Microscope confocal à balayage laser. Microscopie photonique. lumière Laser Objectif. Miroir dichroïque Source de. Filtre confocal.

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1 Microscope confocal à balayage laser Photo-détecteur Filtre confocal Plan image Image reconstruite point par point par balayage laser Miroir dichroïque Source de lumière Laser Objectif Obtention directe de coupes optiques sans information parasite des plans voisins Plan focal

2 filtre d'excitation diaphragme confocal photodétecteur Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Schéma de principe du microscope confocal source laser plan focal rayons hors focale (pinhole) filtre d'émission échantillon objectif miroir dichroïque rayons hors focale

3 plan focal XY vue XZ plan focal XY vue XZ Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Formation de l image Microscopie conventionnelle Microscopie confocale I I X X

4 Microscopie confocale - PSF réelle Bille diamètre 200nm Imagée avec objectif 63x 1.4NA échantillonnage 100x100x100nm

5 Comparaison Conventionnel/Confocal 5µm Image 256x256 Fluorescence conventionnelle Image 256x256 Fluorescence confocale

6 Y Description des données 3D Pile de sections numérisées Volume numérique X voxel Connexité (voisinage) dans un volume numérique facette commune arête commune sommet commun Z

7 Galerie de sections optiques

8 Microscopie 3D -Sections orthogonales

9 Profondeur d'observation limitée par les propriétés des objectifs Atténuation du signal lumineux par l'optique du microscope Déformations dues aux différences d'indice de réfraction Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Limites des méthodes d'acquisition en microscopie confocale Modes de microscopie limités Photodégradation des fluorochromes Absorption de la lumière par le specimen Bruits photonique et électronique

10 Amélioration du rapport signal-bruit Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Fluorescence - Nature du bruit photonique Bruit poissonnien Bruit gaussien 1.00 µ σ Source 3 photons/ms PIXELS temps d intégration 1 ms

11 Amélioration du rapport signal/bruit 5µm Image 256x256 : 1 trame durée : 0,5 s/trame Moyennage de 4 trames Moyennage de 32 trames

12 60 5,0 Université Joseph Fourier Yves Usson ,0 3,0 2,0 Absorption de la lumière par le specimen Vue latérale brute (noyaux de cellules myocardiques) Numéro de section Vue latérale après compensation par une fonction log-logistique (Rigaut et al., 1991) Numéro de section

13 Photodégradation de la fluorescence Photodégradation d'une préparation homogène 250 Photodégradation en fonction du temps d'exposition Gel de F.I.T.C Les molécules de fluorochrome situées dans le double cône de lumière sont altérées Temps en min.

14 o xy h xy i xy Plan image Disque de Airy Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Formation de l image par une lentille Convolution par un filtre passe-bas i xy = h xy o xy Source ponctuelle rayons diffractés -1 ô xy = h xy i xy Restauration par déconvolution

15 Restauration de la résolution par déconvolution Spermatozoïde démembrané de Xenopus laevis incubé dans un extrait d'oeuf Etude de la cinétique de recondensation chromosomique (1h30) Marquage YOYO (de la Barre & Dimitrov) 2 1 Sections XY Données Sections XZ Reconstructions 2 1 Données restaurées

16 Reconstruction surfacique - Seuillage objet

17 Codage en distances à l observateur Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Reconstruction surfacique - codage de distance axe Z (profondeur) Valeurs de profondeur Voxels "objet" Volume 3D Projection dans le Z-buffer Construction d une topographie

18 Reconstruction surfacique - Tampon Z Z Y X Z-buffer Carte de distance

19 Modèle simplifié d'illumination par diffusion et réflexion I = I0 (k1 + k2 cos α) k1 constante de lumière diffuse ambiante k2 constante de lumière réfléchie avec k1 < k2 et k1 + k2 = 1.0 Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Reconstruction surfacique - Modèle d illumination Direction d'observation & lumière incidente Normale à la facette α α angle entre la normale à la surface et la lumière incidente I0

20 direction de visualisation Z-buffer Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Reconstruction surfacique - Modèle d illumination Z Y X d z d y N Normale à la surface dans l'espace voxel d z d x d z ( N = Gz,, -1) d x d z d y Z-buffer

21 Reconstruction surfacique - Modèle d illumination Modèle d'illumination diffuse Prise en compte du marquage fluorescent et ajout d'ombrages Codage en distances et ajout d ombrages

22 Microscopie confocale - Visualisation 3D Reconstruction par suivi de rayons rayons observateur écran de visualisation volume 3D

23 Reconstruction par suivi de rayons - Transparence Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Microscopie confocale - Visualisation 3D Règle de transparence I P k = α k V k + (1-α k ) I ij { k-1 αk = f(v k ) I k est l'intensité collectée sur le chemin du rayon, I k-1 la valeur précédente; α k est le coefficient de transparence qui dépend de V k, la valeur du voxel courant pij rayon observateur écran de visualisation volume 3D