocker les articles du colis dans les bonnes conditions :!Placer le sachet noté O à 20 C!!Placer le flacon de rouge ponceau et les bandes d acétate de cellulose à + 4 C à l obscurité! Laisser le flacon de tampon tris hippurate et le tube contenant les microcapillaires à température ambiante Attention : Ces conditions de stockage sont à respecter scrupuleusement pour permettre une conservation générale des produits du kit de 6 mois.! Avant toute manipulation, étudier la fiche sécurité COMPOITION (pour 20 binômes) : tube de microcapillaires de dépôt flacon noté «tampon tris Hippurate» pour la préparation de L de tampon de migration sachet noir de 0 bandes d acétate de cellulose 57x40 mm sachet noté O de 2 microtubes à stocker à 20 C contenant : o microtube à bouchon de couleur rouge de 300µL de solution d hémoglobine A o microtube à bouchon de couleur mauve de 300µL de solution d hémoglobine flacon de 500 ml de rouge ponceau prêt à l emploi MATERIEL NECEAIRE : Pipettes de 0 ml Poire à pipeter ou pipump Eprouvette de 500 ml Flacon d L Flacon de 500 ml Feutres permanents Micropipette 0,2 ml ou poire à goutte calibrée Gants Lunettes de protection Papier aluminium Pince fine Microtube à bouchon Récipient pour bains de coloration et de décoloration Cuve à électrophorèse avec support de bandes, alimentation continue de 25 V et 250 ma Acide acétique glacial pour faire de l acide acétique 5% ORDALAB PARC UDEOR 5 Avenue des Grenots 950 ETAMPE FRANCE Tél. : Fax : Mail : info@sordalab.com

2 Page 2/0 MATERIEL CONEILLE : Portoir à microtubes Pour solution de transparisation : méthanol, acide acétique, diacétone alcool. Flacon de 00 ml OBJECTIF COGNITIF L utilisation du kit repose sur la situation de prédiction médicale recréée artificiellement compte tenu de l interdiction d utiliser des prélèvements d origine humaine en travaux pratiques. On considère une famille fictive dans laquelle l hémoglobine drépanocytaire est présente et pour laquelle on souhaite établir les génotypes des individus et l arbre généalogique de façon à évaluer la probabilité que la maladie se manifeste chez un enfant à naître. Les hémoglobines des parents et de leurs enfants sont reconstituées à partir des solutions fournies. Ces dernières sont préparées chez ordalab à partir de cristaux d hémoglobine qui garantissent l absence de tout germe pathogène dans les solutions. L hémoglobine des individus hétérozygotes est reconstituée en mélangeant un volume de chacune des deux solutions A et tandis que l hémoglobine des individus homozygotes correspond à chacune des deux solutions A et fournies qui sont utilisées directement. Le kit fournit également le reste du matériel consommable nécessaire pour réaliser l électrophorèse. RAPPEL Introduction générale sur la drépanocytose, les hémoglobines et l électrophorèse : La drépanocytose ou anémie falciforme est l hémoglobinopathie héréditaire la plus répandue dans le monde : elle affecte plusieurs centaines de milliers de personnes dont plus de en France. Dans cette maladie, lorsque la pression partielle en oxygène est faible, comme dans les capillaires périphériques, l hémoglobine des sujets atteints a tendance à polymériser en longues fibres rigides qui déforment les globules rouges en leur conférant une forme de faucille qui les empêche de passer dans les capillaires les plus fins, freinant ou bloquant leur circulation. L hémoglobine anormale, (sickle), ne diffère de l hémoglobine normale, A, que par un seul acide aminé de la chaîne bêta en position 6 (acide glutamique remplacé par valine). Les deux allèles ne diffèrent que par un codon. On peut distinguer les deux hémoglobines par leur mobilité électrophorétique. La caractérisation et la comparaison de diverses protéines peut être aisément réalisée par électrophorèse sur bande d acétate de cellulose ou sur gel d agarose. En appliquant la technique à l hémoglobine extraite des globules rouges d un individu, on peut donc déterminer quelle(s) hémoglobine(s) il possède et en déduire son génotype : hétérozygote, HbA/Hb ou homozygote HbA/HbA ou Hb/Hb. Ainsi, il est possible d étudier les relations génotypephénotype mais aussi de construire un arbre généalogique et de faire des prévisions en génétique humaine. En outre, l identification des génotypes dans diverses populations permet d établir la fréquence des allèles et de relier génétique et évolution. Kit en première : Insertion du kit dans le programme : Dans la partie du programme «du génotype au phénotype, relations avec l environnement», l étude de la drépanocytose est recommandée pour illustrer la diversité des phénotypes et la complexité des relations entre gènes, phénotypes et environnement : ORDALAB PARC UDEOR 5 Avenue des Grenots 950 ETAMPE FRANCE Tél. : Fax : Mail : info@sordalab.com

