Start Pane. Microscopie confocale

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1 Start Pane Microscopie confocale

2 Microscopie Confocale Introduction Historique Fluorescence Résolution Microscopie Confocale Applications et exploitation des données Immunomarquages Réflection Time-Lapse Etudes spectrales F-Techniques FCS/FLIM Conclusion 2

3 Microscopie Confocale Introduction Historique Fluorescence Résolution Microscopie Confocale Applications et exploitation des données Immunomarquages Réflection Time-Lapse Etudes spectrales F-Techniques FCS/FLIM Conclusion 3

4 Historique XVII : naissance de la microscopie photonique (découverte d agents pathogènes : tuberculose, peste..) 1957 : Naissance de la microscopie confocale avec Marvin Minsky conjuguer le plan de la source lumineuse et celui de l image filtrée avec un diaphragme 1980 : Émergence de la microscopie confocale besoins en biologie cellulaire + progrès technologiques (source laser, développement de l électronique, informatique ) 4

5 Historique Question biologique? Structures Localisations dynamiques 5

6 Historique NECESSITE Grossissement: voir des petits détails Résolution Contraste : pouvoir distinguer 2 éléments très proches : possibilité de disinguer un élément d un autre 6

7 Historique Microscopes de fluorescence à champ large (Wide field fluorescence microscopes) Capteurs CCD à haute résolution et sensibilité Déconvolution possible pour éliminer les signaux hors plan focal Fondamentale, video-microscopie rapide Microscopes confocaux à balayage laser (Confocal laser scanning microscopes) Détecteurs : photomultiplicateurs Diaphragme (pinhole) confocal pour sélectionner la fluorescence émise dans le plan focal, colocalisation, 3D Microscopes à balayage laser et excitation bi- (multi-) photonique (Two- (or multi-) photon laser scanning microscopes) Avantages : excitation restreinte au volume focal, résolution temporelle 7

8 Microscopie Confocale Introduction Historique Fluorescence Résolution Microscopie Confocale Applications et exploitation des données Immunomarquages Réflection Time-Lapse Etudes spectrales F-Techniques FCS/FLIM Conclusion 8

9 Fluorescence Principe d excitation / émission E = hn = hc/l Prof. Alexander Jablonski,

10 Fluorescence Principe du filtrage de la lumière 10

11 Fluorescence Application au microscope : dichroïque Dichroic spectral position 11

12 Fluorescence Prof. Ploem s invention 12

13 Fluorescence 13

14 Fluorescence Exemple de lampes à fluorescence 14

15 Microscopie Confocale Introduction Historique Fluorescence Résolution Microscopie Confocale Applications et exploitation des données Immunomarquages Réflection Time-Lapse Etudes spectrales F-Techniques FCS/FLIM Conclusion 15

16 Résolution XY Plane Airy disc D0 = 1.22 * l / NA (lateral) Limited by Diffraction XZ Plane 16

17 Résolution Point Spread Function (PSF) 17

18 Résolution Res = 0.61*l / NA 18

19 Résolution 19

20 Résolution 20

21 Résolution 21

22 Résolution Conventional Confocal Res = 0.61*l / NA Res(xy) = 0.4*l / NA Res = 2*l / NA 2 Res(xz) = 1,4l /NA 2 22

23 Résolution Basement membrane labeled with cy2 (green) Neurons labeled with cy3 (red) 23

24 Microscopie Confocale Introduction Historique Fluorescence Résolution Microscopie Confocale Applications et exploitation des données Immunomarquages Réflection Time-Lapse Etudes spectrales F-Techniques FCS/FLIM Conclusion 24

25 Microscopie confocale 25

26 Microscopie confocale Sectionnement optique de l échantillon Suppression de la fluorescence en dehors du plan focal Amélioration de la résolution latérale et axiale Amélioration du contraste 26

27 Microscopie confocale 27

28 Microscopie confocale AOTF : Acouto Optical Tunable Filter Sélection de la longueur d onde d émission Modulation de l intensité Couplage par fibre optique 28

29 Microscopie confocale Beam splitter Miroir dichroïque AOBS 29

30 Microscopie confocale Scanner en XY Comment faire de l imagerie point par point? Miroirs rotatifs (galvanomètres) Zoom? Amplitude de balayage Limites sur le vitesse de balayage : récupération des photons et effets photo-induits 30

