PNV Travaux dirigés n 1

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Irène St-Gelais
il y a 8 ans
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1 PNV 2009 Travaux dirigés n 1 Le maintien du statut hydrique est une contrainte majeure pour la croissance et le développement des plantes terrestres. Ces organismes peuvent en particulier être soumis à des conditions environnementales sévères comme le froid, la sécheresse ou la salinité des sols qui mettent en danger ces équilibres primordiaux. Le rôle crucial que jouent les membranes cellulaires dans le maintien du statut hydrique des plantes a été mis en avant par la découverte des aquaporines. Ces protéines forment des canaux qui facilitent la diffusion de l eau ou de petits solutés neutres au travers des membranes. L enjeu des travaux est de développer de nouvelles approches qui permettront de comprendre la fonction intégrée des aquaporines dans la plante. Plus largement, il s agit de comprendre les mécanismes de contrôle des flux d eau dans la plante, au cours du développement ou en réponse à des contraintes environnementales. FIG 1 : L étude des aquaporines apporte une voie d entrée unique pour appréhender les bases moléculaires et cellulaires de l équilibre hydrique chez les plantes. On sait désormais que ces canaux membranaires contribuent de manière majeure à l absorption d eau par les racines et qu ils permettent une modulation de la perméabilité hydrique de la racine selon le contexte physiologique ou en réponse à des stimuli de l environnement. a- Effet de l apport de HgCl 2 dans le milieu au niveau racinaire chez des plantes de tomate sur le flux de sève brute. b- Effet de l apport de β-mercaptoethanol à 2-50 mm sur ces mêmes racines. Commentez les effets des deux composés chimiques. Proposer des hypothèses raisonnables sur le principe d action de ces composés. FIG 2 : Une micro-sonde de pression est utilisée afin de mesurer directement les pressions cellulaires de la zone corticale de cellule d oignon ; les différentes expériences sont générées par une première phase d injection de liquide dans ces cellules, suivit d une seconde phase de prélèvement de liquide dans ces cellules. Commentez les mesures cellulaires, la forme et le temps de relaxation des pressions cellulaires dans les différents cas de figures A à F (A : témoin de référence, B à F : action de différents composés). Proposez des hypothèses! Cette expérience confirme t elle la FIG1? FIG 3 : Un ensemble d approches a été développé permettant de caractériser la fonction des ces aquaporines de plantes, protéines membranaires de 29kDa. Ainsi, des aquaporines clonées peuvent être exprimées fonctionnellement en ovocytes de Xénope. Des mesures de transport d eau sont réalisées, la perméabilité hydrique de cellules entières ou de racines est mesurée à l aide d une micro-sonde de pression cellulaire. Commentez les effets sur les changements de volume relatif à l injection d eau ou de divers gènes codant des aquaporines putatives. FIG 4 : Afin de mieux appréhender le rôle de ces protéines dans les différents tissus végétaux, la construction de plante mutée pour l expression de certaines aquaporines a été entreprise. Vous pouvez observer, sur la figure 4, l absence d expression du gène pip2 chez deux plantes portant une mutation importante dans ce gène. Commentez la figure avec l enseignant?

Le rôle crucial que jouent les membranes cellulaires dans le maintien du statut hydrique des plantes a été mis en avant par la découverte des aquaporines.

2 FIG 5 : Les différents plantes (WT= sauvage ou pip2;x-y=mutant pip2) sont analysé de part leur caractéristique respective de conductance hydraulique (Lp = en % ou en m. s -1. Pa -1 ; pour A 1 et B) et l osmolarité de la sève prélevé dans un système de chambre à pression exerçant entre 0,16 et 0,32 MPa de pression jusqu à l obtention d un flux de sève régulier (A 2 ). En B, les valeurs du rapport entre le flux de sève et la force osmotique sont présentés. Commentez les graphiques. Qu en concluez vous? FIG 6 : L étude des gènes codant les protéines les différentes aquaporines ont permis d envisager des stratégies d études alternatives comme la surproduction des ces gènes dans des plantes modèles. Des extraits protéines enrichies en fraction membranaire sont déposés sur une gel de séparation par électrophorèse (Fig 6B) et l expression de la protéine PIP1b est analysé par la technique de Western blotting (Fig 6A). Analysez les résultats des figures et commentez? Quelles plantes transgéniques seront les plus adapté pour la poursuite de l étude? FIG 7 et 8: Les données des différents paramètres physiologiques des plantes sauvages (WT) et mutants de surexpression sont présentés sur ces différents graphiques dans des conditions de croissances idéales en serre, humidité constante et éclairement constant. Donnez votre analyse des différents graphiques et concluez quant à l utilité des aquaporines dans les plantes? A priori, ces résultats vous laissent t il à penser à une action bénéfique de la surproduction d aquaporine? FIG 9 : Ces mêmes plantes sont exposées à un arrêt brutal de l arrosage induisant ainsi de fait un stress hydrique intense. Commentez les résultats et comparez le comportement des plantes en absence d arrosage? Commentez le rôle des aquaporines dans le transport d eau chez les plantes? Bibliographie : Aharon et al., The Plant Cell (15), Javot et al., The Plant Cell (15) Javot et Maurel, Annals of Botany (90) Barrowclough et al., Journal of Experimental Botany (51)

En B, les valeurs du rapport entre le flux de sève et la force osmotique sont présentés. Commentez les graphiques. Qu en concluez vous?

3 Figure 1 : Flux de sève β-mercapto Temps (heures) Figure 2 : Mesure de la pression cellulaire (MPa) en fonction du temps (s). Non traité 25µM HgCl 2 50µM HgCl 2 50µM HgCl 2 puis 5mM β-mercapto 5mM β- mercapto 100µM HgCl 2

4 Figure 3 : 1,5 Volume relatif Ovocyte de Xénope 1 Structure protéique des Aquaporines Figure 4 : ADN génomique ADN codant Localisation de l expression de PIP2 Gène pip2 Gène Témoin Conductivité hydraulique relative (%) Figure 5 : A 1 A 2 Osmolarité de la sève B Rapport flux de sève et force osmotique relative (%)

de PIP2 Gène pip2 Gène Témoin Conductivité hydraulique relative (%) Figure 5 :

5 Stabilité membranaire des cellules (ratio EC) D Stabilité membranaire des cellules (ratio EC) Fluorescence Chlorophylle (Fv/Fm) Taux de photosynthèse Temps de flétrissement (min) a. b. Taux de transpiration b. a. a. Figure 9 : Figure 8 : Coloration du gel de protéine Poids sec des feuilles (%) b. Western a. Ratio racine / tige Masse moléculaire (kd) Figure 6 : Figure 7 :

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