Validation des méthodes d analyse. Application à la microbiologie des eaux

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1 N d dentfcaton de l applcaton : NF148 Date d édton : 23 septembre 2015 Valdaton des méthodes d analyse Applcaton à la mcrobologe des eaux Protocole de valdaton pour les méthodes commercales de détecton et de dénombrement de Legonella et Legonella pneumophla par concentraton et amplfcaton génque par réacton de polymérsaton en chaîne (PCR) Révson 3 Adoptée par AFNOR Certfcaton le 23/09/2015 (sute à l approbaton du Bureau technque concerné)

2 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) SOMMAIRE Domane d applcaton... 3 Prncpe... 3 Phase 1 de l étude (réalsée par le laboratore expert) Raccordement de la soluton calbrante et du matérau de référence à l étalon prmare Etude de la foncton de calbrage de l étape PCR quanttatve Protocole d évaluaton de la drote de calbrage Analyse des résultats LD, LQ et seul de postvté Lmte de détecton de la PCR Lmte de quantfcaton de la PCR Lmte de quantfcaton théorque de la méthode Seul de postvté Rendement de la méthode, robustesse et ncerttude de mesure Plan d expérence Estmaton du rendement Estmaton de l ncerttude de mesure Vérfcaton des calculs et nterprétatons établs par le logcel Vérfcaton des calculs Interprétaton des nhbtons Phase 2 de l étude (réalsée par le laboratore expert) Inclusvté et exclusvté des sondes et amorces Inclusvté Exclusvté Pratcablté...18 Phase 3 de l étude : étude nterlaboratore Organsaton de la campagne d essas Calendrer prévsonnel Explotaton statstque des données...21 ANNEXE A...22 Annexe A1 : protocole de test d homogénété...22 Annexe A2 : protocole d envo des échantllons...22 Annexe A3 : formulare de consgne pour la réalsaton des essas/fchers de réponse...23 Page 2/25

3 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Domane d applcaton Ce protocole permet de valder une méthode selon les exgences des normes NF T et ISO/TS Il s applque à la détecton et/ou la quantfcaton des Légonelles dans les eaux. Les méthodes auxquelles s applquent ce document sont des méthodes commercales (également appelées «kts» dans la norme NF T90-471). La certfcaton a pour objet de démontrer que les performances de ces méthodes sont conformes à des exgences normatves. La valdaton d'une méthode commercale porte smultanément sur le mode opératore préconsé par le fabrcant, sur les produts d'essas et matérels nécessares à la mse en œuvre de la méthode, et sur un domane d'applcaton précsé. Prncpe L étude de valdaton est basée sur les crtères, plans d expérence et modes de calculs défns dans les normes NF T et ISO/TS 12869, dont les références des paragraphes sont reprses c-après, avec quelques ajustements et compléments. L étude comporte 3 phases, qu sont décrtes dans le document c-après. En foncton de la composton de la méthode à valder, le protocole de l étude nclura ou non toutes les phases. S la méthode à valder est complète, c'est à dre qu'elle comprend la parte préparaton de l échantllon, l étude de valdaton portera sur les crtères suvants : Phase 1 : LD, LQ (optonnel pour des kts unquement dédés à la détecton), foncton de calbrage, raccordement, rendement et robustesse, vérfcaton des calculs des logcels sur les fonctons quantfcaton et détecton Phase 2 : nclusvté/exclusvté, pratcablté/qualté des réactfs Phase 3 : étude nterlaboratore avec des essas sur soluton d ADN et échantllons d eau artfcellement/naturellement contamnés S la méthode PCR à valder ne comprend pas la parte préparaton de l échantllon, l étude de valdaton portera sur les crtères suvants : Phase 1 : LD, LQ (optonnel pour des kts unquement dédés à la détecton), foncton de calbrage, raccordement, vérfcaton des calculs des logcels sur les fonctons quantfcaton et détecton Phase 2 (nchangée) : nclusvté/exclusvté, pratcablté/qualté des réactfs Phase 3 : étude nterlaboratore avec des essas unquement sur soluton d ADN (pas d échantllons dopés avec les bactéres) S la méthode PCR à valder peut être utlsée sur pluseurs thermocycleurs : le fournsseur devra fxer la lste des thermocycleurs du marché qualfés pour son utlsaton l étude de valdaton devra comprendre autant d essas sur LD, LQ (optonnel pour des kts unquement dédés à la détecton), raccordement et foncton de calbrage (en phase 1 de l étude) que de thermocycleurs qualfés. Page 3/25

4 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Les demandes de modfcaton sont soumses à l avs du Bureau technque qu statuera sur le caractère majeur ou mneur de la modfcaton. Le fabrcant devra sollcter l avs d un laboratore expert. Cet avs sera présenté au Bureau Technque. S des modfcatons majeures sont apportées à la méthode valdée (phase d extracton, phase d amplfcaton et phase de quantfcaton), se reporter au tableau c-dessous pour les crtères de performance à revalder au mnmum : Phase d extracton Modfcaton Phase d amplfcaton (Mx réactonnel - hors sondes / amorces -, thermocycleurs) Phase de quantfcaton et/ou détecton (modfcaton du système sondes / amorces, thermoprofls) Performances à revalder Rendement Robustesse LD LQ (optonnel pour des kts unquement dédés à la détecton) Lnéarté Raccordement LD LQ (optonnel pour des kts unquement dédés à la détecton), Lnéarté Raccordement Inclusvté, exclusvté Page 4/25

