Place de l anti-ccp dans le diagnostic de la Polyarthrite rhumatoïde

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1 UNIVERSITE MOHAMMED V- SOUISSI FACULTE DE MEDECINE ET DE PHARMACIE -RABAT- ANNEE : 2008 THESE N : 95 Place de l anti-ccp dans le diagnostic de la Polyarthrite rhumatoïde THESE Présentée et soutenue publiquement le 05/12/2008 PAR Mr. LAWAL Abdelaziz Olakédji Né le 11 MAi 1981 à Bopa (Bénin) Pour l'obtention du Doctorat en Pharmacie MOTS CLES : Anti-CCP -Diagnostic - PR. JURY Mr. Y. CHERRAH PRESIDENT Professeur de Pharmacologie Mme. C. BENABDALLAH RAPPORTEUR Professeur d Hématologie Mr. M. ADNAOUI Professeur de Médecine interne Mme. K. BENBOUAZZA JURY Professeur de Rhumatologie Mme. K. ESSAKALLI Professeur d Immunologie

2 Dédicaces Je dédie cette thèse : A l éternel mon Créateur, mon Dieu Pour tout ce qu il a fait dans ma vie. Les mots ne pourront jamais suffir pour remercier Dieu et lui montrer toute ma gratitude. A ma très chère maman Que ce travail soit pour vous le fruit de la première semence. Et que l éternel Dieu des armés vous garde et vous accorde la longévité afin que vous puissiez récolter les fruits des semences à venir. J ai cherché un peu partout minmin, j ai creusé sous la terre, j ai nagé sous l océan, j ai volé dans l air tout ça à la recherche de quelqu un qui pourrait juste, je dis bien juste ne serait ce qu un petit peu vous ressemblez, mais personne sur cette terre n a été trouvé. Seulement Dieu.

3 A toute ma famille A mon grand frère Anastase pour tous ces bienfaits, pour toutes ses nombreuses sacrifices que l éternel notre Dieu vous bénisse, vous et toute votre famille. Sisa, trouve ici le sentiment du travail accomplit au souvenir de toutes tes punitions qui ont aujourd hui porté leurs fruits, que l éternel que nous adorons tous te bénisse et te comble toi et ton enfant de tous ses bienfaits. China, que Dieu te bénisse également et te rends heureux et épanoui dans cette vie. A tous mes amis En l occurrence, Sangaré, benjamin, bobo, Sardou, que Dieu vous bénisse. Spécial dédicace à toute la promotion Nouhoum sangaré (Mali),Ndayirajigé benjamin (Burundie), Taminou younoussa (Niger) Abdoulaye baye (Niger), Hadiza (Niger), AG issa (Mali), Mac N gor faye (Sénégal), Fouad (Djiboutie), Tata Adama (Caméroun), gabrielle (Caméroune), Maiga Djeneba (burkina-faso), Ouedraogo Paulette (Burkina- Faso), Ouedraogo samiratou (Burkina-Faso), Yara Sandrine (Burkina-Faso)

4 Remerciements J adresse mes sincères remerciements : A notre Maître et Rapporteur de thèse Madame C. Benabdellah Professeur d hématologie Je suis très heureux de pouvoir vous exprimer ma reconnaissance et ma profonde gratitude pour tous les efforts que vous avez déployés afin que ce travail puisse aboutir. Vos précieux conseils ont grandement contribué à l élaboration de ce travail. Que Dieu vous bénisse. A notre Maître et Président de thèse Monsieur Y. Cherrah Professeur de pharmacologie Vous m accordez un immense honneur en acceptant de présider le Jury de ma soutenance de thèse. Je vous en remercie. Je profite aussi de l occasion pour vous remercier d avoir grandement contribué par votre enseignement de la Pharmacologie, à l épanouissement de mes collègues et moi. Veuillez agréer mon plus profond respect et ma sincère reconnaissance.

5 A notre Maître et Juge de thèse, Madame K. Benbouazza Professeur de rhumatologie Vous m accordez un immense honneur en acceptant de siéger dans le Jury de ma soutenance de thèse. Je vous en remercie. Je profite aussi de l occasion pour vous remercier d avoir accepté nous aider pour l élaboration de ce travail. Veuillez agréer mon plus profond respect et ma sincère reconnaissance. A notre Maître et Juge de thèse, Monsieur Adnaoui Professeur de Médecine interne Vous m accordez un immense honneur en acceptant de siéger dans le Jury de ma soutenance de thèse. Je vous en remercie. Je profite aussi de l occasion pour vous remercier d avoir grandement contribué par votre enseignement de la sémiologie, à mon épanouissement. Veuillez agréer mon plus profond respect et ma sincère reconnaissance.

6 A notre Maître et Juge de thèse, Madame Essakalli Professeur d immunologie Vous m accordez un immense honneur en acceptant de siéger dans le Jury de ma soutenance de thèse. Je vous en remercie. Je profite aussi de l occasion pour vous remercier d avoir grandement contribué par votre enseignement d immunologie, à l épanouissement de mes collègues et moi. Veuillez agréer mon plus profond respect et ma sincère reconnaissance. A Madame TAHIRI. Votre disponibilité et vos conseils m ont été d une grande aide dans la réalisation de ce travail. Je ne trouve pas les mots pour vous témoigner ma reconnaissance. Je demande à DIEU de vous bénir avec toute votre famille. Merci. A Monsieurs Benjamin N dayiragijé, Taminou Younoussa et tout ceux qui ont de près ou de loin contribué à l élaboration de ce travail. Je vous remercie pour tout que Dieu vous bénisse. A Monsieur, le responsable de Masterlab pour avoir bien voulu nous aider, en nous offrant les réactifs utilisés au cours de cette étude.

