Greffe de CSH: Aspects biologiques et cliniques. Enseignement complémentaire_l3 Janvier 2014 Roch Houot & Karin TARTE

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1 Greffe de CSH: Aspects biologiques et cliniques Enseignement complémentaire_l3 Janvier 2014 Roch Houot & Karin TARTE

2 Concept de CSH Pluripotentialité Autorenouvellement Capacité de homing Capacité à reconstituer une hématopoïèse complète Expression de CD34: glycoprotéine fonction inconnue Exprimée par: CSH Progéniteurs engagés dans la différenciation hématopoïétique Cellules endothéliales Cellules CD34= 0,5% des cellules médullaires

3 Aspects thérapeutiques des CSH R «Support» ou «antidote» après un traitement myéloablatif, utilisé dans le traitement des hémopathies malignes Autogreffe: les CSH sont les cellules du patient lui-même, prélevées avant le traitement, congelées et réinjectées ensuite après le traitement myéloablatif Allogreffe: les CSH proviennent d un donneur allogénique, HLA compatible Effet support mais surtout, effet IMMUNOLOGIQUE lié à la disparité donneur receveur

4 Interêt d un traitement myéloablatif? R Pathologies hématologiques malignes Ex: leucémies aigues Chimio d induction C K Ttt myéloablatif C K RC Chimio de consolidation n 1 Chimio de consolidation n 2 rechute

5 Prélèvement des CSH R 3 modalités: Prélèvement de Moelle osseuse Prélèvement de cellules souches périphériques par cytaphérèse Après mobilisation ( passage des CSH de la MO vers le sang périphérique) Sang de cordon

6 Prélèvement de CSH médullaires R Au bloc opératoire Sous anesthésie générale Prélèvement au niveau des épines iliaques postéro supérieures bilatérale Jusqu à 1 litre de MO Transfusion autologue si besoin

7 Prélèvement de CSH médullaires R

8 Prélèvement de CSH périphériques (CSP) R Nécessite une MOBILISATION ie un passage des CSH du compartiment médullaire vers le compartiment sanguin Surtout par G-CSF (Granulocyte Colony stimulating factor) En sortie d aplasie Après une chimiothérapie Lors d une myélémie Contrôle du nombre de CD34 circulants avant le prélèvement

9 G-CSF Système nerveux sympathique β-adrenergique NA? Macrophage Plerixafor VCAM VLA-4 CXCL12 CXCR4 CSH Cellules stromales Progénitrices perivasculaires G-CSF cible la niche AMD3100 cible les CSH

10 Prélèvement de CSP par cytaphérèse

11 Manipulations in vitro et congélation des CSH Au centre de thérapie cellulaire de l'efs

12 Greffon de «CSH» Ex: greffon issu d un donneur allogénique Le greffon contient des CSH mais aussi des cellules immunocompétentes: lymphocytes T, NK, DC, lymphocytes B,

13 R

14 Concept de greffe allogénique R BUT : détruire la moelle osseuse du receveur (et les cellules tumorales résiduelles) et la remplacer par un greffon prélevé sur un donneur : effet MYELOABLATIF Effet IMMUNOLOGIQUE par conflit entre les cellules lymphocytaires T du donneur et les cellules du receveur : Ø effet bénéfique sur les cellules tumorales Ø effet néfaste: maladie du greffon contre l hôte: GVH

15 Greffon allogénique: choix du donneur Respect de la compatibilité dans le système HLA Compatibilité HLA classe I (A, B, C) et classe II (DP, DQ, DR) Le donneur doit être HLA identique en A, B, C, DRb1, DQb1 (compatibilité 10/10) Chaque différence sur un Ag HLA accroît le risque de rejet et de GVH Compatibilité du groupe sanguin pas nécessaire R Origine des donneurs Donneur familial: frère ou sœur: greffe GENOIDENTIQUE Donneur non apparenté (fichier international): greffe PHENOIDENTIQUE Donneur jumeau homozygote: greffe SYNGENIQUE Sang de cordon