5 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Phase 1 de l étude (réalsée par le laboratore expert) 1. Raccordement de la soluton calbrante et du matérau de référence à l étalon prmare Suvre les nstructons décrtes dans le chaptre 11.2 de la norme NF T Le raccordement sera réalsé sur un lot. 2. Etude de la foncton de calbrage de l étape PCR quanttatve 2.1. Protocole d évaluaton de la drote de calbrage (Cf de la norme NF T90-471) Le plan d expérence suvant dot être réalsé dans des condtons de reproductblté ntermédare. Préparer une gamme de p nveaux. p est le nombre préconsé par le fournsseur, au mons égal à 4, au plus à 6, par exemple, à 25, 250, 2 500, untés génome de Legonella pneumophla par tube réactonnel. La gamme est préparée à partr d ADN d une souche Legonella pneumophla WDCM Le premer pont de la gamme dot être égal à la lmte de quantfcaton (vor 10.4 de la norme NF T90-471). A chaque nveau, fare la mesure sur un nombre total de k gammes, k étant au mons égal à 5. Enregstrer les valeurs y, j tableau 3 de la norme, reprs c-après. obtenues et effectuer les calculs suvant l exemple donné dans le Calculer le nombre total de mesures noté N selon l équaton (1) : N k p Page 5/25

6 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Tableau 1 (NF T90-471) Mse en forme des résultats et calculs Nveau x x LQ PCR x 10LQ x 100LQ x 1000LQ 1 2 PCR 3 PCR 4 PCR p x Sommes x log 10 x ' ' 1 x x ' 2 x ' x ' 3 4 x' p y, (k j répéttons) y1,1 y2,1 y3,1 y4,1 yp,1 y1,2 y2,2 y3,2 y4,2 yp,2 y1,k y2,k y3,k y4,k yp,k Où k T y m j1 T k p, j T1 T2 T3 T4 Tp 1 m1 m2 m3 m4 mp x T ' 1 T1 x x ' 2 T2 x ' 3 T3 x ' 4 T T 4 p p T G T x' x' T x est le nombre d untés génome de Legonella pneumophla par tube réactonnel (les valeurs des nveaux x sont données à ttre d exemple) ; x' est le logarthme décmal de x y, est la valeur de CT mesurée au nveau ( vare de 1 à p ) et de rang j ( j vare de 1 à k ) j k est le nombre de répéttons par nveau ( k 5) p est le nombre de nveaux et est supéreur ou égal à 4 p 1 Vor en Annexe C de la norme un exemple complet des calculs Analyse des résultats Estmaton de la drote de régresson (Cf de la norme) La drote de régresson est donnée par l équaton (2) : ' y CTmoyen ax b Tracer sur un graphque les ponts de coordonnées (x 1, m 1), (x p, m p) pour vérfer vsuellement leur algnement le long d une drote. S cet examen se révèle postf, procéder aux calculs suvants : p 1 p 1 ' ' ' ' ' x' k x1 x2 x3 x4... x p (3) x p ' ' ' ' ' x' k x x x x... (4) Page 6/25

7 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Procéder aux calculs suvants en vue de détermner la pente a : Varance de x = Covarance de x y = x 2 N 1 xt x N 2 N 1 x T N G (5) (6) L estmaton de la pente de la drote a est donnée par l équaton (7) : cov arancedexy a var ancedex Procéder aux calculs suvants en vue de détermner l ordonnée à l orgne b : x La drote passe par le pont moyen d abscsse x et d ordonnée N T x G ' ' d où = y ax' b et donc b y ax a N N TG y N Vérfcaton de l effcacté (Cf de la norme) L effcacté évalue le bon déroulement de l amplfcaton. Calculer l effcacté e selon l'équaton (8), (vor également l Annexe C.3 de la norme) : e (10 1 a 1) 100 La pente a dot être comprse entre 4,115 et 2,839, afn que e sot comprs entre 75 % et 125 %. S a est extéreur à la fourchette ndquée c-dessus, le système d amplfcaton ne peut être valdé. NOTE L effcacté évalue le rendement de la réacton PCR. Vérfcaton des performances de la régresson lnéare (Cf de la norme) La régresson lnéare dot satsfare à l exgence d exacttude suvante sur chacun des nveaux de la gamme (crtère cumulant le bas et la fdélté) : E 0,15 (9) LIN où E LIN (exprmé en Log) est l exacttude de lnéarté. Page 7/25

8 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Pour ce fare, procéder aux calculs ndqués dans le tableau 4 de la norme (vor également l Annexe C.4 de la norme). S E 0, 15 quel que sot le nveau, alors la lnéarté est vérfée pour tout le domane. LIN S une des valeurs E LIN est supéreure à la valeur crtque de 0,15, alors le modèle de régresson lnéare ne peut être accepté. Dans ce cas, s le nombre de nveaux testés est supéreur à 4, l est possble de refare l analyse des données en retrant sot la valeur du nveau bas ( x 1 ) sot celle du nveau haut ( x ) afn de valder, le cas échéant une parte du domane lnéare. p Page 8/25