7 A Monsieur Nourredine et à toute l équipe du laboratoire d hématologie de l hôpital Cheikh Zayed. Je vous remercie très sincèrement de m avoir accueilli dans votre laboratoire. Veuillez agréer mon profond respect et ma sincère reconnaissance. A tous mes Frères et Sœurs MAROCAINS qui m ont soutenu pendant toutes ces années de formation au Maroc. Je vous remercie pour votre hospitalité. A toute la Communauté béninoise au Maroc. Je vous remercie tous pour votre soutien. A l Ambassade du BENIN au Maroc. Je vous remercie tous pour votre soutien. A tous mes Frères et Sœurs ETRANGERS au Maroc. Je vous remercie pour votre soutien pendant toutes ces années de formation au Maroc. A l Agence Marocaine de Coopération Internationale. Je vous remercie de m avoir soutenu pendant toutes ces années d études au Maroc

8 LISTE DES ABREVIATIONS PR : Polyarthrite rhumatoïde FR : Facteur rhumatoïde Anti-TNF-α: Anticorps du tumor necrosis factor α IL: Interleukin Anti-CCP: Anticorps antipeptides cycliques citrullinés HLA: Human leukocyte antigen CMH: Complexe majeur d histocompatiblité MCP : Métacarpophalangienne IPP : Interphalagienne MTP:Métatarsophalangienne Ig (M,A, G) : Immunoglobine type M,A,G Fc: Fragment c des immunoglobines SGS: Syndrome de gougerot sjögren MEIA : Méthode immunoenzymatique de type microparticulaire.

9 Liste des figures Figure 1: Diagramme sectoriel de la population selon le sexe Figure 2 : Répartition de la population en fonction de la tranche d âge...32 Figure 3: Répartition de la population de PR selon la durée d évolution de la maladie...33 Figure 4: Sensibilité et spécificité du test de deuxième génération AxSYM Anti-CCP et des tests de détection du FR...37 Liste des Tableaux Tableau 1 : Tableau des résultats...27 Tableau 2 : Répartition en fonction du sexe de la population de PR...31 Tableau 3 : Répartition en fonction de la tranche d âge...32 Tableau 4: Répartition en fonction de la durée de la maladie...33 Tableau 5: Comparaison des taux de positivité ou de négativité de l Anti-CCP et du FR entre les patients et les témoins Tableau 6: Comparaison des valeurs de l Anti-CCP entre patients et témoins...35 Tableau 7 : Tableau récapitulatif des résultats en termes de sensibilité, spécificité, VPP, VPN...36 Tableau 8 : Comparaison des valeurs obtenues par rapport aux valeurs de la littérature...38 Tableau 9 : Valeurs évaluées par rapport à des sujets témoins...41 Tableau 10 : Valeurs de l Anti-CCP évaluées chez les patients atteints de PR évoluant depuis moins de 6 ans et depuis plus de 6mois Tableau 11 : Anti-CCP et Pronostic de la PR débutante: Détérioration structurale.52 Tableau 12 : Anti-CCP et Pronostic de la PR débutante : Evolutivité inflammatoire..53

10 Sommaire Introduction générale... 1 Chapitre I : Matériel et méthodes... 6 I-POPULATION ETUDIEE Patients Témoins... 7 II- METHODES D ETUDE Recrutement Echantillonnage et Conservation Analyses biologiques Paramètres dosées Techniques de dosages Dosage de l anti-ccp Mode opératoire du dosage Dosage des facteurs rhumatoïdes (FR) Test au latex sur lame REACTION TYPE Waaler-Rose Analyse Statistique Rappels de quelques notions de biostatistique utilisés au cours de l'étude.23 Chapitre II : Résultats et Discussion DESCRIPTION DE LA POPULATION ETUDIEE Caractéristiques épidémiologiques Sexe Age Durée de la pathologie (PR) COMPARAISON DES MARQUEURS ENTRE PATIENTS ET LES TEMOINS... 34

11 3.1-Comparaison des pourcentages de présence ou d absence des marqueurs entre les patients et les témoins Test de Mann-Whitney COMPARAISON DE LA SENSIBLITE, SPCECIFICITE, VALEUR PREDICTIVE POSITIVE ET VALEUR PREDICTIVE NEGATIVE DES DIFFERENTS MARQUEURS Entre l Anti-CCP et FR Comparaison des courbes ROC (Receiver Operator Characteristic.) des deux marqueurs 39 5-Etude des performances de l Anti-CCP Chapitre III : DISCUSSION Du point de vue épidémiologique Sexe Age Du point de vue biologique Limites méthodologiques Perspectives 55 CONCLUSION GENERALE...56 RESUME...58 Références bibliographiques.62 ANNEXES 68

