Professeur Joël LUNARDI

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1 Biochimie - Biologie moléculaire Chapitre 3 : La réplication du matériel génétique Professeur Joël LUNARDI MED@TICE PCEM1 - Année 2006/2007 Faculté de Médecine de Grenoble - Tous droits réservés.

2 Chapitre 3 I. Réplication de l ADN chez les procaryotes II. Réplication de l ADN chez les eucaryotes III. Réplication de l ADN mitochondrial IV. Réplication à partir d ARN

3 il n a pas échappé à notre attention que l appariement spécifique des bases dans l ADN, suggère un possible mécanisme de copie du matériel génétique J. Watson et F. Crick réplication conservative? réplication semi-conservative

4 mise en évidence expérimentale de la réplication semi conservative chez les bactéries par Meselson et Stahl (1957) 1. culture en milieu N 15 = ADN marqué «lourd» au N transfert et culture en milieu N 14 = ADN «mixte» 3. Poursuite de la culture en milieu N 14 = +

5 ADN parental ADN répliqué chaque nouveau double brin comportera un brin parental et un brin nouvellement synthétisé

6 I. La réplication chez les procaryotes 1. Origine de réplication (microscopie électronique: Cairns, 1962) ori C - 1 seule origine par chromosome : ori C - réplication bidirectionnelle - réplication rapide (20 à 100 min) - 1 séquence de terminaison

7 2. Phase d initiation Ori C Dna A 1. reconnaissance de la séquence d origine

8 2. Phase d initiation Ori C primosome Dna A Dna B (hélicase), Dna C Dna G (primase)... SSB 1. reconnaissance de la séquence d origine 2. formation du primosome, ouverture du double brin et stabilisation des brins

9 2. Phase d initiation Ori C primosome Dna A Dna B (hélicase), Dna C DNA primase... polymérase SSB 1. reconnaissance de la séquence d origine 2. formation du primosome, ouverture du double brin et stabilisation des brins 3. accrochage de l ADN polymérase

10 2. Phase d initiation Ori C primosome Dna A Dna B (hélicase), Dna C DNA primase... polymérase SSB 1. reconnaissance de la séquence d origine 2. formation du primosome, ouverture du double brin et stabilisation des brins 3. accrochage de l ADN polymérase 4. synthèse d une amorce ARN par la primase

11 3. Elongation L élongation nécessite: - ADN polymérases (activité de copie 5 3 ) : III > I, II - matrice formée par 1 simple brin, dntp, Mg ++ - amorce ARN avec OH libre en 3 - hélicases, topoisomérases... L élongation est mono directionnelle 5 3 : la synthèse est continue sur le brin «avancé» et discontinue sur le brin «retardé» origine de la réplication

12 3. Elongation L élongation nécessite: - ADN polymérases (activité de copie 5 3 ) : III > I, II - matrice formée par 1 simple brin, dntp, Mg ++ - amorce ARN avec OH libre en 3 - hélicases, topoisomérases... L élongation est mono directionnelle 5 3 : la synthèse est continue sur le brin «avancé» et discontinue sur le brin «retardé» Fourche 1 brin avancé origine de la réplication brin retardé

13 3. Elongation L élongation nécessite: - ADN polymérases (activité de copie 5 3 ) : III > I, II - matrice formée par 1 simple brin, dntp, Mg ++ - amorce ARN avec OH libre en 3 - hélicases, topoisomérases... L élongation est mono directionnelle 5 3 : la synthèse est continue sur le brin «avancé» et discontinue sur le brin «retardé» Fourche 1 brin avancé origine de la réplication amorces ARN brin avancé Fourche 2

14 3. Elongation L élongation nécessite: - ADN polymérases (activité de copie 5 3 ) : III > I, II - matrice formée par 1 simple brin, dntp, Mg ++ - amorce ARN avec OH libre en 3 - hélicases, topoisomérases... L élongation est mono directionnelle 5 3 : la synthèse est continue sur le brin «avancé» et discontinue sur le brin «retardé» Fourche 1 brin avancé amorces ARN origine de la réplication brin avancé Fourche 2

15 3. Elongation L élongation nécessite: - ADN polymérases (activité de copie 5 3 ) : III > I, II - matrice formée par 1 simple brin, dntp, Mg ++ - amorce ARN avec OH libre en 3 - hélicases, topoisomérases... L élongation est mono directionnelle 5 3 : la synthèse est continue sur le brin «avancé» et discontinue sur le brin «retardé» fourche de réplication n 1 brin avancé Fourche 1 origine de la réplication amorces ARN fourche de réplication n 2 brin avancé Fourche 2