9 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Tableau 2 (NF T90-471) Calculs des bas, exacttudes de lnéarté et ncerttudes de lnéarté Nveau x estmé x 1 x 2 x 3 x 4 x p x' théorque x ' x ' x ' x ' 4 x' p x'1,1 x'2,1 x'3,1 x'4,1 x'p,1 x ', j x'1,2 x'2,2 x'3,2 x'4,2 x'p,2 x'1,3 x'2,3 x'3,3 x'4,3 x'p,3 x'1,4 x'2,4 x'3,4 x'4,4 x'p,4 x x' k x'1,k x'2,k x'3,k x'4,k x'p,k, j ' x ' x ' x ' x ' p x' Bas ' x' x x ' 1 - x ' x ' x ' x ' x ' x ' x ' 4 x' p - x' p s' k j1 x ' 2, j k j1 k 1 x k ', j 2 s ' s ' s ' s ' s' p E LIN ' ' s' ² ( x - x )² ELIN1 ELIN2 ELIN3 ELIN4 ELINp U LIN E LIN t k2 U LIN 1 U LIN 2 U LIN 3 U LIN 4 U LIN p où x' log x ; x' théorque est la valeur détermnée à partr de l équaton x, j ' est la valeur calculée en utlsant l équaton de la drote d étalonnage à partr de la valeur y, j mesurée ; x' est la valeur moyenne des x ', j ; s' est l écart-type des valeurs x, j E LIN est l exacttude de lnéarté ; U LIN est l ncerttude de lnéarté élarge ; k 2 ' avec 1 k degrés de lberté ; t est la valeur lue dans la table de Student pour k 2 degrés de lberté au rsque 5 % (vor Annexe D). NOTE L examen des valeurs de bas et d écart type permet de savor s le défaut de modèle est dû à un problème de fdélté (dsperson trop élevée) ou de justesse (bas trop élevé). Page 9/25

10 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) 3. LD, LQ et seul de postvté Les modfcatons suvantes sont proposées dans le plan d expérence par rapport à la norme : réalser 30 solutons d ADN ndépendantes Les valeurs de LD et LQ à vérfer sont celles annoncées par le fournsseur Les matéraux utlsés seront tels que décrts dans la notce du fournsseur Lmte de détecton de la PCR (Cf de la norme NF T90-471) L estmaton de la lmte de détecton PCR notée LDpcr consste à connaître le plus pett nombre d'untés génome générant un résultat postf (une amplfcaton) au seul de confance de 90 %, selon le mode opératore du laboratore. Plan d expérence : - Utlser la LDpcr annoncée et la vérfer (exemple : LDpcr = 5 copes dans le puts) ; - Réalser 30 mesures selon le protocole du fournsseur (nombre de réplcats utlsé en routne), à partr de 30 dlutons ndépendantes préparées à partr d une soluton d ADN de Legonella pneumophla raccordée à l étalon prmare. Ces 30 mesures peuvent être réalsées par le laboratore expert dans le même run. Vérfcaton de la LDpcr : au mnmum 90 % des solutons dovent être postves Lmte de quantfcaton de la PCR (Cf de la norme NF T90-471) LQ PCR est la lmte de quantfcaton de l étape PCR et LQ méth est la lmte de quantfcaton de la méthode complète. La lmte de quantfcaton LQ PCR, ncompressble compte tenu de la dsperson d échantllonnage (lo de Posson) est de 25 untés génome dénombrés sur la totalté des essas PCR réalsés sur l échantllon. La valeur de 25 est adoptée au regard de l ntervalle de confance à 95 % qu fournt une lmte basse à 17 et une lmte haute à 37. Cette dsperson est jugée acceptable. Ans, La valeur de LQ PCR vsée ne peut être nféreure à 25 UG en smplcat, 15 UG en duplcat et 10 UG en trplcat. La lmte de quantfcaton dot correspondre au premer nveau de la gamme de calbrage. La LQ PCR annoncée par le fournsseur dot être vérfée. La vérfcaton de la lmte de quantfcaton consste à s assurer que l exacttude au nveau de la lmte de quantfcaton (notée E ) est nféreure à la valeur crtque de 0,15. LQ Page 10/25

11 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Plan d'expérence : Préparer k = 30 dlutons ndépendantes à la valeur LQ PCR vsée, à partr d une soluton d ADN de Legonella pneumophla raccordée à l étalon prmare. Quantfer chacune de ces dlutons selon le protocole habtuel du laboratore (en smplcat ou duplcat ou trplcat) dans des condtons de reproductblté ntermédare (à mnma jours dfférents et/ou opérateurs dfférents). L écart-type s est donné par la formule (10) : s k 1 x ' 2 k x 1 k k 1 ' 2 où x' est la valeur calculée par calbrage nverse du log 10 du nombre d untés génome de Legonella pneumophla k est le nombre de répéttons de mesures Le bas est donné par la formule : Bas x' log( x) (11) où x est la valeur théorque de LQ PCR vsée. Calculer l exacttude au nveau de la lmte de quantfcaton, notée suvante : E ' x log( x) 2 ELQ selon la formule 2 LQ s (12) où S est l écart type des valeurs x' obtenues à partr des k mesures ; S E LQ 0,15, la lmte de quantfcaton cblée est vérfée et la LQ PCR est conforme aux spécfcatons de la norme Lmte de quantfcaton théorque de la méthode (Cf de la norme NF T90-471) (Chaptre non applcable dans le cas où seule l'étape de quantfcaton est testée) La LQ théorque de la méthode ou LQ méth (exprmée en untés génome par ltre) est obtenue à l ade de l équaton (13) de la façon suvante : LQPCR F LQméth (13) V Page 11/25