12 Introduction générale

13 Introduction La polyarthrite rhumatoïde (PR), chef de file des rhumatismes inflammatoires chroniques [1] est une maladie qui se caractérise par une atteinte inflammatoire à la fois systémique et articulaire et qui évolue par poussées successives. Autrefois appelée «Polyarthrite chronique évolutive», elle est classée parmi les maladies dites systémiques (en raison de l existence de manifestions extraarticulaires) et les maladies auto-immunes (en raison de la présence d autoanticorps comme le facteur rhumatoïde). A terme, elle provoque une atteinte structurale du cartilage et de l os sous jacent aboutissant finalement à la destruction articulaire [2]. La PR est une maladie invalidante, notamment dans les formes sévères, et qui peut également mettre en jeu le pronostic vital. Certes la PR cause une altération des capacités physiques, mais elle est aussi responsable de grandes pertes économiques tant pour le malade que pour son entourage et la société. Au Maroc, les pertes économiques sont estimées en moyenne à 510 DIRHAMS par mois rien que pour les coûts directs [3]. L impact socioéconomique de la PR, requiert de plus en plus l attention de l ensemble des recherches et explique par la même occasion la tendance actuelle des études et travaux scientifiques menés à ce sujet. Son expression clinique est polymorphe pouvant associer à n importe quel stade des signes articulaires et des signes extra-articulaires (d où l appellation parfois de «maladie rhumatoïde») [4]. La PR est une maladie relativement fréquente puisque sa prévalence est estimée à 1% de la population générale ; en France elle est estimée entre 0,25 et 0,50% ; au Maroc, la prévalence est estimée à 1% de la population. Elle est 3 à 4 fois plus fréquente chez la femme que l homme. Toutefois, lorsqu elle débute tardivement (après 60 à 65 ans), le sex-ratio a

14 tendance à se rapprocher de 1. La PR débute le plus souvent entre 35 et 55 ans (périménopausique). Elle peut s observer à tous les âges [4]. La PR est une maladie d étiologie inconnue et comme beaucoup de maladies auto-immunes, c est une affection polyfactorielle relevant de facteurs psychologiques, endocriniens, d environnements (intervention d antigènes dont la nature est inconnue), génétiques et immunologiques. Les facteurs génétiques de susceptibilité n ont pas d intérêt pour le diagnostic mais semblent être le marqueur de formes plus sévères. Le diagnostic doit donc être aussi précoce que possible afin de mettre en œuvre le traitement. De récents travaux montrent que l efficacité thérapeutique est d autant meilleure que le traitement est institué tôt [5]. Au stade de début, où il n existe aucune déformation, le diagnostic est difficile. IL repose avant tout sur les données de l interrogatoire et de l examen clinique. A ce stade, les examens complémentaires radiologiques ou même biologiques apportent rarement des éléments permettant d affirmer sans réserve le diagnostic. En revanche, à la phase de début, il faut éliminer de nombreuses affections d origine infectieuse, inflammatoire ou microcristalline. Depuis quelques années, les progrès faits dans la connaissance de l immunopathologie de la polyarthrite rhumatoïde et des facteurs pronostiques permettent de mieux fixer la stratégie thérapeutique [5]. En effet, il importe d adapter le traitement proposé à la sévérité actuelle et éventuellement prévisible de la polyarthrite rhumatoïde, c est dire l importance des facteurs pronostiques cliniques, biologiques, radiologiques dont on peut disposer d emblée. La prise en compte de ces facteurs est essentielle dans la mise en place d une véritable

15 stratégie thérapeutique gérée, dans les formes sévères, par une équipe soignante pluridisciplinaire dans le cadre d une prise en charge globale. Le traitement de la PR est assez complexe et doit être institué très tôt au début de la pathologie. IL nécessite bien entendu une information détaillée du malade, une approche médico-psychologique particulièrement importante dans cette maladie chronique, des traitements médicamenteux généraux et locaux, une réadaptation fonctionnelle appropriée et parfois des traitements chirurgicaux. L éventail des possibilités thérapeutiques s est considérablement élargi ces dernières années, avec l arrivée non seulement des biothérapies (anti-tnfα, antagoniste du récepteur de l IL-1, molécule CTLA-4 chimérique ) mais aussi de nouveaux immunosuppresseurs (comme le léflunomide) aux actions beaucoup plus ciblées et, en conséquence, aux effets indésirables bien mieux contrôlés. Le problème actuel n est donc plus la prise en charge thérapeutique de la PR, mais un diagnostic précoce. Il n est plus permis d attendre l apparition des érosions osseuses radiographiques (pourtant un des signes cardinaux de la PR) pour étiqueter la maladie et envisager un traitement. Les critères biologiques ont donc naturellement pris une place prépondérante pour aider le clinicien dans la mise en place diagnostique de la PR. L objectif de notre travail est donc, de définir la place des Anticorps antipeptides cycliques citrullinés (Anti-CCP) pour le diagnostic de la PR. Pour ce faire, une étude comparative de spécificité et de sensibilité des marqueurs sérologiques s avère indispensable.

16 Chapitre I : MATERIEL & METHODES

17 I-POPULATION ETUDIEE 1-Patients Il s agit d une étude prospective débutée au mois de mai La population étudiée était composée d une cohorte de 40 patients hospitalisés ou suivis en consultation à l hôpital de rhumatologie El Ayachi de Rabat-Salé pour PR (diagnostic retenu selon les critères de l ACR 1987). Pour chacun de ces patients, des prélèvements veineux ont été réalisés sur place et directement envoyés au laboratoire d hématologie de l hôpital Cheikh Zayed de Rabat pour le dosage de l Anti-CCP et du FR. 2-Témoins Pour la comparaison de nos résultats, nous avons recruté une série de témoins. Les témoins peuvent être classés en deux groupes : 1- Groupe de 26 patients dont la symptomatologie présentée est variable mais généralement orientée vers des pathologies connues pour être fréquemment accompagnées de FR : affections rhumatismales (inflammatoires ou non), hématologiques ou infectieuses chroniques. Dans le cadre des rhumatismes inflammatoires (n=11), on trouve six lupus, un SGS (syndrome de Gougerot Sjogren) primitif, une vascularite, une polymiosite, une connectivite mixte, une sclérodermie. Parmi les affections non rhumatismales (n=15), certaines sont connues pour être volontiers accompagnées de facteurs rhumatoïdes. Ce sont essentiellement les infections telles que la tuberculose et l hépatite C, mais aussi le diabète, la

18 goutte, la thyroïdite, la fibrose pulmonaire, l insuffisance rénale, l hypercholestérolémie encéphalopathie et enfin la coronaropathie. 2- Groupe de sujets sains ou normaux (n=14). Le groupe de sujets sains est constitué essentiellement de techniciens du laboratoire d hématologie de l hôpital Cheikh zayed, mais aussi d étudiants. II- METHODES D ETUDE II.1-Recrutement Patients Le recrutement des patients atteints de la PR a été réalisé après étude de leurs dossiers médicaux. Ceci est réalisé à l aide d une fiche dite de renseignements cliniques établie à cet effet. (Fiche de renseignements cliniques ci-dessous).