31 Scanning the Sample 31

32 Microscopie confocale Sectionnement optique Imagerie plan / plan en XY Echantillonnage : Critère de Nyquist Taille pixel 2,3 Res Déplacement en Z du microscope Reconstruction 3D 32

33 Microscopie confocale Pinhole Ouverture fonction de : l : longueur d onde NA : ouverture numérique Résolution optimale Intensité de fluorescence maximale 33

34 Microscopie confocale Pinhole 34

35 Microscopie confocale Filtrage spectral Cascade de dichroïques Système spectral 35

36 Microscopie confocale Détecteur Gain variable 0 à 1250 V Echantillonage Quantification Transformation du signal en niveau de gris 8 bits 12 bits... 36

37 Microscopie confocale Lumière Tube Photo-Multiplicateur e - GAIN (mv) Signal/Bruit Intensité voltage 37

38 Microscopie confocale : Numérisation 0 29 Pixel CAN Converter 8bit / 12 bit (= 256 / 4096 Greyvalues) Y 512 Frame Store Data Files (e.g. TIF) X

39 Microscopie confocale : pixelisation Travailler avec une taille optimal de pixel 800x800nm 200x200nm Resel 100x100nm 50x50nm Théorie de Nyquist : 2,3 pixels /resel 39

40 Microscopie confocale 40

41 Microscopie confocale 41

42 Microscopie confocale Sectionnement optique de l échantillon Suppression de la fluorescence en dehors du plan focal Amélioration de la résolution latérale et axiale Amélioration du contraste 42

43 Microscopie Confocale Introduction Historique Fluorescence Résolution Microscopie Confocale Applications et exploitation des données Immunomarquages Réflection Time-Lapse Etudes spectrales F-Techniques FCS/FLIM Conclusion 43

44 Immunohistochimie INRA Versailles IJPB LCC INRA Versailles IJPB LCC 44

45 Immunohistochimie INRA Versailles IJPB LCC 45

46 Immunohistochimie INRA Versailles IJPB LCC 46

47 Immunohistochimie INRA Versailles IJPB LCC 47

48 Immunohistochimie Embryon Drosophile l exc = 405 nm l ém. = l exc = 488 nm l ém. = l exc = 543 nm l ém. = nm Obj. 40X, 1.25 Zoom = 4,7 l exc = 633 nm l ém. = nm T. Lecuit, Luminy, Marseille 48

49 Immunohistochimie 49

50 Immunohistochimie 50

51 Immunohistochimie Etude de colocalisation 51

52 Réflexion Etude de surface 52

53 Réflexion 53

54 Time-Lapse Arabidopsis thaliana First channel: Cell wall in reflection. 2 & 3 channel: Monitoring mitochondrial (GFP-green) and plastid (autofluorescence-red) movement. 22 fps Courtesy of Prof. Dr. D. Menzel, Institut für Zelluläre und Molekulare Botanik Zellbiologie der Pflanzen, Bonn University. 54

55 Fluorescence Recovery After Photobleaching 55

56 Fluorescence Recovery After Photobleaching Région Bleachée I= f(t) Région adjacente à la région Bleachée lexc. = 488 nm Obj. 63X, 1.32 Zoom = 4,6 Dt = 823 ms T. Lecuit, Luminy, Marseille 56

57 Fluorescence Resonance Energy Transfer 57

58 Fluorescence Resonance Energy Transfer Bleaching de l accepteur Etude des modifications des interactions moléculaires Proximité donneur-accepteur Å Donor pre-bleach Acceptor pre-bleach Augmentation de l intensité de fluorescence du donneur Donor post-bleach Acceptor post-bleach 58

59 Etudes Spectrales Spectre d émission de fluorescence 59

60 Etudes Spectrales Spectres d émission de fluorescence 60

61 Etudes Spectrales Séparation spectrale 61

62 Etudes Spectrales Séparation spectrale FITC/TxR sample 2 channel recording: Detection bands fine tuned No gaps between bands High efficient prism High efficient PMTs AOBS applied 62

63 Etudes Spectrales FITC The total of all light collected from FITC molecules will be distributed into both channels. We assume here: ¾ of all FITC emission go into the green channel (G) ¼ of all FITC emission goes into the red channel (R) 63

64 Etudes Spectrales TxR The total of all light collected from TxR molecules will be distributed into both channels. We assume here: 1/5 of all TxR emission goes into the green channel (G) 4/5 of all FITC emission goes into the red channel (R) 64