3 Page 3/0 Extrait du programme : Diversité des phénotypes : analyse d un exemple comme la drépanocytose ; comparaison de la structure des protéines en relation avec l exemple étudié. Complexité des relations entre gènes, phénotypes et environnement : cas des drépanocytoses. Objectif cognitif : Caractérisation de phénotypes moléculaires et identification des génotypes par électrophorèse de l hémoglobine Les allèles de la chaîne bêta des hémoglobines A et diffèrent par une mutation ponctuelle (substitution) qui modifie un seul codon. Cette mutation aboutit au remplacement de l acide glutamique en position 6 par la valine. Il en résulte que les hémoglobines A et diffèrent par leur charge électrique car la valine possède une charge négative de moins que l acide glutamique au ph alcalin (ph 8,6) où l on réalise l électrophorèse. C est pourquoi l hémoglobine A migre plus loin que l hémoglobine lors de l électrophorèse. Kit en terminale : Insertion du kit dans le programme : Dans la partie du programme «stabilité et variabilité des génomes et évolution», il est noté qu il faut traiter de l apport de l étude des génomes et des innovations génétiques. La drépanocytose est un exemple adapté de relation entre mécanismes de l évolution et génétique. Extrait du programme : tabilité et variabilité des génomes et évolution L apport de l étude des génomes, les innovations génétiques Étude d exemples de relation entre mécanismes de l évolution et génétique Objectif cognitif : le polymorphisme génétique Le polymorphisme génétique résulte de l accumulation de mutations. Les mutations qui confèrent un avantage sélectif aux individus qui en sont porteurs ont une probabilité plus grande de se répandre dans la population. La démarche est de même nature qu en première puisqu il s agit d identifier phénotypes et génotypes liés aux allèles de la chaîne bêta de l hémoglobine mais l objectif est différent puisqu il s agit en terminale de relier la génétique à l évolution. ur le terrain, l identification des hémoglobines a permis d établir la fréquence des allèles dans les populations et de constater ainsi que l allèle, pourtant défavorable, s est maintenu à une fréquence élevée dans les zones de paludisme endémique où il constitue une protection à l état hétérozygote. Exercice proposé pour 20 binômes (40 élèves) : Les binômes disposent de tubes contenant l hémoglobine A et l hémoglobine. Ils ont aussi des tubes numérotés correspondant aux hémoglobines d une famille dont l arbre généalogique est le suivant : ORDALAB PARC UDEOR 5 Avenue des Grenots 950 ETAMPE FRANCE Tél. : Fax : Mail : info@sordalab.com

