PCR Toxoplasma et Pneumocystis : infection ou colonisation?

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1 PCR Toxoplasma et Pneumocystis : infection ou colonisation? Jean Menotti Laboratoire de Parasitologie-Mycologie Hôpital Saint-Louis / Université Paris-Diderot jean.menotti@sls.aphp.fr

2 Diagnostic de la toxoplasmose chez le patient immunodéprimé Attitude pragmatique : imagerie +++ sérologie positive épreuve thérapeutique Mise en évidence directe du parasite difficile : IRM cérébrale examen direct peu sensible inoculation à l animal ou culture cellulaire : délai trop long diagnostic par PCR +++ Toxoplasmes dans un LBA

3 Diagnosis of toxoplasmosis by PCR PCR assays on B1 gene, P30 gene, rrna gene conventional PCR Burg et al., 1989; Franzen et al., 1997; Lamoril et al., 1996; Robert-Gangneux et al., 1999; MacPherson et al., 1993; Ostergaard et al., 1993 real-time PCR Costa et al., 2000; Lin et al., 2000; Kupferschmidt et al., 2001 ; Joss et al., 2008 PCR assays on a genomic 300-fold repetitive 529 bp DNA fragment Homan et al., 2000; Reischl et al., 2003; Cassaing et al., 2006 ; Fekkar et al., 2008

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7 Development and evaluation of a 5 -nuclease real-time PCR assay for quantitative detection of Toxoplasma gondii DNA Aim: To develop a new 5 -nuclease real-time PCR assay that targets the 200- to 300-fold repetitive AF gene To assess its performances for diagnosis and treatment follow-up of toxoplasmosis

8 Real-time PCR for the quantitation of Toxoplasma gondii DNA: primers and probe design T. gondii AF gene (529 bp) TG-F primer TG-R primer TaqMan probe ( )

9 Standard curve

10 Retrospective analysis Clinical specimens: 144 clinical specimens previously analyzed for the presence of T. gondii DNA by a PCR-ELISA assay that targets the B1 gene of T. gondii (Robert-Gangneux et al., 1999) DNA extraction from blood, blood buffy coats, sera, cerebrospinal fluid, BAL fluid, aqueous humor, biopsies or placenta by using QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)

11 Retrospective analysis: results PCR-ELISA on B1 gene positive negative Real-time PCR on AF gene positive negative

12 Observation Patient de 43 ans présentant une leucémie myéloïde chronique (sérologie T. gondii positive) greffe de moelle allogénique (sang de cordon séronégatif pour T. gondii) à J40, 41 et 42 : fièvre, céphalées, photophobie TDM cérébrale : plusieurs lésions hypodenses mais sans halo périlésionnel Traitement par sulfadiazine (6 g/j) + pyriméthamine (75 mg/j) Apyrexie 48 h après initiation du traitement Amélioration progressive des images radiologiques sous traitement Menotti et al., JCM 2003

13 Quantitation of T. gondii DNA by real-time PCR assay targeting AF gene Whole blood Initiation of treatment by pyrimethamine + sulfadiazine No. of tachyzoites/ml Days

14 Comparison between real-time PCR assays using 2 different targets Whole blood B1 gene AF Ct Mean gain of 7.7 cycles Days

15 Prospective analysis 203 clinical specimens: all clinical specimens received at Saint-Louis Hospital during a 4-month period. Each specimen was tested both by: the new real-time PCR assay the PCR-ELISA assay that targets the B1 gene of T. gondii (Robert-Gangneux et al., 1999)

16 Prospective analysis: results Patient Clinical background Specimen Date PCR-ELISA Real-time PCR (No. of tachyzoites/ml) P1 HIV infection CSF Oct. 11 th P2 HIV infection CSF Oct. 15 th + 71 P3 HIV infection CSF Nov. 22 nd + 67 P4 HIV infection Whole blood Dec. 4 th Whole blood Dec. 6 th BAL fluid Dec. 11 th Whole blood Dec. 13 th Buffy coat Dec. 13 th Bone marrow Dec. 13 th P5 HIV infection Serum Dec. 21 st P6 Toxoplasmic seroconversion during pregnancy Placenta Dec. 23 rd P7-P61 Various Various Various - Undetectable Menotti et al., CMI 2010