16 Principe d une allogreffe de CSH R 1- Destruction de l hématopoïèse résiduelle et immunodépression de l hôte pour éviter le rejet Masse tumorale CONDITIONNEMENT 2- Transfusion de CSH (médullaires ou périphériques ou issues du sang placentaire) CSH 3-reconstitution hématologique (période d aplasie) 4- reconstitution immunologique

17 Prise en charge des patients R En phase d aplasie (15 à 30jrs) Chambre stérile Risque infectieux +++ Régles hygiène stricte Support transfusionnel Surveillance et traitement GVH Au-delà de 30 jrs Surveillance chimérisme Infections tardives Surveillance et Ttt GVH Évaluation réponse hématologique

18 Complications précoces R 1. Aplasie risques infectieux Toxicité du conditionnement Mucite fréquente expose à la dénutrition, aux surinfections à Candida et à Herpes virus Défaillance multiviscérale, pneumopathie interstitielle Endoxan : insuffisance cardiaque, cystite hémorragique Toxicité hépatique 3. Les conflits immunologiques Rejet de greffe (< 5 %) Maladie du greffon contre l hôte ou GVH

19 Aspects immunologiques de la greffe: GVH/GVL GVH: Graft Versus Host Disease Complication majeure de la greffe GVL: Graft Versus Leukemia effect Effet immunologique antitumoral participant à l efficacité de la greffe

20 Immunologie de la GVH/GVL 3 conditions indispensables: Présence de cellules immunocompétentes dans le greffon Incapacité du receveur à rejeter le greffon (immunodépression) Présence chez le receveur d antigène étrangers au donneur Physiopathologie: 3 phases

21 GVH: les grands principes Phase 1: Dommages tissulaires + destruction tumorale Conditionnement (irradiation, chimio) DC de l hôte HLA mha (+/- spécifiques) Phase 2: Activation immunitaire LPS Cytokines et chimiokines inflammatoires Ag libérés par la mort cellulaire Lymphocytes du donneur TCD4 NK TCD8 B/plasmo Amplification Cytokines Cytotoxicité directe Anticorps Phase 3: Destructions tissulaires + Destruction des cellules tumorales résiduelles CPA du receveur

22 agvhd: les 3 étapes Etape 1 = tempête cytokinique Production de cytokines par lésions épithélium + libération de LPS et autres dérivés bactériens des muqueuses (TLR) Signal de danger pour APC donneur et receveur Présentation d Ag aux T du donneur

23 Alloantigènes et GVH CMH-match CMH-match: équivalent à la reconnaissance d un pathogène. reconnaissance de miha (polymorphisme allélique, SNP) reconnnus comme étrangers. Expression ubiquitaire ou spécifique CMH-mismatch: reconnaissance du CMH de l hôte (10% de T alloréactifs) _ GVHD++++

24 agvhd: les 3 étapes Etape 2 = Activation T GVH due aux Tαβ naifs (T mémoires ont un répertoire + restreint) A lieu dans les OLS Rôle fondamental des CPA du receveur (cellules + résistantes à l irradiation) dans l initiation de la GVH puis CPA du donneur pour l amplification Nécessité de CD4 et CD8 Différences/réponse classique Ag présenté par TOUTES les CPA et de façon permanente (Ag du soi) Chimérisme CPA hôte/donneur (donc présentation ET crossprésentation)

25

26 agvhd: les 3 étapes Etape 3 = Phase effectrice Cytokines solubles surtout TNF, IL-1 qui activent les macrophages tissulaires (polymorphismes des gènes de l IL-1 associés à la gravité de la GVHD) d où production de NO Lyse cellulaire par les TCD8 (Fas/FasL, perforine/granzyme)