4 Page 4/0 Un exercice supplémentaire consiste à trouver les génotypes possibles pour l enfant 7 en s appuyant sur les génotypes des parents. PREPARATION PREPARATION DU TAMPON DE MIGRATION (Étape réalisable à l avance et conservation de la solution à l abri de la lumière à 4 C pendant mois) Ajouter au flacon noté TRI HIPPURATE 900 ml d eau déminéralisée. Conserver à température ambiante ou + 4 C pendant mois. REALIATION DE OLUTION D HEMOGLOBINE A DEPOER Pour plus de clarté, vous pouvez noter A le microtube à bouchon rouge du sachet C stocké au congélateur et noter le microtube à bouchon mauve. Prélever 05 µl à la micropipette de la solution contenue dans le microtube à bouchon rouge du sachet C stocké au congélateur. Verser dans un microtube vide et propre Noter ce tube «A/» Prélever 05 µl à la micropipette de la solution contenue dans le microtube à bouchon mauve du sachet C stocké au congélateur. Verser dans le microtube noté «A/» Agiter ce microtube Conservation des microtubes à 20 C pendant 6 mois PREPARATION DE MICROTUBE POUR LE ELEVE Prélever 45 µl dans le microtube «A» et les transvaser dans un microtube à noter «4». Ce tube va servir pour 3 dépôts. Prélever 45 µl dans le microtube et les transvaser dans un microtube à noter «5». Ce tube va servir pour 3 dépôts. Prélever 60 µl dans le microtube «A/» et les transvaser dans un microtube à noter. Ce tube va servir pour 4 dépôts. Prélever 60 µl dans le microtube «A/» et les transvaser dans un microtube à noter «2». Ce tube va servir pour 4 dépôts. Prélever 45 µl dans le microtube «A/» et les transvaser dans un microtube à noter «3». Ce tube va servir pour 3 dépôts. Prélever 45 µl dans le microtube «A/» et les transvaser dans un microtube à noter «6». Ce tube va servir pour 3 dépôts. Ce qui reste dans le tube «A» servira pour 0 dépôts et ce qui reste dans le tube servira pour 0 dépôts. Ces tubes se conservent à 20 C pendant 6 mois ORDALAB PARC UDEOR 5 Avenue des Grenots 950 ETAMPE FRANCE Tél. : Fax : Mail : info@sordalab.com

5 Page 5/0 PREPARATION DE BANDE D ELECTROPHOREE Mettre des gants et des lunettes Ouvrir le paquet de bandes d acétate stocké à + 4 C. Prendre les bandes avec des pinces fines et les manipuler avec précaution Faire tremper les bandes d acétate de cellulose pendant 5 minutes dans le tampon de migration. Déposer les bandes sur un papier filtre afin d éliminer l excès de tampon. Placer les bandes sur le support de la cuve d électrophorèse. Pour savoir sur quelle face de la bande déposer les protéines, il faut se repérer à l aide de l encoche (qui sera placée du côté cathode (électrode noire) de la cuve) : ligne de dépôt encoche dépôt 4 dépôt 3 dépôt 2 dépôt PREPARATION DE LA ALLE Installer les bandes dans les cuves Disposer les tubes «A»,,, «2», «3», «4», «5» et «6» de manière à ce que chaque binôme puisse avoir accès aux tubes pour faire leur dépôt. Associer un capillaire à un microtube (le tremper dedans par exemple) APRE LE TRAVAIL DE ELEVE Fermer la cuve et mettre sous tension (environ 60 minutes à 25 V ; ne pas dépasser 60V). Mettre des gants et des lunettes pour réaliser toutes les étapes suivantes Après migration, placer les bandes dans le colorant issu de la bouteille notée «rouge ponceau» pendant 0 minutes. Décolorer les bandes dans trois bains successifs de 3 minutes d acide acétique à 5 %. Préparer éventuellement (non obligatoire) une solution de transparisation (qui permet de faciliter la lecture des résultats) : 75ml de Méthanol + 20ml d Acide acétique + 5ml de Diacétone alcool dans un flacon de 00 ml "" ATTENTION "" : le méthanol est très inflammable et toxique. Il faut manipuler avec des gants, des lunettes, une blouse et sous une hotte ou à défaut, dans un endroit ventilé. Tremper les bandes dans cette solution jusqu à ce qu elles deviennent translucides. Après la révélation, les bandes se conservent aussi longtemps que nécessaire. ORDALAB PARC UDEOR 5 Avenue des Grenots 950 ETAMPE FRANCE Tél. : Fax : Mail : info@sordalab.com

