Digestion par les enzymes SalI et EcoRV. Digestion par les enzymes XhoI et SmaI

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3 Digestion par les enzymes SalI et EcoRV Digestion par les enzymes XhoI et SmaI

4 Klenow: sous-unité de l ADN Polymérase I d E. coli possédant une activité ADN polymérase 5-3 et une activité exonucléasique 3 _5

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6 Vecteur coupé par EcoRI Fragment coupé par EcoRI

7 Incubation une nuit à 37 C Incubation une nuit à 37 C sous agitation Extraction d ADN plasmidique Analyse de restriction sur une partie de l ADN : Ex: ADN+EcoRI+BamHI Electrophorèse Visualisation sous UV après coloration au BET(Bromure d éthydium) On en déduit le type de plasmide présent dans chaque tube Chaque tube contient un seul type de plasmide (un plasmide dans une bactérie est à l origine d un clone=colonie bactérienne contenant toute le même plasmide

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9 Etc Produit majoritaire à la fin de la PCR (15-20 cycles)

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11 EXPRIMER UNE PROTEINE RECOMBINANTE 1- Chez E. Coli: exemple d'un vecteur d'expression procaryote (les différents éléments du vecteur, promoteur inductible Ptac) + cf production de Taq ADN polymérase recombinante en TP. 2- En cellules de mammifères: 21- Exemple d'un vecteur d'expression eucaryote 22- Comment transférer l'adn dans une cellule de mammifère? transfection méthode au phosphate de calcium méthode au DEAE -dextrane liposome électroporation transduction par un virus transfert direct d'adn Exemple d un vecteur d expression procaryote

12 Ribosome Binding Site= Site de fixation des ribosomes= Séquence SD (Shine-Dalgarno) Codon initiateur de la traduction Code un épitope permettant la détection (Wwestern-Blot) et la purification grâce à un anticorps anti-flag Mutiple Cloning Site= SMC, Sites multiples de clonage = polylinker: on y clone par les techniques d ADN recombinant la séquence codant pour la protéine d intérêt Codon stop permettant l arrêt de la traduction Promoteur inductible permettant la transcription de l ARN codant la protéine d intérêt. Terminateur permettant l arrêt de la transcription initiée à Ptac Gène codant pour le répresseur LacI de l opéron lactose. Il permet la régulation du promoteur Ptac. Gène de résistance à l ampicilline Origine de réplication issue du plasmide pbr 322: permet la réplication multicopie dans E. Coli Origine de réplication de bactériophage filamenteux: permet la réplication du plasmide sous forme d ADN simple brin (dans certaines conditions et pour certaines applications)

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15 Exemple d un vecteur d expression eucaryote Immediate early (IE) cytomegalovirus (CMV) promoter (P) = Promoteur des gènes précoces du virus eucaryote CMV. Intron issu du virus eucaryote SV40 (Simian Virus) comprenant un site donneur d épissage (SD) et un site accepteur d épissage (SA) Code un épitope reconnu par un anticorps anti-ha Polylinker: on y clone par les techniques d ADN recombinants la séquence codant la protéine d intérêt. Signal de polyadénylation issu du virus eucaryote SV40 Origine de réplication issue du plasmide puc Gène de résistance à l ampicilline Ces deux éléments servent lors de la construction du plasmide recombiné chez E. Coli

16 ANIMAUX TRANSGENIQUES 1- Intérêt/Application des animaux transgéniques. 2- Transfert de gènes dans les embryons au stade une cellule par microinjection 3- Le transfert de noyau. 4- Le transfert de gènes par l'intermédiaire de cellules embryonnaires

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20 PLANTES TRANSGENIQUES 1- Intérêts/applications des plantes transgéniques. 2- Comment peut-on faire une plante transgénique? 2.1- Transformation de cellules végétales par Agrobacterium Transformation de protoplastes 2.3- Transformation directe de cellules, de tissus, ou d'organes par canon à particules. Transformation d une cellule vegetale par agrobacterium Tumeur= galle du collet

21 Obtention d une plante transgénique via agrobacterium On remplace la partie «ADN T» par le transgène transgène Transformation dans agrobacterium Bactérie Agrobacterium tumefaciens transgène

22 2.2- Transformation de protoplastes 2.3- Transformation directe de cellules, de tissus, ou d'organes par canon à particules.

23 THÉRAPIE GÉNIQUE. 1- Aperçu 1.1-Thérapie génique ex-vivo et in vivo 1.2-Les vecteurs de la thérapie génique 1.3-Les maladies potentiellement traitables par thérapie génique 2- La thérapie génique du déficit immunitaire combiné sévère. DISC-X

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27 Essai clinique en 1999, équipe du Dr Marina Cavazzana-Calvo et du Pr Alain Fisher Patient DISC-X Isolement de cellules CD34+ d origine médullaire Préactivation de ces cellules par des cytokines pendant 24 heures Infection des cellules CD34+ en les incubant (une fois par jour, trois jours de suite) avec le vecteur contenant l ADNc de gc sous contrôle du LTR % de cellules transduites: réinjection au patient Les cellules retournent dans la moëlle osseuse. Les cellules modifiées peuvent potentiellement se différencier en lymphocyte T et cellules NK

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