Titre de l atelier : Vecteurs cationiques fluorescents et nouveaux développements pour l électroporation -Transfert d acides nucléiques-

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1 Titre de l atelier : Vecteurs cationiques fluorescents et nouveaux développements pour l électroporation -Transfert d acides nucléiques- Pascal LOYER Inserm UMR991 - Rennes Plateforme Biogenouest SynNanoVect

2 Production de vecteurs de synthèse et vectorisation de biomolécules Une plateforme technologique de Biogenouest avec le label national IBISA et certifiée ISO9001:2008 Responsable plateforme : T. Montier Comité de pilotage : T. Montier, T. Benvegnu, PA Jaffrès, P Loyer 4 Laboratoires U1078 INSERM Site Brest-Biologie (T. Montier) U991 INSERM Site Rennes-Biologie (P. Loyer) UMR6521 CNRS Site Brest-Chimie (PA. Jaffrès) UMR6226 CNRS Site Rennes-Chimie (T. Benvegnu)

3 Vectorisation : technologies/vecteurs permettant d'améliorer l'efficacité d'un principe actif en augmentant sa biodisponibilité. Principes actifs : molécules bioactives incluant médicaments, acides nucléiques (ADN, sirna), protéines, etc... Vecteur : molécule ou structure macromoléculaire capable de véhiculer le principe actif en modifiant sa distribution tissulaire, sa biodisponibilité et/ou ses interactions avec des cellules cibles. Biodisponibilité (propriété pharmacocinétique) des principes actifs : fraction d un principe actif qui : 1) atteint la circulation sanguine et qui est potentiellement active sur l organe cible (in vivo), 2) pénètre dans les cellules en culture. Ciblage : l adressage «spécifique» d un principe actif vers un organe choisi par une vectorisation présentant un tropisme pour cet organe.

4 Offre de prestations et de services : Production de vecteurs de synthèse (lipides cationiques et neutres) Formulation et caractérisation physico-chimique de nanoparticules Vectorisation/Transfection d acides nucléiques et de peptides (lipofection, électroporation) et imagerie in vitro et in vivo Recherche & Développement : Nouveaux vecteurs de synthèse (lipides et polymères) pour la vectorisation d acides nucléiques, peptides et de xénobiotiques Vectorisations optimisées in vitro et in vivo (cellules normales et transformées) et ciblage cellulaire/tissulaire

5 Vecteurs cationiques fluorescents : Synthèse et caractérisation de nouveaux lipides fluorescents pour l étude de la biodistribution de liposomes in vivo chez la souris Recherche & Développement en électroporation : Développement de nouveaux protocoles d électroporation dans des cellules issues d organismes non mammifères Transfert de gènes

6 Lipides cationiques fluorescents : Lipide Molécules Concentration finale dans 1mL d eau Lipide cationique Co-lipide1 LF1 KLN47 C 41 H 84 AsINO 3 P Lipide fluorescent sonde Cyanine C 70 H 114 IN 4 O 4 P C1=1,5mmol/L C2 = 10mg/mL C3 = 20mg/mL 5%molaire de KLN47 : C 1= 0,075 mmol/l C 2= 0,7 mg/ml C 3= 1,4 mg/ml Co-lipide 2 LF2 Co-lipide 3 LF3 Lipide fluorescent sonde NBD C 44 H 78 N 5 O 6 P Lipide fluorescent sonde Naptalimide C 54 H 88 N 3 O 6 P 5% molaire de KLN47 - C1 : C 1a=0,075 mmol/l 10%molaire de KLN47 - C1 : C 1b= 0,15 mmol/l 5% molaire de KLN47 C1 : C 1a=0,075 mmol/l 10%molaire de KLN47 C1: C 1b= 0,15 mmol/l 1 P-A Jaffrès, UMR CNRS 6521, UBO

7 Les prestations : Vectorisation et imagerie in vivo (Inserm U1078, Brest) associées à l évaluation de paramètres cellulaires et biochimiques (robot d analyse du sang et plasma : énumération cellulaire, enzymes hépatiques, ionogrammes)

8 Lipides cationiques fluorescents : Évaluation de la biodistribution in vivo Question 1 : La fluorescence du LF1C est-elle visible dans l appareil Night Owl avec les filtres installés? Dépôt de 10µL de LF1C MeanGrey SumGrey [Ph/pix s] [Ph/s] 4,12,E+06 2,07,E+10 Question 2 : La fluorescence du LF1C est - elle visible une fois injectée dans l animal par l appareil Night Owl avec les filtres installés? Volume injecté : 200µl en IV Témoin 10 min post injection 1h post injection 24h post injection La fluorescence de LF1C est visible sur l appareil NightOwl avec les filtres installés (Ex 630+/-20, Em 655+/-10) 8