27 Facteurs favorisant la GVH Intensité du conditionnement: ICT, Age du receveur Infections, statut CMV Compatibilité HLA - donneur apparenté - donneur. non apparenté - 1 locus incompatible - 2 locus incompatibles - greffe haplo-identique Ag mineurs d histocompatibilité : risque qd l homme recoit moelle d 1 donneuse mdc hôte (LC, DC intersticielles) Treg HLA mha Tγδ NK NKT Phase 2 Signal de danger pdc R Phase 1 LPS Cytokines inflammatoires (TNF, IL-1...) Phase 3 Chémokines inflammatoires (MIP-1, CXCL9...) TCD4 donneur TCD8 donneur MO donneur/hôte

28 GVH aiguë: aspects cliniques R Dans les 100 1ers jours post greffe 25 à 75% des cas 3 organes cibles de la phase effectrice: Peau: Éruption maculo-papuleuse extensive et prurigineuse Début : paumes des mains, plantes des pieds, cou +/- conjonctivite associée Toutes les formes intermédiaires possibles (érythème localisé Æ Lyell avec décollement bulleux) Foie Ictère Cholestase prédominante Nécrose hépatocytaire et insuffisance hépatocellulaire Tube digestif Souvent retardée Diarrhée +/- profuse +/- hémorragique Douleurs abdominales intenses +/- nausées, vomissements Échelle de gravité: Grades I à IV Mortalité non négligeable: 30%

29 Déplétion T des greffons? mdc hôte (LC, DC intersticielles) Phase 1 R Déplétion T du greffon Ø rechutes + fréquentes Ø non prise de greffe Ø infections Ø Lymphoproliférations B EBV HLA mha Treg NK Tγδ NKT Phase 2 Signal de danger pdc LPS Cytokines inflammatoires (TNF, IL-1...) Phase 3 Chémokines inflammatoires (MIP-1, CXCL9...) TCD4 donneur TCD8 donneur MO donneur/hôte Les lymphocytes T du greffon font partie de l intérêt thérapeutique de la procédure Ø effet GVL: Effet Graft Versus Leukemia

30 Greffes à conditionnement atténué R Allogreffe: immunothérapie ne nécessitant pas uniquement un conditionnement myéloablatif Diminuer toxicité du conditionnement Ttt immunosuppresseur suffisant pour permettre la prise de greffe Chimerisme mixte Avantage: extension des indications à des sujets + âgés (suppression de la toxicité limitante du conditionnement) Risque de GVH persiste Possibilité de DLI après greffe, en fonction du chimérisme

31 PTLD= preuve de concept 1% des allogreffes 11% des greffes T déplétées Dûs à la déplétion des T anti-ebv Pathologies très sévères, souvent mortelles

32 CTL anti-ebv B EBV T anti-ebv Efficacité clinique ++ dans PTLD (curatif ou préventif) Rooney et al. Blood 1998; 92:1549 Heslop et al. Nat Med 1996; 2:551 Aujourd hui = anti-cd20 (mais possibilité de résistance)

33 GVL: effet immunologique de la greffe 1- effet anti-tumoral + important chez les patients ayant une GVH - Lancet, 1978 : Remission of relapsed leukemia during a GVH reaction: a «graft versus leukemia reaction» in man? - NEJM 1979: Antileukemic effect of graft-versus-host disease in human recipients of allogeneic-marrow grafts 2- rechutes + fréquentes lors de greffes T-déplétées : mise en évidence de l effet GVL: obtention de rémission chez des patients atteints de LMC, en rechute après allogreffe, par injection de lymphocytes du donneur (DLI)

34 infusion des lymphocytes du donneur (DLI) Patient en rechute après allogreffe Injection de lymphocytes du donneur Ø rémission complète (RC) Ø effet immunologique DLI Conditions: absence de GVH et rechute à cinétique «lente» Bcr-abl allogreffe Rechute RC Seuil de détection

35 Ø But: Limiter la GVH sans perdre l effet GVL!!!