12 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) où : V F est le volume d échantllon fltré (exprmé en ltres), est le facteur multplcatf (des untés génome par puts aux untés génome par ltre) Seul de postvté La lmte en terme de Ct ou Cq fxée par le fabrcant pour déclarer l absence ou non détecton (seul de postvté) sera testée par le laboratore expert par rapport à la LD. Les valeurs de Ct ou Cq obtenues lors de la valdaton de la LD seront vérfées comme étant nféreures à la valeur de Ct ou Cq fourne par le fabrcant. Pour les kts de quantfcaton, un échantllon avec une valeur de Ct ou Cq supéreure à la valeur de l ntercepte (ordonnée à l orgne de la foncton de calbrage) sera consdéré négatf. 4. Rendement de la méthode, robustesse et ncerttude de mesure (Cf et 10.7 de la norme NF T90-471) 4.1. Plan d expérence L étude du rendement est effectuée sur 10 échantllons ndépendants, cec pour tros matrces dfférentes, à deux nveaux de contamnaton, soent 10 x 3 x 2 = 60 échantllons. Les tros types de matrces sont les suvantes : 1. une eau mnérale témon, 2. une eau chaude santare, 3. une eau de TAR. Elles devront être exemptes d acdes nucléques de Legonella et artfcellement contamnées par une suspenson mère consttuée à partr d une souche de L. pneumophla (souche WDCM 00107). Il faut que ces matrces soent au préalable ben caractérsées (caractères physco-chmques tels que ph, absence de bocdes, fltrablté ) par le laboratore expert lors de l'étude. Deux nveaux de contamnaton correspondant par exemple à 1 000, et untés génome par ltre dovent être testés. Les nveaux de contamnaton peuvent provenr de la même suspenson mère de dopage. Pour chaque nveau de concentraton et pour chaque matrce, au mons 10 échantllons (2 réplcats par jour x 5 jours) dopés ndépendants, d un volume comprs entre 50 ml et 1 L, dovent être analysés dans des condtons de reproductblté ntra-laboratore (jours dfférents et/ou opérateurs dfférents ). Pour un essa à un nveau de contamnaton, l est nécessare de consttuer une suspenson de dopage à partr de colones solées de la souche WDCM sur gélose BCYE-L- Cysténe ou GVPC. La suspenson bactérenne dot être réalsée à partr d une culture fraîche (3 jours de culture à 37 C). La procédure de contamnaton artfcelle dot permettre la mesure du nombre d untés génome avant les étapes de concentraton et d extracton des acdes nucléques. Cette mesure dot être effectuée par PCR sur une lyse drecte de la suspenson mère de dopage sur 3 prses Page 12/25

13 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) d essa dstnctes. Cette lyse dot être effectuée selon le protocole de lyse habtuel sans purfcaton. La valeur moyenne (notée en UG/L) calculée à partr des 3 valeurs servra de référence pour le calcul de rendement pour chaque nveau de contamnaton. Cette valeur servra à détermner le volume du dopage qu permettra d obtenr le nveau souhaté (1 000 ou UG/L par exemple). S le laboratore expert possède un spectrophotomètre, l peut estmer la concentraton de la suspenson mère de dopage par mesure d absorbance à 600 nm. Dans ces condtons, le volume de dopage pourrat être estmé avant d effectuer la lyse drecte. La lyse drecte et les extractons pourraent ans être réalsées en même temps et passées sur la même plaque PCR. Toutefos les nveaux de dopages demandés devront être respectés et seule la valeur PCR pourra le démontrer. Exemple de la procédure à suvre pour le jour 1 (à répéter pour les jours 2 à 5) : jour 1 préparer une suspenson mère ttrer la suspenson mère par 3 lyses drectes et 3 quantfcatons, fare la moyenne pour réalser les dlutons de suspenson de dopage dluer la suspenson de manère à obtenr 2 nveaux de charge correspondant à et UG/L préparer 4 flacons par matrce de 250 ml Contamner 2 flacons avec 100 µl de suspenson de dopage pour obtenr UG/L Cec dot être réalsé dans les tros matrces Contamner 2 flacons avec 100 µl de suspenson de dopage pour obtenr UG/L Réalser les extractons sur les 4x3 flacons dopés + 3 blancs de matrce (un par matrce) Réalser les quantfcatons après congélaton le jour chos Répéter l'expérence 5 jours dfférents consécutfs ou non (ou autres condtons de reproductblté ntra-laboratore) Cec condut à 60 extrats ssus d'un dopage ans que 15 blancs qu dovent être négatfs Effectuer la mesure de la concentraton en nombre d untés génome de la suspenson mère par PCR sur tros lyses drectes de la suspenson mère. Ces lyses dovent être effectuées selon le protocole de lyse habtuel sans purfcaton. L extrat ADN ans obtenu dot être dlué de manère à lever l nhbton due au réactf de lyse. Page 13/25