19 ETUDE COMPARATIVE DE LA SPECIFICITE ET DE LA SENSIBILITE DES FACTEURS RHUMATOIDES ET DES ACCP POUR LE DIAGNOSTIC DE LA PR AU SEIN DE LA POPULATION MAROCAINE FICHE DE RECUEIL DES DONNEES CLINIQUES Nom et prénom du patient : Dossier N :. A-CARACTERISTIQUES SOCIO-DEMOGRAPHIQUES DU PATIENT : Sexe Homme Femme Age : B-CARACTERISTIQUES DE LA PR : - Date de début de la maladie : - Raideur matinale > 30mns : oui non - Arthrite touchant au moins 3 articulations oui non - Arthrite touchant les poignets ou les métacarpophalangiennes (MCP) et les interphalangiennes proximales (IPP) des mains - Atteinte symétrique : oui non C- BILAN BIOLOGIQUE : - Anti-CCP : U/ml - FR : * Latex : UI/ml *Walérose : UI/ml -VS...mm/1hr -Protéine C réactive..mg/l D-BILAN D IMAGERIE : -Destruction articulaire : oui non E-AUTRES DONNEES CLINIQUES : - Manifestations extra-articulaires oui non si oui, préciser : -NAG (nombre d articulations gonflées)/ 28 articulations :.. -NAD (nombre d articulations douloureuses)/ 28 articulations :.. -DAS 28 :.. -Traitement en cours oui non si oui, préciser :

20 Témoins La cohorte de sujets témoins comportant des sujets atteints d une maladie autre que la PR, et des sujets sains. Pour les premiers, il est important de souligner que leur recrutement a été fait sur la base de l étude de leurs dossiers médicaux. Par contre, les sujets sains ont été recrutés sur la base de l interrogatoire. II.2-Echantillonnage et Conservation Patients Les prélèvements des sujets atteints de la PR ont été réalisés à l hôpital de rhumatologie EL AYACHI de Rabat Salé. Aussitôt prélevés, ils ont été convoyés au laboratoire d hématologie de l hôpital Cheikh Zayed. Au laboratoire, ces prises de sang veineux recueillis sur tube sec ont été centrifugées à 3000 tours par minute pendant 10 minutes. Par la suite et après réalisation des dosages, les sérums ont été aliquotés, puis conservés à -20 C pour un éventuel contrôle. Témoins Les prélèvements des témoins ont été réalisés sur place au laboratoire d hématologie de l hôpital Cheick Zayed. Ils ont ensuite été traités et les sérums ont été congelés selon le même protocole.

21 3- Analyses biologiques 3.1- Paramètres dosées Compte tenu de l objectif de notre étude, nous nous sommes intéressés aux dosages de l anti-ccp et des FR. Le dosage de l anti-ccp est de type immunoenzymatique micro-particulaire (MEIA), réalisé sur l autoanalyseur AxSYM. Celui des FR, est basé sur des réactions d agglutination et est réalisé manuellement via l usage de deux tests à savoir, le test au Latex et le test de Waaler-Rose Techniques de dosages Dosage de l anti-ccp Le test employé pour la recherche des anticorps antipeptides cycliques citrullinés est la trousse commercialisée AxSYM Anti-CCP de la société Axis- Shield Diagnostics Ltd et distribué par Abbott Laboratories. Il repose sur la technologie immuno-enzymatique microparticulaire (MEIA). La trousse est étalonnée à l aide d un pool de plasmas humains positifs pour les anti-ccp. Etant donné qu il n existe pas d étalon international pour exprimer les titres en anti-ccp, les résultats du dosage sont exprimés en unités arbitraires. La gamme d étalonnage va de 0 à 200 unités/ml. Le cut-off est fixé à 5U/ml Mode opératoire du dosage Unité d échantillonnage L échantillon et tous les réactifs AxSYM Anti-CCP nécessaires pour un dosage sont pipetés par l aiguille d échantillonnage dans les différents puits de la cartouche de réaction (CR). Le diluant AxSYM et l échantillon sont pipetés dans le puits d incubation de la CR.

22 Le diluant échantillon AxSYM Anti-CCP et l échantillon dilué sont pipetés dans le puits-échantillon de la CR. Le bloqueur de matrice AxSYM Anti-CCP est pipeté dans le puits-tampon de la CR. Le conjugué d anticorps anti-igg humaines (souris) AxSYM Anti-CCP : phosphatase alcaline est pipetée dans le puits- réactifs 3 de la CR. Le diluant AxSYM et les microparticules diluées recouvertes de CCP sont pipetés dans le puits- réactifs 2 de la CR. Un mélange réactionnel se forme lors de la mise en présence de l échantillon dilué et des microparticules diluées recouvertes de CCP dans le puits-réactifs 1 de la CR. Si l anticorps anti-ccp est présent dans l échantillon, il se lie aux microparticules recouvertes de CCP pour former des complexes antigèneanticorps sur les microparticules. La CR est immédiatement transférée dans l unité de traitement, où le pipetage continue à l aide de l aiguille de traitement Unité de traitement Une partie aliquote du bloqueur de matrice est transférée sur la matrice. Une partie aliquote du mélange réactionnel contenant des complexes antigènes-anticorps liés aux microparticules est transférée sur la matrice. Les microparticules se lient irréversiblement à la matrice en fibres de verre. La matrice est lavée afin d éliminer tout matériel non lié aux microparticules.