36 Greffes à conditionnement atténué R Allogreffe: immunothérapie ne nécessitant pas uniquement un conditionnement myéloablatif Diminuer toxicité du conditionnement Ttt immunosuppresseur suffisant pour permettre la prise de greffe Chimerisme mixte Avantage: extension des indications à des sujets + âgés (suppression de la toxicité limitante du conditionnement) Risque de GVH persiste Possibilité de DLI après greffe, en fonction du chimérisme

37 R

38 Prévention de la GVH? R Diminuer l intensité du conditionnement limiter les risques infectieux Meilleur choix du donneur Immunosuppresseurs en prophylaxie systématique inhibiteurs de calcineurine: Ciclosporine, Tacrolimus (ligands des immunophilines, impliquées dans les voies de transduction des signaux d activation des lymphocytes T; inhibition de la synthèse d IL2) Méthotrexate: antagoniste de l acide folique, apoptose des T4 et T8 activés Mycophénolate mofétil (CellCept ): interfère avec synthèse des purines ds les lymphos Sérum antilymphocytaire (préparés en injectant à des lapins ou des chevaux des préparations purifiées de lymphocytes xénogéniques) dans certaines indications

39 Ttt curatif de la GVH aiguë R Corticoïdes Sérum antilymphocytaire, parfois proposé en prophylaxie quand greffes à risque de GVH Anticorps monoclonaux anti-cd25 (Rα IL2): Leukotac, Zenapax anti-tnfα: Remicade GVH aiguë corticorésistante: >75% mortalité

40 Alternatives thérapeutiques

41 Prise en charge des complications de l allogreffe Immunité anti-infectieuse (CMV) T T NK B T Cellules du donneur d allogreffe TCR anti-cmv T Stimulation Ag CMV puis TRI des T spécifiques fonctionnels (IFN-γ pos ou TCRspé pos ) Patient avec infection CMV résistante 1. anti-cd45/anti-ifnγ 2. anti-ifnγ microbilles Réponse chez 15/18 patients Expansion T anti-cmv in vivo Pas d induction/aggravation GVHD Feuchtinger et al. Blood 2010; 116:4360

42 Modulation des T du greffon = introduction d un gène suicide Cellules du donneur Reconstitution immune + GVL Si toxicité (GVH) = administration de ganciclovir Introduction du gène HSV-TK (+/- marqueur mb) et expansion (anti-cd3) Sélection puis injection Peuvent persister 10 ans après injection et tjs polyclonaux mais délétions dans HSV-TK (Deschamps et al Blood 2007; 110:3842) 11/50 GVHD toutes contrôlées par ganciclovir Ciceri et al Lancet Oncol :489

43 Modulation des T du greffon = ciblage des miha

44 Modulation des T du greffon = ciblage des miha 14 miha exprimés spécifiquement par les cellules hématopoïétiques (généralement augmentés sur cellules tumorales) Nécessiter d identifier de nouveaux Ag Amplification in vitro de T spécifiques (CPA + miha) Avenir = transfert du TCR

45 Chimeric Antigen Receptor-Modified T cells (CARs) Stimulation (anti-cd3/anti-cd28) + CAR CD19 dans vecteur LTV/RTV T anti-cd19 TCR endogène CAR LYSE CD19 B tumoral (LLC, FL, autres lymphomes B) Très forte affinité (>>TCR) Pas de restriction au CMH et pas de compétition pour CD3/TCR endogène Pas besoin de corecepteurs Possible utilisation du TCR endogène (persistance/ag viraux) T autologues ou allogéniques (T donneur HSCT virus spécifiques) scfv anti-cd19 Molécules de costimulation (CD28/CD137) Molécule de signalisation (CD3ζ)

46 Injection de T exprimant un CAR 14 weeks Porter et al. NEJM 2011; 365:8 Kochenderfer et al. Nat Rev Clin Oncol 2013; 10: patients traités dans 6 essais cliniques Importance de la masse tumorale (E:T ratio) Nécessité d un préconditionnement Expansion ++ in vivo Efficacité clinique de type preuve de concept Side effects: syndrome de lyse/inflammation, on-target/ off-tissue (optimisation CAR,gène suicide ) 18 essais en cours en hémato-onco