17 Conclusions Très bonnes sensibilité et spécificité de la technique de PCR en temps réel amplifiant le gène AF Confirmation de l intérêt d utiliser ce gène hautement répété pour améliorer le diagnostic de la toxoplasmose Intérêt majeur de la PCR en temps réel pour le suivi thérapeutique Diagnostic plus précoce, parfois avant l apparition des signes cliniques

18 Classification des toxoplasmoses survenant après allogreffe de moelle Martino et al. for the European Group for Blood and Marrow Transplantation Infectious Diseases Working Party

19 Martino et al, CID 2005 Etude prospective de 106 patients allogreffés de moelle osseuse pour l incidence de la réactivation toxoplasmique dans les 6 premiers mois après la greffe : Incidence de la toxoplasmose-infection : 16% (IC 95 : 8-21%) Incidence de la toxoplasmose-maladie : 6% (IC 95 : 1-10%) Chez la plupart des patients, le début de la maladie ou du traitement de l infection était précédé par une augmentation des charges parasitaires sanguines Conclusions : Incidence élevée de la toxoplasmose après HSCT allogénique PCR = outil approprié pour décider d un traitement préemptif chez des patients à haut risque de toxoplasmose

20 Genre Pneumocystis Micromycètes atypiques (classe des Ascomycètes) Etroite spécificité d hôte : P. jirovecii : homme P. carinii et P. wakefieldiae : rat P. murina : souris P. oryctolagi : lapin Liaison spécifique aux pneumocytes de type I Prolifération dans les alvéoles pulmonaires pneumonie à Pneumocystis (PCP) chez les sujets immunodéprimés

21 Pneumonie à Pneumocystis (PCP) Triade classique d apparition progressive de : - fièvre - toux sèche - dyspnée d intensité croissante VIH + VIH - Début insidieux brutal Fièvre + + Toux sèche + + Dyspnée +/- + Evolution lente rapide Mortalité 10 à 20 % 30 à 60 % Imagerie : pneumopathie interstitielle (absence dans 10-15% des cas) Scanner : verre dépoli irrégulier Hypoxie ++ Populations à risque : Thomas et Limper, Infection VIH - Hémopathies malignes - Greffe de moelle osseuse - Transplantation d organes solides - Cancers solides - Maladies inflammatoires et auto- immunes - Traitements immunosuppresseurs - Nourrissons prématurés ou atteints de déficits immunitaires

22 Diagnostic microscopique Prélèvements: LBA, expectoration induite, biopsie Examen à frais Amas spumeux Colorations Formes trophiques (MGG, RAL) Kystes (Gomori Grocott, Bleu toluidine) B A Immunofluorescence Directe Indirecte C Source des photos CD-ROM ANOFEL 3 22

23 Diagnostic moléculaire PCR classique Nested PCR Wakefield et al., 1990 Wakefield et al., 1996 ARNr ARNr Risque de contaminations + ++ Très bonne VPN de la PCR Pneumocystis (Azoulay et al., 2009) PCR en temps réel - plus rapide - moins de manipulation 21 références depuis 2001 ARNr, MSG, DHPS, DHFR, HSP70 Question: interprétation d une PCR positive? - Infection? - quantification (PCP / colonisation) Larsen et al., 2002 Flori et al., 2004 Bandt et al, 2007 Huggett et al., 2008 Alanio et al., Pneumocystose? - Portage?