23 Le conjugué d anticorps anti-igg humaines (souris) AxSYM anti-ccp : phosphatase alcaline est distribué sur la matrice et se lie aux complexes antigènes-anticorps. La matrice est lavée afin d éliminer le conjugué non lié aux microparticules. Le substrat, du phosphate de méthyl-4-ombelliféryl, est ajouté sur la matrice. Le conjugué marqué à la phosphatase alcaline catalyse la séparation d un groupement phosphate du substrat, conduisant à l obtention d un produit fluorescent, le méthyl-4-ombelliférone. Ce dernier est mesuré par le système optique MEIA. Les résultats sont obtenus à l aide de la courbe de calibration Dosage des facteurs rhumatoïdes (FR) La recherche des facteurs rhumatoïdes repose sur l utilisation conjointe d une technique d agglutination de billes de latex sensibilisées par des immunoglobulines humaines (Rhumalatex de Fumouze) et d une technique d hémagglutination d hématies sensibilisées par des IgG animales (Polyart-test et Polyartitre de Fumouze). Il est indispensable de souligner ici que seuls les FR de types IgM ont fait l objet de notre étude. Les isotypes IgA, IgG, IgD, IgE n ont pas été traités.

24 Test au latex sur lame Principe : Est basé sur les propriétés agglutinantes spécifiques du Facteur Rhumatoïde qui réagit avec les particules de latex sensibilisées par des gammaglobulines humaines. La présence du FR sérique entraîne l apparition d une agglutination massive, visible à l œil nu, des particules de latex. En l absence de Facteur Rhumatoïde, on n observe aucune agglutination. La manipulation est simple et rapide. Les résultats sont obtenus en 2 minutes. Mode opératoire : Avant toute utilisation des réactifs et sérums à analyser, il est impératif de veiller à ce que leur température revienne à la température ambiante. Technique qualitative Dans un premier temps, on procède à une dilution au 1/21 du sérum à analyser en distribuant et en mélangeant 50µl de sérum et 1ml de tampon de glycocolle. Puis, à l aide d une micropipette, on dépose 50µl du sérum dilué sur une des cases de la lame. Ensuite, on agite soigneusement le réactif latex et on en dépose une goutte à l aide du compte-gouttes fourni dans le coffret. Après, on mélange les deux gouttes à l aide d un agitateur à usage unique. Enfin, on applique un lent mouvement de rotation, pendant deux minutes, et on observe la présence ou l absence d agglutination.

25 Technique semi-quantitative En cas de résultat positif sur sérum dilué au 1/21, il est possible d évaluer le taux de FR en testant des dilutions croissantes du sérum à analyser en tampon glycocolle, jusqu à obtention d une réaction négative. Préparations de dilutions croissantes Tube 1 50µL 1mL de tampon glycocolle Dilution1/21 d échantillon Tube 2 0,5mL du Tube 1 0,5mL de tampon glycocolle Dilution1/42 Tube 3 0,5mL du Tube 2 0,5mL de tampon glycocolle Dilution1/84 Tube 4 0,5ml du Tube 3 0,5mL de tampon glycocolle Dilution1/168. Après cette préparation de dilutions croissantes, on effectue un test sur lame avec chaque dilution en suivant le protocole décrit au paragraphe «Technique Qualitative». Interprétation des résultats Réaction positive : agglutination visible à l œil nu avec éclaircissement du milieu : présence du FR Réaction négative : pas d agglutination : absence du FR. Remarque : Le titre est donné par la plus haute dilution donnant une agglutination nette, visible à l œil nu. Le titre en UI/mL est égal à l inverse de cette dilution limite multiplié par le seuil de sensibilité du réactif indiqué sur le coffret. Le seuil de sensibilité du réactif utilisé est de 1UI/mL ; par conséquent si

26 un sérum est positif jusqu à la dilution 1/84, le titre de ce sérum sera alors de 84X 1= 84 UI/mL REACTION TYPE Waaler-Rose Test d hémagglutination sur lame pour la détection du FR sérique (POLYARTEST FUMOUZE ) But du test : Il s agit d un test d hémagglutination sur lame permettant la détection rapide du FR de type IgM présent dans la plupart des sérums de malades atteints de PR. Principe : Le principe est basé sur les propriétés hémagglutinantes spécifiques du FR, utilisées dans les réactions type Waaler-Rose. Le réactif révélateur est constitué d hématies de mouton sensibilisées par une fraction de gamma-globulines d un sérum de lapin anti-hématies de mouton. Le réactif témoin, constitué d une suspension d hématies de mouton non sensibilisées, assure la spécificité de la réaction et permet d éliminer les interférences dues aux agglutinines naturelles anti-mouton (hétéroanticorps de Forssman, anticorps de la mononucléose infectieuse et autres macroglobulines). En France, une variante de ce test utilise des hématies humaines O Rhésus négatif sensibilisées par un sérum de lapin antiglobules rouges humaines O Rhésus négatif [6].