47 Utilisation du mismatch KIR Notion de répertoire NK KIR KIR2DL1 KIR2DL2/ 3 KIR3DL1 KIR3DL2 Spécificité HLA Classe I HLA-C groupe 2 (Cw2, Cw4, Cw5...) HLA-C groupe 1 (Cw1, Cw3, Cw7...) HLA-Bw4 HLA-A3, HLA-A11 NK R act R inh = KIR cible Le receveur n exprime pas un ligand HLA cl I correspondant à un KIR inhibiteur du donneur

48 Les Récepteurs inhibiteurs HLA-B et C HLA-A, HLA-G Les Récepteurs activateurs Molécules du stress : Complexes immuns KIR HLA-E - MICA - MICB - ULBP CD16 «ADCC» NKG2A CD94 NKG2D ITIM ITAM NK

49 Ruggeri Immunol Rev :202 Ljunggren Nat Rev Immunol :329 EFS chez pts LAM à haut risque avec greffe haploidentique T déplétée Diminution de la GVH par destruction des DC du receveur + Effet GVL lié au KIR mismatch KIR-ligand match KIR-ligand mismatch

50 Les CSM Identifiées par Friedestein début 1970 Cellules adhérentes d allure fibroblastique formant des colonies (CFU-F) et capables de donner de l os Cellules Rares (10-2 à 10-4 dans la MO adulte) Pas de marqueur spécifique validé (# CSH) Retrouvées dans le tissu adipeux, le placenta, le sang de cordon + beaucoup de tissus Capables d auto-renouvellement et de forte expansion in vitro Multipotentes

51 Les CSM Moelle osseuse Gelée de Warthon Tissu Adipeux Ostéoblastes J10-J12 Adipocytes Adhérence Culture en - SVF/FGF2 - PL Chondrocytes T cells T cells + CSM Puissant effet immunosuppresseur et anti-inflammatoire non-hla restreint CFSE

52 Immunité Adaptative Treg Treg Treg TGFβ, shla-g CSM et immunorégulation: Survie Prolifération Différentiation IL-6, IL-10 B B B CCL2 PGE2 IL-6, IL-10 mécanismes Monocyte Différentiation CDi Survie Prolifération IFN-γ IFN-γ TNF-α T αβ T αβ T αβ IDO (inos, HO-1) shla-g, PGE2, IL-10, TGFβ Galectines Jagged-1 Maturation CDm IL-12 Activation T

53 CSM et immunorégulation: Neutrophile mécanismes Immunité Innée Survie Migration Burst oxydatif Macrophage IL-12 TNF-α IL1Ra PGE2 IL-6 TSG-6 IDO PGE2 shla-g NK NK NK IL-10 Prolifération Cytotoxicité IFN-γ IFN-γ TNF-α T γδ T γδ T γδ PGE2 IFN-γ TNF-α Survie Prolifération Cytotoxicité IFN-γ

54 Place des CSM dans la GVH Intérets: Reconstitution du stroma médullaire hématopoïétique Effet immunomodulateur susceptible de guérir +/- prévenir la GVH Preuve de concept: Enfant 3 ans GVHD stade IV CSM mère Le Blanc et al. Lancet 2004;363:1439

55 Place des CSM dans la GVH 25 enfants, 30 adultes GVHD stade III ou IV corticorésistantes>7j (60% resistants à + de 2 traitements immunosup) CSM identiques au donneur de CSH ou tierce-partie 3 rechutes mortelles, qq cas d infection mais survie chez rep>survie chez non rep Le Blanc et al. Lancet 2008;371:1579 Intérêt en prévention?

56 Les LTR Treg naturels CD4 pos CD25 hi Foxp3 pos Amplifiables par forte dose d IL-2 + signal TCR de type allogénique Tr1 producteurs d IL-10 amplifiables en présence d IL-10 Séparation GVH/GVL?

57 Conclusion/Perspective CSH Routine Peu de manipulation Tissu sain CSM TCD4 TCD8 NK Treg Manipulations +/- complexes (amplification CSM, amplification/activatin Treg) Virus Tumeur Peu de manipulation (DLI) Manipulations complexes (T spécifiques, T modifiés)

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