14 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) La valeur moyenne calculée à partr des 3 valeurs (notée A et exprmée en log 10 d UG/mL) sert de référence pour le calcul de rendement. Détermner à partr de cette valeur le volume du dopage qu permet d obtenr le nveau souhaté (1 000 UG/L et UG/L par exemple). Les échantllons ans consttués (3 solutons dopées) suvent le protocole de mesure complet et condusent à des résultats exprmés en log 10 d UG par unté de volume de la suspenson mère, notée B. La quantfcaton de la soluton de dopage, le protocole de dopage et de mesure dovent être réalsés successvement et le même jour Estmaton du rendement Le calcul du rendement sera effectué par dfférence de log (exemple : s le dopage a été effectué avec UG sot log 10(1 000) = 3 et que le résultat fnal est 500 UG, sot log 10(500) = 2,7 le rendement est égal à 2,7 3 = 0,3). La dfférence de log 10 (rendement) dot être comprse entre -0,6 et +0,3 ce qu correspond à un rendement comprs entre 25 % et 199 %. Le chaptre de la norme NF T donne la formule suvante (14) : log10 Re nd Echantllon x 1000 B A D log v pe où ( Echantllo nx log10 Re nd ) est le logarthme décmal du rendement de l échantllon x; A est le log10 de la quantté d UG par unté de volume de la suspenson-mère, valeur de référence obtenue drectement après la lyse drecte ; v pe est le volume de la suspenson de dopage noculé, en mcroltre ; B D est le log10 de la quantté d UG par unté de volume de la suspenson-mère, mesurée à partr de l échantllon dopé ayant suv la méthode dans son ntégralté ; est le log du facteur de dluton entre la suspenson mère et la suspenson de dopage, par exemple D vaut 3 pour une dluton au 1/1000 ème. Page 14/25

15 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Jour 1 résultats lyse drecte sur suspenson mère en UG /100µL = suspenson moyenne : UG/100µL dluton de la suspenson mère par 10 (1 ml+ 9 ml eau stérle) = suspenson 2 Dédut par calcul de la valeur de la concentraton de la valeur : 2500 UG/100µL susp1 dluton de la suspenson 2 par 10 (1 ml + 9 ml eau stérle) = suspenson 3 Dédut par calcul de la valeur de concentraton de la susp1 valeur : 250 UG/100µL Résultats de quantfcaton en UG/L nveau 1= UG/L nveau 2=1000 UG/L ajout de 100 µl de dopage par flacon contenant 250 ml de matrce Matrce 1 Matrce 2 Matrce 3 suspenson suspenson suspenson suspenson Résultats de rendement % Log % Log % Log % Log moyenne nveau 1 75,5 0, , , , , , ,174 moyenne nveau 2 58,83 0, , , , , , ,174 Moyenne matrce 1 Moyenne matrce 2 Moyenne matrce ,25 61,25 Le rendement moyen et les écarts-types assocés dovent être calculés pour chaque nveau et chaque matrce. Selon la norme NF T , la dfférence de log 10 (rendement) dot être comprse entre 0,6 et +0,3 ce qu correspond à un rendement comprs entre 25 % et 199 %. Page 15/25

16 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) 4.3. Estmaton de l ncerttude de mesure L ncerttude de mesure est estmée à partr du bas et de l écart-type de reproductblté ntermédare. L ncerttude de mesure élarge est calculée de la manère suvante (cf. chaptre 9.8 de la norme NF T90-471) : 2 2 Incerttude globale élarge : U 2 Re nd s (15) él arg e moyen 5. Vérfcaton des calculs et nterprétatons établs par le logcel 5.1. Vérfcaton des calculs Le laboratore expert devra présenter tous les calculs de résultats (pentes, nterceptes, valeurs recalculées par étalonnage nverse) effectués selon la norme NF T et par le logcel du fabrcant. Lorsque des crtères de conformté (valdté des blancs) sont établs par le logcel, les calculs dovent être vérfés par le laboratore expert Interprétaton des nhbtons Pour le témon d nhbton, la vérfcaton sera fate sur un échantllon nhbteur total par ajout dosé de l ADN de L. pneumophla (de l ordre de untés génome) et dluton successve. Quel que sot le nveau de dluton, aucune sous-estmaton (à l ncerttude de mesure près) valdée par le logcel ne sera acceptée. Page 16/25