27 Mode opératoire : a. On laisse les réactifs et les sérums à analyser revenir à température ambiante avant utilisation. b. A l aide d une micropipette, on dépose 50µL du sérum à analyser sur les cases «T» et «R». c. Ensuite, on agite soigneusement les suspensions d hématies. d. Puis on dépose une goutte de réactif témoin sur la case «T» et une goutte de réactif révélateur sur la case «R» (flacons distributeurs). e. Enfin, sur chaque case, on mélange les deux gouttes (sérum+ réactif) à l aide d un agitateur à usage unique.

28 Interprétation des résultats : CASE «T» CASE «R» INTERPRETATION REACTIONN NEGATIVE ABSENCE de Facteur Rhumatoïde. _ + REACTION POSITIVE PRESENCE de Facteur Rhumatoïde. + _ REACTION NEGATIVE + +/_ PRESENCE d agglutinines naturelles anti-mouton. + + Dans la grande majorité des cas, REACTION NEGATIVE due à des agglutinines naturelles anti-mouton. Pour s en assurer, on effectue un nouvel examen en diluant le sérum au ¼. Légende : + : Présence d hémagglutination visible à l œil nu avec éclaircissement du milieu. - : Absence d hémagglutination. En cas de réaction positive, autrement dit en cas de présence de FR, on passe à la détermination quantitative du FR sérique par test d hémagglutination indirecte.

29 Détermination quantitative du FR sérique par hémagglutination indirecte (POLYARTITRE FUMOUZE ) But du test : C est la détermination du titre ou du taux des FR sériques de type IgM par hémagglutination indirecte à l aide de POLYARTITRE FUMOUZE. Principe : POLYARTITRE FUMOUZE est basé sur les propriétés hémagglutinantes spécifiques du FR, utilisées dans les réactions type Waaler-Rose. Le réactif révélateur est constitué d hématies de mouton sensibilisées par une fraction de gammaglobulines d un sérum de lapin anti-hématies de mouton. La présence de FR sérique entraîne une hémagglutination du réactif révélateur qui se traduit par un voile rouge/ marron tapissant la cupule. En l absence du FR, ces hématies sédimentent au fond de la cupule sous forme d un bouton punctiforme. Le réactif témoin, constitué d une suspension d hématies de mouton non sensibilisées, assure la spécificité anticorps de la mononucléose infectieuse et autres macroglobulines). La réaction s effectue en microplaque à fond en V. La manipulation est simple et rapide. Les résultats sont obtenus en 2 heures. Mode opératoire : Toujours laisser, les réactifs et sérums revenir à température ambiante avant manipulation. 1. Préparation d une dilution mère du sérum à analyser (1/20) On distribue dans un tube à hémolyse et on mélange :

30 50µL de sérum à analyser ; 950µL de tampon phosphate. 2. Réalisation du test sur microplaque a. A l aide d une micropipette multicanaux, on distribue 50µL de tampon phosphate dans 12 cupules de la microplaque. b. On mélange avec le tampon et on reporte, de préférence à l aide d une micropipette, 50µL de la 1 ère cupule dans la 2 ème dans la 3 ème, et ainsi de suite jusqu à la 10 ème cupule, en rejetant 50µL de la 10 ème cupule. On obtient les dilutions suivantes : N cupule 1 ème cupule 2 ème 3 ème 4 ème 5 ème cupule cupule cupule cupule Dilution 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 N cupule 6 ème 7 ème 8 ème 9 ème 10 ème cupule cupule cupule cupule cupule Dilution 1/1280 1/2560 1/5120 1/ /20480 c. Puis, on distribue 50µL de la solution mère du sérum dans la 11 ème cupule. On mélange avec le tampon et on rejète 50µL. Cette dilution (1/40) constitue le témoin sérum, dont le rôle est de détecter les agglutinines naturelles anti-mouton que peuvent contenir certains sérums. d. On agite soigneusement les suspensions d hématies. Dépôt d une goutte de réactif révélateur dans les 10 premières cupules.

31 Dépôt d une goutte de réactif témoin dans la 11 ème cupule (témoin sérum). Dépôt d une goutte de réactif révélateur dans la 12 ème cupule (témoin réactif) dont le rôle est de contrôler la validité du tampon et du réactif révélateur. Remarque : on ne réalise qu un seul témoin réactif par série de tests. e. Très soigneusement, on homogénéise manuellement le contenu des cupules par tapotements latéraux sur les cotés de la microplaque, posée à plat. Puis on laissera la plaque immobile, à l abri de toute vibration. f. En fin, la réaction est lue deux heures plus tard. 3-Interprétation des résultats : Absence d hémagglutination Présence d un bouton punctiforme au fond de la cupule Présence d hémagglutination Présence d un voile rouge/ marron tapissant la cupule REACTION NEGATIVE Absence du FR REACTION POSITIVE Présence du FR Remarque : Le titre est donné par la dernière dilution présentant une hémagglutination. Le titre en UI/mL est égal à l inverse de cette dilution limite multiplié par le seuil de sensibilité du réactif indiqué sur le coffret.