6 Page 6/0 MANIPULATION : REALIATION DE DEPOT : "" ATTENTION "" : Veiller à prélever chaque échantillon d'hémoglobine avec un capillaire différent et à ne pas mélanger les capillaires. Faire des groupes de 2 binômes : 2 binômes (A et B) déposent sur la même bande Poser la bande sur son support dans la cuve à électrophorèse de protéines en orientant le support de manière à ce que l encoche et la ligne de dépôt soit du côté de la cathode (électrode noire) COTE CATHODE (noir) COTE ANODE (rouge) ligne de dépôt encoche dépôt 4 dépôt 3 dépôt 2 dépôt Pour le binôme A : Dépôt en position : o Tremper le capillaire de dépôt dans le microtube noté «A» o Appliquer le capillaire sur la bande d acétate déjà en place sur son support, au tiers de l extrémité du côté de la cathode (borne noire) de manière à faire une goutte de dépôt o Remettre le capillaire dans le microtube noté «A» Dépôt en position 2 : o Choisir un tube numéroté et réaliser le second dépôt de la même façon que le dépôt du tube «A» mais avec le capillaire du tube numéroté. Pour le binôme B : Dépôt en position 3 : o Tremper le capillaire de dépôt dans le microtube noté o Appliquer le capillaire sur la bande d acétate déjà en place sur son support, au tiers de l extrémité du côté de la cathode (borne noire) de manière à faire une goutte de dépôt o Remettre le capillaire dans le microtube noté Dépôt en position 4 : o Choisir un tube numéroté (différent du tube choisi par le binôme A) et réaliser le second dépôt de la même façon que le dépôt du tube mais avec le capillaire du tube numéroté. #NB# : il faut que chacun des tubes numérotés soient déposé sur bande d acétate pour que le génotype soit connu après életrophorèse. ORDALAB PARC UDEOR 5 Avenue des Grenots 950 ETAMPE FRANCE Tél. : Fax : Mail : info@sordalab.com

7 Page 7/0 Exemple de répartition : Bande d acétate Binômes Dépôt provenant Dépôt 2 provenant Bande du tube du tube 2 Bande 2 Bande 3 Bande 4 Bande 5 Bande 6 Bande 7 Bande 8 Bande 9 Bande 0 du tube 6 du tube du tube 2 du tube 3 du tube 4 du tube 6 du tube 5 du tube 6 du tube du tube 2 du tube 4 du tube 5 du tube du tube 2 du tube 3 Dépôt 4 provenant du tube 3 Dépôt 3 provenant du tube 4 du tube 5 i vous êtes 20 binômes, suivez ce tableau. i vous êtes seulement 0 binômes, suivez les lignes des bandes d acétate de à 5. LANCEMENT DE L ELECTROPHOREE : Remplir la cuve avec le tampon de migration de manière à recouvrir les électrodes. Fermer la cuve et mettre sous tension (environ 60 minutes à 25V). COLORATION DE BANDE : Mettre des gants et des lunettes Après migration, placer les bandes dans le colorant issu de la bouteille notée «rouge ponceau» pendant 0 minutes. Décolorer les bandes dans trois bains successifs de 3 minutes d acide acétique à 5 %. ORDALAB PARC UDEOR 5 Avenue des Grenots 950 ETAMPE FRANCE Tél. : Fax : Mail : info@sordalab.com

8 Page 8/0 TRANPARIATION (Réalisable pour conserver les bandes plus longtemps et améliorer l observation) "" ATTENTION "": le méthanol de la solution de transparisation est très inflammable et toxique. Il faut manipuler avec des gants, des lunettes, une blouse et sous une hotte ou à défaut, dans un endroit ventilé. Tremper les bandes dans une solution de transparisation jusqu à ce qu elles deviennent translucides. Les bandes se conservent aussi longtemps que nécessaire (il est possible de les coller dans un compte rendu) EXERCICE PROPOE : En comparant avec la migration des hémoglobines A et, vous pouvez identifier les hémoglobines des membres d une famille dont l arbre généalogique est le suivant : Un exercice supplémentaire consiste à trouver les génotypes possibles pour l enfant 7 en s appuyant sur les génotypes des parents. REULTAT ATTENDU ET INTERPRETATION Les deux hémoglobines A et ne diffèrent que par un acide aminé de la chaîne β (constituée de 46 AA). C est pourquoi la différence de migration est si faible. Le radical R des deux acides aminés est : HbA : GLU : CH2CH2COOH Hb: VAL: CHCH3 CH3 Les protéines migrent en fonction de leur masse molaire, de leurs charges électriques et de leurs formes. L hémoglobine A est plus rapide. Pourtant elle possède une masse molaire plus importante. Ce n est donc pas le critère dominant. L hémoglobine A porte une fonction COOH supplémentaire : COOH " COO + H+ Elle migre plus vite car la migration se fait vers l anode. #NB#: la différence de migration est très faible. ORDALAB PARC UDEOR 5 Avenue des Grenots 950 ETAMPE FRANCE Tél. : Fax : Mail : info@sordalab.com