17 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Phase 2 de l étude (réalsée par le laboratore expert) 1. Inclusvté et exclusvté des sondes et amorces Les souches ctées c-dessous dovent provenr de collectons ou d échantllons clnques ou envronnementaux et être dentfées Inclusvté (Cf. NF T ) Les amorces et sondes utlsées dovent donner les résultats attendus pour les espèces et sérogroupes suvants qu ont tous été solés chez l homme. Réalser les essas d nclusvté sur des extrats d ADN de façon à obtenr envron 100 untés génome par puts. - Lste d nclusvté (mcro-organsmes testés reconnus comme appartenant au genre Legonella) : L. ansa L. erythra 2 L. longbeachae 1-2 L. santhelens 1-2 L. brmnghamss L. feele 1-2 L. maceachern L. tucsonenss L. bozeman 1-2 L. gorman L. mcdade L. wadsworth L. cherr L. hackelae 1-2 L. oackrdgenss L. cncnnatenss L. jordans L. parsenss L. dumof L. lansngenss L.. pneumophla 1 à 15 - Lste d nclusvté (mcro-organsmes testés reconnus comme appartenant à l espèce L. pneumophla) : qunze sérogroupes de l espèce Exclusvté Réalser les essas d exclusvté sur des extrats d ADN de façon à obtenr au mnmum untés génome par puts. - Lste d exclusvté (mcro-organsmes testés reconnus comme n appartenant pas au genre Legonella et à l espèce L. pneumophla.) Ces souches dovent préférentellement être retrouvées dans les mêmes nches écologques que les Legonella et/ou être phylogénétquement proches. Au mnmum, la lste suvante dot être testée : Aeromonas hydrophla Eschercha col Pseudomonas aerugnosa Alcalgenes faecals Flavobacterum Pseudomonas fluorescens Bacllus subtls Klebsella oxytoca Pseudomonas putda Burkholdera cepaca Lstera monocytogenes Serrata marcescens Clostrdum Proteus vulgars Stenotrophomonas maltophla Enterobacter aerogenes Page 17/25

18 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) - Lste d exclusvté (mcro-organsmes testés reconnus comme n appartenant pas à l espèce L. pneumophla). En plus des souches lstées c-dessus, ajouter les 9 souches suvantes : L. mcdade L. bozeman S2 L. jordans L. dunmof L. gorman L. parsenss L. ansa L. longbeachae S1 L. tucsonenss Le résultat du test d exclusvté dot être absence de profl d amplfcaton. La lmte en terme de Ct ou Cq fxée par le fabrcant pour déclarer l absence ou non détecton sera testée par le labo expert par rapport à la LD. Pour les kts de quantfcaton, un échantllon avec une valeur de Ct ou Cq supéreure à la valeur de l ntercepte (ordonnée à l orgne de la foncton de calbrage) sera consdéré négatf. 2. Pratcablté Une étude de pratcablté, comportant les 18 crtères reportés c-après, sera réalsée. Pour chacun de ces crtères ont été défns le mode de communcaton de ce crtère auprès de l'utlsateur et le mode de contrôle de ce crtère par le laboratore expert. En effet certans crtères nécesstent une communcaton sur l'emballage ou la notce alors que d'autres nécesstent une communcaton sur l'attestaton de valdaton. Crtères à contrôler 1 Mode de condtonnement des éléments de la méthode Communcaton sur le crtère emballage ou notce Méthode de contrôle du crtère vérfcaton par le laboratore expert 2 Volume des réactfs emballage ou notce vérfcaton par le laboratore expert 3 Condtons de stockage des éléments (+ pérempton des produts non ouverts) 4 Modaltés d'utlsaton après premère utlsaton. (en partculer exstence de dates lmtes) 5 Equpements ou locaux spécfques nécessares 6 Réactfs prêts à l'emplo ou à reconsttuer (dans ce cas exstence d'un mode opératore) 7 Durée de formaton de l'opérateur non nté à la méthode emballage ou notce emballage ou notce notce emballage ou notce rapport vérfcaton par le laboratore expert que les condtons exstent vérfcaton par le laboratore expert que les modaltés exstent vérfcaton par le laboratore expert de la véracté des écrts vérfcaton par le laboratore expert de la véracté des écrts mesurée par le laboratore expert (possblté de se servr des durées mses en œuvre par les laboratores collaborateurs) et répart dans une des 3 catégores suvantes: mons de 1 jour, entre 1 jour et une semane, plus d'une semane. Page 18/25

19 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Crtères à contrôler 8 Temps réel de manpulaton / Flexblté de la technque par rapport au nombre d'échantllons à analyser, leur charge en bactéres... Communcaton sur le crtère rapport 9 Déla d'obtenton des résultats rapport et attestaton 10 Type de qualfcaton de l'opérateur 11 S'l y en a une, traçablté des résultats d'analyse rapport notce Méthode de contrôle du crtère temps de manpulaton mesuré établssement de 2 cycles décrvant chaque étape de la méthode unquement en terme de temps précsé par le laboratore expert (le laboratore expert peut se servr des données des laboratores collaborateurs) vérfcaton par le laboratore expert 12 Mantenance par le laboratore rapport durée et fréquence 13 Volume mnmal à ppeter rapport A rensegner par le laboratore expert 14 Stablté des réactfs et des gammes 15 UNG (préventon des contamnatons) rapport rapport A rensegner par le laboratore expert : Réactf Condtons de stockage Durée de valdté Alquotage Note : A vérfer lors de l audt NF Valdaton A rensegner par le laboratore expert 16 Protecton des réactfs aux UV rapport A rensegner par le laboratore expert 17 Contrôle externe quanttatf de la PCR rapport Présence à vérfer par le laboratore expert 18 Contrôle d absence d nhbteur rapport Vérfcaton par le laboratore expert de l absence d nhbteur par contrôle nterne ou ajout dosé Page 19/25