32 II.4- ANALYSE STATISTIQUE Afin de bien mener notre étude, nous avons adopté une démarche en plusieurs étapes : Nous avons commencé par une étude descriptive de la population à étudier. Puis nous avons déterminé le pourcentage des marqueurs respectivement par rapport aux malades atteints de PR et par rapport aux témoins. Ensuite nous avons étudié la comparaison de la moyenne des différents marqueurs sérologiques (Anti-CCP et FR) entre patients et témoins. Par la suite, à fin de déterminer les performances des tests, on a comparé les deux marqueurs (Anti-CCP et FR) en termes de sensibilité, spécificité, valeur prédictive positive (VPP), valeur prédictive négative (VPN) et les courbes ROC respectives. Pour l évaluation des données, nous avons utilisé l analyse de la variance, le test de Mann Whitney et l analyse de la courbe ROC. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives lorsque les valeurs de p étaient inférieures à 0,005. Tous les tests statistiques ont été réalisés à l aide du logiciel SPSS II.4.1-Rappels de quelques notions de biostatistique utilisés au cours de l étude L objectif de notre étude est de définir la place de certains marqueurs sérologiques (Anti-CCP et FR) dans le diagnostic de la polyarthrite. Pour cela une étude des performances respectives de ces derniers s avère indispensable.

33 Il nous semble par conséquent important de définir et d expliquer le mode de calcul des indices utilisés pour cette étude ; à savoir la sensibilité, la spécificité, les VPP et VPN. PR Présente PR Absente TOTAL A B a+b Anti-CCP Positifs Vrais positifs Faux positifs Tous les tests positifs Ou FR Négatifs C D c+d Faux négatifs Vrais négatifs Tous les tests négatifs a+c b+d a+b+c+d TOTAL Tous les patients Tous les témoins Toutes les personnes (PR) Testées Sensibilité : Ou encore la fréquence des vrais positifs, est définie comme étant le nombre des malades ayant un test positif. Sensibilité =a /a+c Spécificité : Ou encore la fréquence des vrais négatifs, est définie comme étant le nombre des témoins ayant un test négatif. Spécificité =d/ b+d

34 Valeur prédictive positive (VPP): Est le nombre des tests vrais positifs sur tous les positifs. VPP = a/a+b Valeur prédictive négative (VPN) : Est le nombre des tests vrais négatifs sur tous les négatifs. VPN =d/c+d Courbe ROC et ses caractéristiques Courbe ROC ou Receiver Operator Characteristic permet de déterminer de façon fiable le seuil de positivité d un test. Ces courbes, qui indiquent le taux de vrais positifs en fonction de la proportion de faux positifs pour une gamme de valeurs seuils, offrent le meilleur compromis entre sensibilité et spécificité.

35 CHAPITRE II : RESULTATS

36 Liste des résultats de toutes les analyses réalisées au cours de notre étude Tableau des résultats des analyses/ Tableau 1 Durée Anti- FR - FR- Age(ans) Sexe Maladie(ans) CCP Latex(UI/ml) Waaler/Rose(UI/mL) Pathologie 1 43 F >6ans <8 PR 2 50 F >6ans 35,2 21 <8 PR 3 50 F <6ans 9,7 84 <8 PR 4 45 F >6ans >200 <21 <8 PR 5 26 F >6ans > <8 PR 6 65 M <6ans 167, PR 7 32 F >6ans 0,2 <21 <8 PR 8 55 F >6ans 5, PR 9 65 F <6ans 59,4 <21 <8 PR F >6ans 148,6 672 <8 PR F >6ans 1, PR F 6ans > PR F >6ans 10,6 168 <8 PR F <6ans 4,8 <21 <8 PR F >6ans > <8 PR F <6ans 6,7 168 <8 PR F <6ans 30,3 168 <8 PR F <2ans 1,1 <21 <8 PR M 22ans 0,5 <21 <8 PR F <6ans 12,4 <21 <8 PR F <6ans 137,1 168 <8 PR F <6ans PR

37 23 42 F <6ans 0,9 <21 <8 PR F 6ans 0,2 <21 <8 PR F <2ans 112, PR F <6ans 114, PR F <6ans 0,5 <21 <8 PR F 6ans 177,6 21 <8 PR F >2ans 13,3 21 <8 PR F <2ans 1,8 <21 <8 PR M 4ans 2 <21 <8 PR M 13ans <8 PR F 9ans PR F 2ans 100 <21 <8 PR F >2ans > PR M >2ans 57,5 21 <8 PR M >6ans > <8 PR M >6ans > <8 PR F >2ans <8 PR F >2ans > PR 1 53 F 0, connectivites mixtes 2 35 M 5,8 <21 <8 Polymiosite 3 45 F 0, Vascularite 4 50 M <8 SGS + PR 5 45 F 2,5 <21 <8 Lupus 6 60 F 1,6 <21 <8 Lupus 7 35 F 9,8 <21 <8 Lupus+PR 8 65 M 0,4 <21 <8 Lupus 9 70 F 0,4 21 <8 Lupus

38 10 72 F 0,5 <21 <8 Diabète F 1,1 <21 <8 Encéphalopathie F 1 84 <8 Fibrose pulmonaire F 0,4 21 <8 Sclérodermie F 0,9 21 <8 Thyroidite F 0,2 <21 <8 Hypercholestérolémie F 0,5 84 <8 embolie pulmonaire et Alzhaimer F 0,4 84 <8 Goutte M 0,6 42 <8 HTA et insf rénal M > Coronaropathie F 0,9 <21 <8 Lupus F 0,5 <21 <8 Carcinone vésiculaire de la thyroide M 2, <8 Hépatite C M 0,5 42 <8 Altération de l'état général M 0,5 336 <8 Tuberculose M 0, Cancer de la prostate F 0,4 42 <8 Cancer du sein F 0,4 <21 <8 sujet sain M 0,5 <21 <8 sujet sain M 0,2 <21 <8 sujet sain M 0 <21 <8 sujet sain F 0,6 42 <8 sujet sain F 0,2 664 <8 sujet sain