9 Page 9/0 Avec les dépôts réalisés, les élèves peuvent reconstituer l arbre suivant et prédire les génotypes possibles pour l enfant 7: 2 Hb A/ Hb Hb A/ Hb 4 6 Hb A/ Hb A Hb / Hb Hb A/ Hb 3 Hb A/ Hb 7 Hb / Hb ou Hb A/ Hb FICHE ECURITE (guide non exhaustif) L acide acétique est un produit dangereux qui nécessite le port de gants, de lunettes et d une blouse. Le tampon tris hippurate et les hémoglobines ne requièrent pas de précautions d utilisation particulières. Nous vous recommandons tout de même de manipuler ces avec des gants pour éviter tout danger. Le colorant rouge de ponceau se manipule avec blouse, gants et lunettes. La solution de transparisation est toxique du fait de la présence de méthanol et de diacide acétone dans la composition. Produit Pictogramme et risques normalisés Rouge Ponceau Nocif de contact avec la peau Laver immédiatement la peau avec une grande quantité d eau claire pendant au moins 5 minutes. Laver les vêtements contaminés avant de les utiliser. Actions à mener en cas d inhalation de projection dans les yeux Emmener la personne à Rincer l air frais. i elle ne immédiatement respire pas, la mettre les yeux à sous respirateur artificiel. grande eau i la personne respire pendant au avec difficulté, lui moins 5 administrer de l oxygène minutes en et appeler un médecin. séparant les paupières. ORDALAB PARC UDEOR 5 Avenue des Grenots 950 ETAMPE FRANCE Tél. : Fax : Mail : info@sordalab.com d ingestion i la personne est consciente, lui rincer imméditement la bouche avec de l eau. Appeler un médecin.

10 Page 0/0 FICHE CONERVATION Le flacon noté «tampon tris hippurate» doit être stocké à température ambiante et est conservable jusqu à la date indiquée sur l étiquette boîte de 0 bandes d acétate de cellulose 57x40 mm est stocké à 4 C et est conservable 6 mois Le tampon tris hippurate en solution se conserve à température ambiante ou 4 C pendant un mois. La solution de rouge ponceau se conserve 6 mois à + 4 C à l abri de la lumière. Les bandes d acétate, une fois le paquet ouvert, se conservent mois à + 4 C Après transparisation, les bandes se conservent aussi longtemps que nécessaire, à température ambiante. (La solution de transparisation se conserve an à température ambiante) sachet noté O de 2 microtubes à stocker de 20 C contenant : o microtube à bouchon rouge de 300µL de solution d hémoglobine A est conservable 6 mois o microtube à bouchon violet de 300µL de solution d hémoglobine est conservable 6 mois La solution d hémoglobine et A se conservent pendant 6 mois à 20 C La solution de transparisation est conservable à température ambiante pendant plusieurs mois. "" ATTENTION "" : les températures de conservation doivent être respectées pour que les durées de conservation soient applicables. FICHE TRI ET RECUPERATION Les hémoglobines et le tampon tris hippurate peuvent être jetés à l évier. Le rouge Ponceau peut être jeté à l évier mais surtout pas dans un contener contenant des bases fortes ou des acides forts. L acide acétique doit être jeté dans les conteners à acide. Les bandes sont jetables à la poubelle. La solution de transparisation est dangereuse et doit absolument être jetée dans les bidons de récupération des solvants organiques. Les tubes en plastique non contaminés avec des produits dangereux peuvent être jetés dans les bacs de récupération du plastique. ORDALAB PARC UDEOR 5 Avenue des Grenots 950 ETAMPE FRANCE Tél. : Fax : Mail : info@sordalab.com