65 Etudes Spectrales Both dyes In a real experiment, we will have both dyes simultaneously in the sample and therefore get signals from both dyes in both channels. 65

66 Etudes Spectrales A calculated measurement G R FITC FITC TxR TxR 66

67 Etudes Spectrales Unmixing is: Solving sets of n linear equations with n unknowns. First proven records of solutions go back some 4000 years (Egypt) For a reference see: - Mathematik - Leitprogramm Lineare Gleichungssysteme.htm 67

68 Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy FLIM 68

69 Fluorescence Lifetime IMaging FLIM 69

70 Fluorescence Correlation Spectroscopy Lien entre la diffusion de molécules et la fluctuation de l intensité de fluorescence dans un volume donné Concentration Coefficient de diffusion Constante de dissociation 70

71 Principe de l excitation à deux photons Processus de fluorescence en excitation à un photon Processus de fluorescence en excitation à deux photons hv ex S 1 Perte d énergie vibrationnelle hv em hv ex 2 S 1 hv em E = hc/l S 0 Fluorescence L énergie d un seul photon est absorbée par un fluorochrome pour passer d un état d énergie basal (S 0 ) à un état excité (S 1 ) hv ex 2 S 0 Deux photons d énergie deux fois plus faible (et donc de longueur d onde deux fois plus élevée) sont absorbés par la molécule dans un laps de s Les caractéristiques du rayonnement émis par le fluorochrome en excitation à deux photons sont inchangées 71

72 En microscopie à balayage laser à deux photons, l excitation est strictement restreinte au volume focal Plan focal Fluorescence suite à une absorption à un photon Fluorescence suite à une absorption à deux photons 72

73 Leica TCS STED 73

74 Multicolor Image of the NMJ Bruchpilot confocal Liprin-a STED 1 µm Courtesy of Prof. Stephan Sigrist 500 nm 74

75 Resolution Increase by STED: Pure Physics! STED is pure physics! But you can add mathematics on top! confocal STED + deconvolution 75

76 Optical pathway Principle of STED microscopy 1. Excitation laser 2. Depletion laser 3. Original Excitation spot 4. Depletion (STED) ring 5. Effective excitation spot 6. Confocal pinhole 7. Detector Confocal Profile STED Profile y y x x Formation of presynaptic active zone (Liprin) Courtesy S. Sigrist, Wuerzburg x / nm Typical lateral resolution: 200x200 nm x / nm Typical lateral FWHM in STED is 90x90 nm 76

77 ACTIN Confocal STED MICROTUBULES Confocal STED 77

78 The task Increase xy resolution in fluorescence microscopy over classical Abbe limits: d xy l 2 n sina FWHM confocal, xy : 200 nm BUT: For numerous applications a higher resolution is required -without the efforts and restrictions of an Electron microscope!- SOME EXAMPLES: Neurophysiology (Synapse-cell-interactions, motoneurons etc.) Endocytotic processes Microtubules of a Vero cell Virus biology (Malaria, AIDS) Pathology (Multiple Sclerosis etc.) 78

79 The task Increase xy resolution in fluorescence microscopy over classical Abbe limits: d xy l 2 n sina FWHM confocal, xy : 200 nm BUT: For numerous applications a higher resolution is required -without the efforts and restrictions of an Electron microscope!- SOME EXAMPLES: Neurophysiology (Synapse-cell-interactions, motoneurons etc.) Endocytotic processes Microtubules of a Vero cell Virus biology (Malaria, AIDS) Pathology (Multiple Sclerosis etc.) 79

80 Applications Example - Cell Biology STED F-Actin -Tubulin Confocal Nice for demonstrational purposes 80

81 Resolution enhancement by STED: Excitation spot Depletion ring Overlaid spots Effective spot FWHM ca. 250nm FWHM ca. 90nm STED STED STED confocal STED STED STED STED STED STED A threefold improved resolution can make 9 spots out of 1! 81

82 Microscopie Confocale Introduction Historique Fluorescence Résolution Microscopie Confocale Applications et exploitation des données Immunomarquages Réflection Time-Lapse Etudes spectrales F-Techniques FCS/FLIM Conclusion 82

83 Conclusion Technique d imagerie à haute résolution Large domaine d application Exploitation des images brutes Système commercial entièrement motorisé Système évolutif Ca y est vous êtes libres!!! 83