20 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Phase 3 de l étude : étude nterlaboratore L étude nterlaboratore est destnée à évaluer la fdélté d un kt commercal. 1. Organsaton de la campagne d essas Elle est prévue en 3 phases. Un mnmum de 10 laboratores partcpants est consellé afn de garantr au mons 8 résultats nterprétables. Phase 1 : EXTRAITS D ADN Deux extrats d ADN de Legonella sont réalsés à partr des 10 espèces de Legonella de la lste suvante : L. mcdade L. bozeman S2 L. dunmof L. gorman L. ansa L. longbeachae S1 L. jordans L. tucsonenss L. parsenss L. pneumophla S1 Consttuton de 2 échantllons, chacun à 2 concentratons dfférentes. Les mesures seront fates selon les prescrptons du fournsseur (ex : 3 réplcats donnent 1 résultat). Il faut réalser 2 mesures de manère à obtenr 2 résultats pour chaque concentraton. L objectf de l essa ADN est de caractérser la répétablté et la reproductblté nter laboratores des dfférents systèmes PCR (amorces/sonde), ans que la justesse. Son évaluaton sera possble au travers de la moyenne des laboratores vu qu l n y pas de valeur vrae ou conventonnelle dsponble. Phase 2 : SUSPENSIONS BACTERIENNES A partr d une suspenson bactérenne de Legonella pneumophla, Legonella spp et non Legonella, les laboratores doperont une matrce exempte d ADN de Legonella commune à tous les partcpants, de manère à obtenr 2 nveaux de concentraton et 2 répéttons par nveau. L objectf de cet essa est d estmer la répétablté et la reproductblté des méthodes globales. Phase 3 : ECHANTILLON NATURELLEMENT CONTAMINE Homogénésaton d une matrce d eau chaude santare fltrable neutralsée, naturellement contamnée en Legonella pneumophla, avec une flore assocée (cf. NF EN ISO 6222) mportante (supéreure à 10 4 UG/L). Cette matrce ne dot pas poser de problème majeur lé à l nhbton. Cf. annexe A1 pour le protocole de test d'homogénété et de stablté. Plan d expérence de l essa : chaque laboratore partcpant recevra 2 flacons pour effectuer 2 mesures en condton de répétablté. Page 20/25

21 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) 2. Calendrer prévsonnel Un calendrer sera élaboré en concertaton avec les dfférents laboratores sélectonnés. Les envos seront réalsés par le laboratore expert (cf. annexe A2). 3. Explotaton statstque des données Cette étude a pour objectf de vérfer la fablté de la méthode à valder. Elle vse à effectuer les premères évaluatons de l exacttude de mesure, terme prs au sens de la norme ISO 5725 : «étrotesse de l accord entre les résultats de mesures et la valeur de référence acceptée». Conformément à la norme ISO 5725, on prend comme cble la valeur de consensus se dégageant de l ensemble des valeurs observées; en pratque la moyenne des résultats dans le cadre d une dstrbuton Normale des données. C est pourquo dans la sute on ne parle plus d exacttude, mas de fdélté; au sens de la norme ISO 5725 : étrotesse de l accord de mesures répétées ndépendantes. Les essas proposés consstent donc à réalser des plans d expérences destnés à quantfer la fdélté de la méthode; cec dans une stuaton de dffculté crossante : calcul de la fdélté unquement lée à l alquotage prévu par la méthode (= approche purement théorque basée sur la lo de Posson, qu permettra d établr la dsperson ncompressble des données à laquelle l faut au mons s attendre); mesure de la fdélté sur une parte de la méthode, le système PCR (amorces / sonde); cec sur des extrats d ADN (d abord extrats purs de L. pneumophla, pus mélange d extrats de dfférentes Legonella); mesure de la fdélté de la totalté de la méthode sur des suspensons bactérennes caractérsées (suspensons pures de L. pneumophla, pus mélange de suspensons pures de dverses Legonella et d nterférents); mesure de la fdélté en stuaton réelle (eaux chaude santare naturellement contamnée. Exprmer les résultats selon la norme ISO NOTE Seuls les résultats pour lesquels l ensemble des contrôles qualté sont conformes au sens de la norme NF T seront explotés par le laboratore expert. L excluson des résultats d un laboratore dot rester exceptonnelle et dot être systématquement documentée (enquête du laboratore organsateur auprès du laboratore collaborateur). Page 21/25

