Voyage au cœur du fruit techniques classiques et nouvelles

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1 Voyage au cœur du fruit techniques classiques et nouvelles Catherine Cheniclet UMR 619 Biologie du fruit, Villenave d Ornon Pôle Imagerie du Végétal journées RµI novembre 2010

2 0 jaa Divisions cellulaires Grandissement cellulaire E1 nouvelles assises E1 E2 E2c E2f E2d E2e E2 E3 endopolyploidisation E2b E4 I3 I2 I1 DNA x2 x2 x2 x2 x2 x2 x2 2C 4C 8C 16C 32C 64C 128C 256C E2a E3 E4 croissance cellulaire Remaniements structuraux I3 noyaux mitochondries I2a I2a Rôle de l endopolyploïdisation dans le développement du fuit? I2b I2 I2 I1

3 Croissance cellulaire Mitochondries Structure noyaux Mesure ploïdie

4 Macroscopie Appareil photo Fruit coupé en deux dimensions du fruit épaisseur du péricarpe 2 cm Loupe binoculaire + bleu toluidine taille cellulaire moyenne 1 mm Colorer seulement en surface, éclairer par dessus

5 Coupes main levée ou microtome à lame vibrante Épaisseur 200µm Avantages rapide cellules entières pénétration des marqueurs fluorescents Ex : DAPI ADN Observation des noyaux au confocal 20 µm 20 µm

6 Coupes main levée ou microtome à lame vibrante Épaisseur 200µm Inconvénients Mesure taille cellulaire difficile Superposition des petites cellules Coupes plus fines difficile sur fruit tomate Épaisseur 60µm Fruit : coupes < 70 µm Se déchirent pour faire des coupes plus fines il faut inclure en résine

7 Inclusion en résine coupes 1-3 µm d épaisseur déshydratation fixation 2-3 jours ou quelques heures avec micro-ondes imprégnation inclusion en moules microtomie

8 Coupes en résine Visualisation petites cellules Mesure surface cellules individuelles par segmentation automatique (Image Pro) Éclairement! homogène + filtrage + corrections manuelles Épaisseur 2 µm Plan de coupe aléatoire biais

9 Résine : Technovit ou Epon Technovit Epon Coupes grandes surfaces Coupes petite surface Use peu les couteaux rapide Dure changer souvent de couteau ou utiliser diamant Préservation structurale pas optimale (?) Bonne préservation structurale Pas de coupes < 1 µm Pas MET Coupes ultra-fines ( 40 nm) Stable en MET

10 De la microscopie optique à la microscopie électronique Un ex. de microscopie corrélative MO X100 limite de résolution Coupe semi-fine Epon x6,25 x J ny1 x63x1,6crop MET x2600 Épaisseur 50 nm 3 mm grille

11 Microscopie électronique à transmission x Grandissements élevés ( x ) Résolution ~ 1 nm (tissu biologique) Champ réduit Faible épaisseur 3D limitée (tomographie) Tissu fixé 200 nm

12 Les noyaux ont une taille et une forme très variables selon leur position dans le péricarpe Noyaux triés/taille (ImagePro) tous au même grandissement

13 Lien entre ploïdie et structure du noyau? endopolyploidization DNA x2 x2 x2 x2 x2 x2 x2 2C 4C 8C 16C 32C 64C 128C 256C Ploidy levels Cytomètre 4C 8C 16C 32C 64C 2C 128C tampon+dapi?????? Proportions des classes de ploïdie Comment déterminer le niveau de ploïdie des noyaux in situ?

14 Essai de mesure «directe» de la ploïdie in situ /DAPI Coupe fraîche de péricarpe marquage DAPI acquisition d images en épifluorescence (sans saturation) mesure de l intensité de fluorescence des noyaux Petites cellules superposition Noyau profond + parois Noyau entouré de plastes 100 µm Mesures d intensité biaisées

15 Mesure de ploïdie par hybridation in situ (FISH) Sonde BAC 120kb spécifique du chromosome 7 marquée à la biotine Texas Red Contrôle spécificité sur métaphase (pointe de racine de Tomate) locus dans zone télomérique 2 loci visibles même sur chromatides proches O. Coriton

16 Validation de la méthode sur noyaux triés selon ploïdie Tri noyaux péricarpe30 j Hybridation Acquisition stacks confocal Comptage dots Metamorph Filtre débruitage Projection max Segmentation Surface/objet standard Dot number Chromosomes polytènes endoréduplication Ploidy level

17 Mesure de la ploïdie dans le péricarpe Fix PF4% coupes 150µm sur lame + colle en tube cellulasepectolyase déshydratation FISH Dénaturation + longue que pour noyaux isolés 76 dots 64C 36 dots 32C 10 µm Cartographie ploïdie 10 µm 0,5 mm mise en place des assises structure noyaux

18 Endoréduplication et mitochondries Nombreuses mitochondries proches de l enveloppe nucléaire, dans les invaginations Relation ploïdie nombre de mitochondries? 600 nm 200 nm Mesure ImagePro longueur d enveloppe nombre mitochondries Seulement en 2D

19 Estimer le nombre de mitochondries en 3D : test marqueurs fluorescents mitochondries marquage Autres membranes marqueur mitochondries Autres memb. DIOC6-(3) et (5) + ++ Rhodamine ε Dihydro-rhodamine ε Nonyl acridine orange + ++ Mitotracker orange JC-1 ++ ε Mitotracker rouge Problème autofluorescence chlorophylle Rhodamine 123 : cation lipophile séquestré par les mitochondries actives tissu non fixé

20 Marquage des mitochondries à la rhodamine 123 rho123 DAPI 0,2-0,5 µm 2min 1 µg/ml 1min Projection maximum Observation confocal x63 NA1,4 Ex 496 nm Em nm Projection maximum DAPI projection maximum déconvolution Rhodamine projection maximum 23 plans z 1µm Non optimisé car bleaching rapide Mitochondrie ~ 0,5x1µm

21 Comptage des mitochondries : quelle méthode? Actuellement : comptage plan par plan (tag ImagePro) sur images déconvoluées cumul des tags Les mitochondries bougent (un peu) 278 mitochondries Perspectives : acquisitions plus rapides au spinning disk analyse sous Metamorph ou Amira (3D)

22 Conclusion Les différentes approches se valident mutuellement rho123 DAPI déconvolué non fixé fixé 10µm

23 Institut des sciences du végétal Gif/Yvette Imagif Plateforme de cytométrie Spencer BROWN Olivier CATRICE Mickaël Bourge UMR Biologie du Fruit Bordeaux Groupe organogenèse du fruit et endoréduplication Resp. Christian CHEVALIER Amélioration des plantes et biotechnologies végétales Le Rheu Plate-forme cytogénétique moléculaire Olivier CORITON ENDOREPIGEN Pôle Imagerie du Végétal Matthieu Bourdon Norbert BOLLIER Adeline MOÏSE Nathalie FRANGNE Catherine CHENICLET Valérie ROUYERE Jean-Pierre RENAUDIN Pôle Imagerie Photonique Martine PEYPELUT Christel POUJOL

24 Exemples de plans

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