39 33 31 F 0,1 <21 <8 sujet sain F 0,2 42 <8 sujet sain F 0,1 21 <8 sujet sain F 3,6 <21 <8 sujet sain F 0,3 <21 <8 sujet sain F 0,1 332 <8 sujet sain M 0,1 <21 <8 sujet sain F 0,8 <21 <8 sujet sain

40 2- DESCRIPTION DE LA POPULATION ETUDIEE 2.1-Caractéristiques épidémiologiques Sexe Les sujets étudiés sont en majorités des femmes, puisque sur les 40 individus ou patients inclus, seulement 7 sont des hommes, soit 18% de la population de PR étudiée. Le tableau 2 représente la répartition de la population en fonction du sexe. Tableau 2 : Répartition selon le sexe de la population de PR. Sexe Effectif (n) % Féminin Masculin 7 18 Répartition de la population selon le sexe 18% 82% sexe féminin sexe masculin Figure 1 : Diagramme sectoriel de la population selon le sexe.

41 2.1.2-Age La moyenne d âge des patients recrutés est de 49,58 ans (13,24) [24-80]. (Patients recrutés se situent dans la fourchette d âge allant de 24 ans à 80 ans avec un écart type de 13,24) (Cf. Tableau 1). La répartition de la population de PR étudiée en fonction de la tranche d âge est détaillée dans le tableau ci-après. Tableau 3 : Répartition en fonction de la tranche d âge Tranches d'âge (ans) Effectif (n) Pourcentage (%) [10-34] 6 15 [35-59] 25 62,5 [60-85] 9 22,5 Effectifs 22,50% 15% 62,50% [10-34] [35-59] [60-85] Figure 2 : Répartition de la population suivant la tranche d âge.

42 Durée de la pathologie (PR) Parmi les 40 patients souffrant de PR, 15 individus avaient une maladie qui évoluait depuis plus de 6ans au moment du prélèvement sanguin, alors que pour 21 autres, la maladie évoluait depuis moins de 6ans, voire moins de 2ans pour 4 d entre eux. Tableau 4: Répartition selon la durée de la maladie. PR Effectif (n) pourcentage (n) PR>6ans 15 37,50% PR]2,6[ 21 52,50% PR 2 ans 4 10% 52,50% 10% 37,50% PR> 6ans PR ]2, 6] PR 2ans Figure 3: Répartition de la population de PR selon la durée d évolution de la maladie

43 PR Témoins Significations asymptotiques Anti CCP Présence 75% 10,00% P<0,0001 Absence 25% 90,00% FR Présence 67,50% 52,50% P=0,70 Absence 32,50% 47,50% FR-LATEX Présence 67,50% 52,50% p=0,171 Absence 32,50% 47,50% 3-COMPARAISON DES MARQUEURS ENTRE PATIENTS ET TEMOINS 3.1-Comparaison des taux de positivité ou de négativité des marqueurs entre les patients et les témoins Tableau 5: Comparaison des taux de positivité ou de négativité de l Anti- CCP et du FR entre les patients et les témoins. FR-WALEER- ROSE Présence 25% 10,00% p=0,77 Absence 75% 90,00% Remarque : Lorsque p est inférieur à 0,005, la différence statistique entre les deux groupes sont considérées comme étant significative. La comparaison des taux de positivité et de négativité des marqueurs sérologiques dosés, a montré une différence statistiquement significative entre

44 patients et témoins, seulement pour l Anti-CCP. Pour le reste, la différence n est pas significative ; puisque p est largement supérieur à 0,005.Au vue de ces résultats, le premier constat fait porte sur l excellente spécificité des anti-cpp et du FR détecté par le test de Waaler-Rose (absents chez 90% des témoins). 3.2-Test de Mann-Whitney Tableau 6: Comparaison des valeurs de l Anti-CCP entre patients et témoins Effectif Somme Rang Signification des rangs moyen asymptomatique L Anti-CCP Patients ,5 80,76 Témoins ,6 8,51 P<0,0001 Ici, on aurait bien souhaité comparer tous les marqueurs entre patients et témoins via le test de Mann-Whitney. Seulement, les tests utilisés pour la détection des FR, ne nous offrent pas cette possibilité. Car tout résultat négatif pour ces tests, n est pas quantifié (Tableau des résultats). On a p<0,0001très loin de la valeur seuil (0,005) au dessous de laquelle la différence entre PR et témoins pour l anti-ccp sera considérée comme significative, ce qui confirme l excellente performance (spécificité) de ce test pour le diagnostic de la PR.

45 4-COMPARAISON DE LA SENSIBLITE, SPCECIFICITE, VALEUR PREDICTIVE POSITIVE ET VALEUR PREDICTIVE NEGATIVE DES DIFFERENTS MARQUEURS 4.1-Entre l Anti-CCP et FR Tableau 7 : Tableau récapitulatif des résultats en termes de sensibilité, spécificité, VPP, VPN Toute la cohorte de patients atteints de PR Marqueurs Sensibilité Spécificité VPP VPN L Anti-CCP 75% 90% 88% 78,26% FR-IgM 67,5% 47,5% 59% 61,8% Anti-CCP et IgM-FR 65% 95% 92% 73%

46 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Sensibilité Spécificité Anti-CCP FR Figure 4: Sensibilité et spécificité du test de deuxième génération AxSYM Anti-CCP et des tests de détection du FR Ce diagramme traduit la comparaison de la spécificité et de la sensibilité entre les deux marqueurs. Les sensibilités des deux tests sont presque comparables, par contre la spécificité du test à l anti-ccp est largement supérieure à celui des tests recherchant les FR (Latex et Waaler/Rose).

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