22 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) ANNEXE A Annexe A1 : protocole de test d homogénété Un essa d homogénété devra être effectué par le laboratore expert. Ex : pour 10 laboratores partcpants, le laboratore expert consttuera 30 flacons, chaque laboratore partcpant recevra 2 flacons et le laboratore expert fera 3 mesures sur 3 flacons dfférents pendant 3 jours consécutfs pour évaluer l homogénété et la stablté. Pour la phase 1, l homogénété des essas ADN sera évaluée par une mesure en PCR quanttatve sur le système spp de 20 alquotes. Pour les phases 2 et 3, l homogénété et la stablté des essas suspenson seront évaluées par une extracton d ADN et une mesure en PCR quanttatve sur le système spp de 9 alquotes. Annexe A2 : protocole d envo des échantllons La laboratore expert (organsateur) prépare les matéraux le lund (1 er jour d une semane de 5 jours ouvrés) et les stocke à une température de 5 C 3 C. Ces matéraux sont enlevés par transporteur spécalsé le mard matn. Le transporteur dot garantr une température de 5 C 3 C, maîtrsée et tracée pendant le transport. La lvrason dot avor leu avant le mercred md pour tous les laboratores partcpants. A récepton, les laboratores partcpants devront renvoyer au laboratore expert un accusé de récepton qu mentonnera au mnmum : la date et l heure de récepton, l état des matéraux reçus, la température de l encente et la température enregstrée pendant le transport. Les laboratores partcpants devront mmédatement stocker les matéraux reçus à une température de 5 C 3 C. Les préparatons et les mesures seront démarrées le jeud matn de manère à être termnées le jeud sor. L nterprétaton et le renvo des résultats sur le formulare fourn devront être fats selon les ndcatons du laboratore expert. Phase 1 : quatre tubes de 150 µl de soluton d ADN sont envoyés par transporteur spécalsé à 5 C 3 C. Les laboratores seront prévenus quelques jours à l avance de l arrvée des échantllons par mal. Les consgnes de réalsaton des essas et les formulares de réponse sont envoyés par mal. Phase 2 : quatre flacons de 250 ml d échantllon artfcellement contamné sont envoyés par transporteur spécalsé à 5 C 3 C. Les laboratores seront prévenus quelques jours à l avance de l arrvée des échantllons par mal. Les consgnes de réalsaton des essas et les formulares de réponse sont envoyés par mal. Phase 3 : Achemnement de 2 flacons de 250 ml d échantllon ECS en cols sotherme à température drgée (5 C 3 C). Page 22/25

23 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Annexe A3 : formulare de consgne pour la réalsaton des essas/fchers de réponse Un formulare décrvant toutes les étapes nécessares pour la réalsaton des essas est envoyé par courrel avant l arrvée des essas. Il mentonnera les volumes des essas, les réplcats des échantllons à effectuer, la nature de la matrce exempte d ADN de Legonella etc Fcher de résultat (Excel) pour un essa ADN : vor c-dessous EIL ADN date de récepton température de stockage date d'alquotage système spp date de la PCR n = selon prescrptons du fournsseur estmaton de l'échantllon A1 estmaton de l'échantllon A2 estmaton de l'échantllon B1 estmaton de l'échantllon B2 Log du nb de copes/puts PCR réplcat n réplcat n réplcat n moyenne écart type système pneumophla date de la PCR estmaton de l'échantllon A1 estmaton de l'échantllon A2 estmaton de l'échantllon B1 estmaton de l'échantllon B2 Log du nb de copes/puts PCR réplcat n réplcat n réplcat n moyenne écart type Page 23/25

24 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Fcher de résultat (Excel) pour un essa suspenson : vor c-dessous EIL SUSPENSION date de récepton température de stockage de la suspenson date d'extracton température de stockage des extrats ADN méthodologe concentraton des bactéres s fltraton, nature de la membrane type d'extracton de l'adn nature de la purfcaton fracton de l'échantllon ms en plaque spp date de passage en PCR estmaton de l'échantllon A1 estmaton de l'échantllon A2 estmaton de l'échantllon B1 estmaton de l'échantllon B2 Log du nb de copes/puts PCR réplcat n réplcat n réplcat n moyenne des échantllons écart type des échantllons pneumophla date de passage en PCR estmaton de l'échantllon A1 estmaton de l'échantllon A2 estmaton de l'échantllon B1 estmaton de l'échantllon B2 Log du nb de copes/puts PCR réplcat n réplcat n réplcat n moyenne des échantllons écart type des échantllons Page 24/25

25 NF148 - Marque NF VALIDATION (applcaton à l analyse de l eau) Protocole de valdaton PCR Légonelles Révson 3 (Edton du Approbaton du ) Fcher de résultat (Excel) pour un essa échantllon naturellement contamné : vor c-dessous EIL ECHANTILLON NATURELLEMENT CONTAMINE date de récepton température de stockage de la suspenson date d'extracton température de stockage des extrats ADN méthodologe concentraton des bactéres s fltraton, nature de la membrane type d'extracton de l'adn nature de la purfcaton fracton de l'échantllon ms en plaque spp date de passage en PCR estmaton de l'échantllon A1 estmaton de l'échantllon A2 estmaton de l'échantllon B1 estmaton de l'échantllon B2 Log de nb de copes/puts PCR réplcat n réplcat n réplcat n moyenne des échantllons écart type des échantllons pneumophla date de passage en PCR estmaton de l'échantllon A1 estmaton de l'échantllon A2 estmaton de l'échantllon B1 estmaton de l'échantllon B2 Log du nb de copes/puts PCR réplcat n réplcat n réplcat n moyenne des échantllons écart type des échantllons Page 25/25