24 Diagnostic moléculaire PCR quantitative sur LBA et expectorations induites Charge supérieure chez patients VIH+ par rapport à VIH- Discrimination possible entre portage et PCP, en utilisant 2 valeurs de cut-off Alanio et al., CMI 2011

25 Diagnostic moléculaire PCR quantitative sur LBA et expectorations induites Charge supérieure chez patients VIH+ par rapport à VIH- Discrimination possible entre portage et PCP, en utilisant 2 valeurs de cut-off Alanio et al., CMI 2011

26 Eur Respir J 2012

27 Conclusions Test sensible pour la détection d ADN de P. jirovecii Nouvel outil pour discriminer PCP et colonisation : Charge fongique élevée PCP Charge fongique intermédiaire PCP ou colonisation Charge fongique faible colonisation (sous réserve de la qualité du prélèvement)

28 Concept de colonisation Détection de Pneumocystis ou de son ADN chez un hôte qui ne présente pas de signe de pneumonie Mise en évidence grâce au développement des méthodes moléculaires de détection (PCR, PCR en temps réel)

29 Populations colonisées Population Colonisation Facteurs de risque Références Enfants immunocompétents (primo-infection) 16 à 32% Vargas 2001 ; Nevez 2001 ; Totet 2003 ; Larsen 2007 Patients infectés par le VIH Immunodépression hors VIH Pathologie pulmonaire sous-jacente 10 à 68% (npcr) CD4 < 400 (p=0,03) Tabagisme (p=0,02) Résidence (p=0,002) 11 à 60% Transplantation CD4 < 400 (p<0,001) Corticoïdes (p<0,001) Grossesse (p=0,04) Mucoviscidose : 1,3-22% BPCO : 16-55% Sévérité BPCO Cancer petites cellules Tabagisme (p=0,02) Personnels hospitaliers 8 à 37% Contact avec patients ayant une PCP Leigh 1993 ; Nevez 2001 ; Matos 2001 ; Wakefield 2003 ; Morris 2004 ; Davis 2008 ; Alanio 2011 Nevez 1999 ; Helweg-Larsen 2002 ; Maskell 2003 ; Vargas 2003 ; Mori 2009 ; Alanio 2011 Sing 1999 ; Probst 2000 ; Sing 2001 ; Helweg-Larsen 2002 ; Matos 2003 ; Calderon 2004 ; Morris 2004 ; de la Horra 2004 ; Respaldiza 2005 ; Nevez 2006 ; Vidal 2006 ; Calderon 2007 ; Le Gal 2010 Vargas 2000 ; Miller 2001 ; Durand-Joly 2003 ; Medrano 2005

30 Colonisation : conséquences Conséquences cliniques et physiopathologiques Risque évolutif d une colonisation en PCP: mal évalué Simple marqueur du processus pathogène sous-jacent? Pathogénicité de la colonisation? Persistent pneumocystis colonization leads to the development of chronic obstructive pulmonary disease in a nonhuman primate model of AIDS. Shipley TW, Kling HM, Morris A, Patil S, Kristoff J, Guyach SE, Murphy JE, Shao X, Sciurba FC, Rogers RM, Richards T, Thompson P, Montelaro RC, Coxson HO, Hogg JC, Norris KA. J Infect Dis Jul 15;202(2): Airway obstruction is increased in pneumocystis-colonized human immunodeficiency virus-infected outpatients. Morris A, Alexander T, Radhi S, Lucht L, Sciurba FC, Kolls JK, Srivastava R, Steele C, Norris KA. J Clin Microbiol Nov;47(11):

31 Colonisation : conséquences Conséquences cliniques et physiopathologiques Risque évolutif d une colonisation en PCP: mal évalué Simple marqueur du processus pathogène sous-jacent? Pathogénicité de la colonisation? Prise en charge des patients colonisés Faut-il traiter? Bénéfice collectif: diminution du réservoir Bénéfice individuel:? Conséquences environnementales et épidémiologiques Colonisés = réservoir de Pneumocystis? Isolement des patients colonisés vis-à-vis des patients immunodéprimés? Évaluation du risque d aérotransmission Connaissance des conditions de transmission/infection

32 Voies de transmission