16 3. Elongation L élongation nécessite: - ADN polymérases (activité de copie 5 3 ) : III > I, II - matrice formée par 1 simple brin, dntp, Mg ++ - amorce ARN avec OH libre en 3 - hélicases, topoisomérases... L élongation est mono directionnelle 5 3 : la synthèse est continue sur le brin «avancé» et discontinue sur le brin «retardé» fourche de réplication n 1 brin avancé brin retardé 1 Fourche 1 origine de la réplication brin avancé 1 brin retardé 2 fragment d Okasaki : ARN + ADN amorces ARN fourche de réplication n 2 brin avancé 2 brin avancé Fourche 2

17 clamp brin avancé primosome DNA hélicase DNA primase topoisomérase ADN pol finissant un fragment d Okasaki fragment d Okasaki SSB début du du prochain fragment d Okasaki fragment d Okasaki amorce ARN brin retardé - brin avancé : extension continue - brin retardé : extension discontinue du brin néosynthétisé par fragments d Okasaki

18 4. Terminaison finition du brin «ligation reconstruction digestion des fragments: des amorces» par ADN ligase ARN Pol + (RNAse I ATP (5 H 3 ) + ADNpolI) terminaison et décrochage de l ADN pol III : séquences ter et protéine TUS

19 II. La réplication chez les eucaryotes le mécanisme général est de celui des procaryotes la réplication a lieu pendant la phase S du cycle cellulaire présence de nombreuses régions (20 à chez l homme) capable de fixer le complexe de reconnaissance de l origine (ORC) et définissant des unités de réplication d 100 à 200 kpb: les réplicons. présence de «minichromosome maintenance proteins» (MCM) l activation de ORC/MCM est régulé par les cyclines et les «cyclin-dependent protein kinases» (voir cours de Bio Cellulaire)

20 1. Les ADN polymérases : localisation équivalent activité activité - facteurs procaryote exonucléase associés α noyau ADN Pol I initiation - primase, RPA (=SSB) β noyau réparation, finition - γ mitochondrie synthèse, réparation + δ noyau ADN Pol III synthèse, finition + PCNA, RFA,-C ε noyau ADN Pol II réparation + κ noyau liaison des cohésines? η,ι,ζ noyau réparation "by-pass"? θ, λ noyau réparation? élimination des amorces ARN par RNAse H et FEN1 pas d équivalent de séquence ter et de protéine TUS intervention de cohésines pour stabiliser les chromatides jusqu à l anaphase répartition aléatoire des histones entre les deux nouveaux double brins

21 2. La réplication des extrémités télomériques

22

23 brin avancé

24 brin avancé risque de digestion de l extrémité 3

25 l ADN des télomères contient des séquences répétées --GGGTTAGGG(TTAGGG) n TTAGGGTT --CCCAATCCC (AATCCC) n AATCCCAA télomérase à ARN et à activité réverse-transcriptase AAUCCCAA AATCCCAA GGGTTAGGGTT GGGGTT AAUCCCAA 1. Appariement de l ARN de la télomérase avec avec l l extémité Elongation 3. Translocation

26 l ADN des télomères contient des séquences répétées --GGGTTAGGG(TTAGGG) n TTAGGGTT --CCCAATCCC (AATCCC) n AATCCCAA télomérase à ARN et à activité réverse-transcriptase AATCCCAA GGGTTAGGGTTAGGGTTA ADN pol 1. Appariement de l ARN de la télomérase avec l extrémité 3 2. Elongation 3. Translocation 4. Formation d une structure III permettant la fixation de l ADN pol

27 3. La réplication est une cible thérapeutique psoralène, agents alkylants : lient les 2 brins d ADN intercalants : se fixent sur l ADN et bloquent les ADN pol bléomycine : endommage l ADN et inhibe la réparation novobiocine, acide nalidixique, ciprofloxacine, podophyllotoxines : inhibent la topoisomérase sarcomycine : inhibe les ADN pol I & II méthotrexate dntp analogues de nucléotides: 5-fluorouracile, cytosine arabinosine, 6-mercaptopurine AZT

28 III. Réplication de l ADN mitochondrial La réplication de l ADNmit circulaire utilise 2 origines de réplication, une ADN pol γ et fait intervenir une structure intermédiaire à 3 brins. D-loop origine de réplication du brin «lourd» O H fixation de l ADN polγ brin parental H origine de réplication du brin «léger» OL + Le déplacement du brin «lourd» démasque O L brin L parental + brin H néosynthétisé brin H parental + brin L néosynthétisé début de synthèse du brin L

29 IV. Réplication des rétrovirus : R U 5 U 3 R ARN + transcriptase inverse virus infectant gènes codant pour les protéines de la capside, la transcriptase inverse, l intégrase rétrotranscription ADN entrée dans le noyau et intégration dans ADN cellulaire transcription provirus ARNm traduction protéines de la capside transcriptase inverse + la transcriptase inverse du virus HIV est inhibée par l AZT, un analogue de nucléotide

30 ADNc et transcription réverse gène : ADN génomique exons ARN polymérase ARNm m 7 G AAAAA ADN polymérase ARN dépendante = Réverse Transcriptase ADNc = séquence d ADN exonique

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