Recherche des transcrits de fusion AML1/ETO et CBFB-MYH11 dans les LAM de l`adulte.

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1 Recherche des transcrits de fusion AML1/ETO et CBFB-MYH11 dans les LAM de l`adulte. F.Harieche, W.Assouak, A.Trabzi, M.Saidi, F.Zerhouni, R.M.Hamladji.

2 LAM Entité distincte Leucémies aigues. Transformation clonale d`un précurseur hematopoeitique myéloïde incap de se différencier. Classification FAB (morpho+ccc)+immunophénotype: 8 catégories LAM: LAM0 LAM7 Différenciation cytologique: Gx, mono, EB,mega Degré de maturation

3 Classification OMS 2001 Combinaison plusieures approches: Morphologie Cytochimie Immunophenotype Caractéristiques génétiques: cytog + moléculaires Éléments cliniques ( trt antérieur, antécédents de MDS). Nouvelles entités biologiques Éléments utiles au pronostic

4 LAM - Classification OMS er groupe: LAM avec translocations chromosomiques récurrentes: LAM avec t(8;21)(q22;q22) AML1(CBFa) /ETO LAM avec t(15;17)(q22;q11-12) PML/ RAR-a var LAM avec Inv(16)(p13;q22) CBFb /MYH11 LAM avec anomalies 11q23(MLL) 2e groupe: LAM avec myelodysplasie «multi lignée»: Avec antécédent de SMD Sans antécédent de SMD 3e groupe: LAM et SMD secondaires a des thérapeutiques: Après Agents alkylants Après epipodophyllotoxine 4e groupe: LAM n`entrant pas dans les catégories précédentes. Définition du FAB: LAM0 LAM7 LAM avec différenciation basophile LAM avec myelofibrose LA bi phenotypiques.

5 Altérations génétiques / LAM Translocations chromosomiques récurrentes Associées sous-type de L.A Valeur diagnostique et pronostique établie Décisions thérapeutiques.

6 Anomalies chromosomiques récurrentes Mises en évidence par analyse cytogénétique conventionnelle (étude du caryotype médullaire). Développement des technologies; Amélioration des techniques de biologie moléculaire: simplicité: sgn ou MO rapidité: pas de mise en culture spécificité: amorces et sondes spqs sensibilité Détection moléculaire de ces anomalies.

7 Gènes de fusion ARN de fusion Gène A chromosome 1 Gène B chromosome 2 Gène de fusion Transcrit de fusion RT-PCR

8 LAM - CBF Définies sur leurs anomalies chromosomiques. Regroupées car pronostic similaire Localisation Transcrit Maladie Fréquence Pronostic t(8;21)(q22;q22) AML1 (CBFa)/ ETO LAM(2,1,4) 5-13% bon LAM % Inv(16)(p13;q22) CBFB / MYH11 LAM(4, 5) 8,5% bon LAM4eo 50% CBF= CORE BINDING FACTOR; facteurs de transcription régulation de l`expression des gènes.

9 LAM groupe CBF Associées à des syndromes cytologiques spécifiques. Suspectées morpho +/- Immunophénotype. Identifiées comme LAM de bon pronostic: Taux de rémission élevé Les remissions de longue durée.

10 Objectifs Appréciation de la fréquence des LAM CBF de l`adulte Recherche systématique des transcrits: AML1(CBF a) /ETO CBF b /MYH11 LAM «de novo» Comparer aux données de la littérature. LAM3 exclues.

11 Patients -1- N= 62 LAM janv fev 2007 Service d`hémato - GMO CentrePierre et Marie Curie) leucémie aigue de Novo Diagnostic: Morphologie + cytochimie: FAB Immunophenotypage: Cytometrie en flux (cellules blastiques médullaires ou sanguines en suspension). Bio mol: - Sang total (EDTA): 58 patients. - suc médullaire: 4 patients: leucopeniques pauciblastiques. traités rapidement car ARN fragiles

12 Patients -2- Sexe ratio (h/f): 1.48 (37/25) Age: médiane: 32 ans [ ] GB (G/L): médiane 35 [ 2,4-170 ] LAM0 LAM1 LAM2 LAM4 LAM5 LAM6 LA biphéno (6 M4eo) 6 3 4

13 Méthodes RT-PCR Protocole E.A.C (European Biomed Concerted Action) Amorces Biomed 3 étapes: Phase 1: purification des ARN Phase 2: RT (synthèse de cdna) Phase 3: PCR.

14 Phase 1: extraction de l`arn Trizol selon la méthode de Chomczynski and Sacchi. Control: Qualitatif: migration sur gel: 18S; 28S. Quantitatif: spectro U.V: DO260/DO280 ~1,8.

15 Étape 2: Reverse transcription ARN copiés en ADN: enzyme spécifique des rétrovirus: Transcriptase inverse (RT-MMLV). Protocole EAC: 1ug d`arn pour un vf de 20ul Copies d`adnc : PCR Biomed 35 cycles.

16 RT-PCR Transcriptase inverse ADN c 2 35 copies Elctrophorese sur gel d`agarose

17 Électrophorèse Gel d`agarose a 2% + BET 100pb patient H20 T+

18 Gène de ménage expression ubiquitaire et constante Abelson: contrôle d`amplification in vitro.

19 Interprétation Qualité de l`arn ABL- Présence transcrit: bande taille (pb) attendue Lignée cellulaire témoin:» Kasumi: AML1 /ETO» ME-1: CBFb-MYH11 (type A) (10 variants A J)» Patient +. Absence de bande spq: négatif.

20 Résultats Transcrit CBF: 6/62 ~ 10% LAM Transcrit CPMC Littérature p AML1 /ETO 3/62 (5%) LAM 8 12 % LAM /18 (16%) LAM % LAM2 CBFb-MYH11 3/62 (5%) LAM 8-10% LAM /6 (50%) LAM4eo 50% LAM4 eo

21 AML1 - ETO Patient age sexe WBC (G/L) Blastes mo I/Phéno UP1 37 F % LAM2 CD19+ UP2 27 H 20 38% LAM2 CD19+ UP3 38 F 17 31% LAM2

22 CBFb MYH11 Patient age sexe WBC (G/L) Blastes mo I/Phéno UP1 46 H 40 40% LAM4 UP2 41 F % LAM4 UP3 38 F 75 78% LAM4

23 Morphologie cellulaire- AML1-ETO

24 Morphologie cellulaire- AML1-ETO

25 Morphologie cellulaire CBFb MYH11

26 Morphologie cellulaire CBFb MYH11

27 Commentaires Transcrits: identification entité biologique: LAM CBF. Suspectées : Critères morpho: dysgranulopoeise: AML1-ETO Présence de PE anormaux(mo) sans hyper PE; CBF-b/MYH11 Critères immuno phenotypiques: Coexpression du CD19: 2/3 AML1-ETO. Age? WBC? Blastes médullaires: précisés sur un plus grand nombre de patients.

28 conclusion Transcrits de fusion = translocation cytog Marqueurs de MRD. RT-PCR:»Rapide» Sensible» Spécifique. Résultats: qualité de l`arn vulnérable.