9 Ventre Dos Coté 2 Coté 1 Lipides cationiques fluorescents : Évaluation de la biodistribution in vivo.1. Liposomes 1h post injection 3h post injection 5h post injection 24h post injection Volume injecté : 200 µl en IV 9

10 Ventre Dos Coté 2 Coté 1 Lipides cationiques fluorescents : Évaluation de la biodistribution in vivo. 2. Liposomes + DSPE-PEG h post injection 3h post injection 5h post injection 24h post injection Volume injecté : 200 µl en IV 10

11 Fluorescence (ph/pix/sec) Lipides cationiques fluorescents : Évaluation de la biodistribution in vivo Comparaison des moyennes de fluorescence des cotés 1 en fonction du temps 1,E+07 9,E+06 8,E+06 7,E+06 6,E+06 5,E+06 4,E+06 3,E+06 2,E+06 1,E+06 0,E+00 1h 3h 5h 24h Liposomes , , , Liposomes + PEG , , , ,25 Lipoplexes , ,75 Lipoplexes + PEG , , ,75 Temps post injection Les produits avec PEG restent plus longtemps dans la circulation que les mêmes produits sans addition de PEG. Les liposomes restent plus longtemps dans la circulation que les lipoplexes. 11

12 Lipides cationiques fluorescents : Évaluation de la biodistribution in vivo Légende Fluorescence des organes isolés à 24 heures Liposomes seuls Liposomes + PEG Lipoplexes seuls Lipoplexes + PEG Estomac Intestins Cœur Poumons Rein droit Rate Rein gauche Foie 12

13 Ph / pix / secondes Lipides cationiques fluorescents : Évaluation de la biodistribution in vivo Fluorescence des organes isolés à 24 heures 1,E+08 Moyenne de la quantité de fluorescence dans les différents organes 1,E+07 1,E+06 Intestins Cœur Poumons Foie Rate Rein gauche Rein droit Liposomes Liposomes + PEG Lipoplexes Lipoplexes + PEG h après l'injection, les principaux organes fluorescents sont les poumons et le foie, et dans une moindre mesure la rate, les reins, les intestins et le cœur. 13

14 Vecteurs cationiques fluorescents : Synthèse et caractérisation de nouveaux lipides fluorescents pour l étude de la biodistribution de liposomes in vivo chez la souris. Perspective : mesure de la biodistribution des lipoplexes fluorescents (liposome + ADN) et de l expression d un gène rapporteur (luciférase : bioluminescence) dans une même série d animaux. Recherche & Développement en électroporation : Développement de nouveaux protocoles d électroporation dans des cellules issues d organismes non mammifères

15 L électroporation (Inserm UMR991, Rennes) Méthode d'introduction de molécules bioactives (acides nucléiques, protéines, autres..) dans des cellules par l application d un champ électrique de haut voltage pendant quelques millisecondes sur les cellules en suspension. Les membranes cellulaires sont transitoirement «déstabilisées» et les molécules à vectoriser, présentes dans l'espace extracellulaire, pénètrent par diffusion et sous l effet du champ électrique dans les cellules (ex: ADN chargé négativement) :. Voltage : volts. Temps : 5 à 40 millisecondes. 1 à n pulses. Suspension cellulaire en tampons ~isotoniques

16 L électroporation : Inserm UMR991 : deux technologies d électroporation. Système «microporator MP100» (Digital Bio, LabTech France, 2007) Disponible sous le nom de système Neon (Invitrogen/Life Sciences)

17 L électroporation : Système «4D-Nucleofector» (Amaxa/Lonza, ) X unit: 2 options Cuvette strip (20 l, 10 5 cells or «regular» cuvette (100 l, 10 6 cells) Y unit: For adherent cells Adherent cells in 24-well plates electroporation by «dipping electrodes» Core unit X unit Y unit Analyses In situ Analyses ARN-Protéines Analyses ARN-Protéines 96-well Shuttle Criblages banques siarns («in situ reading out») V + - V. Laurent, Glaise D, Nübel T, Gilot D, Corlu A, Loyer P. Methods In Mol Biol, 2013.

18 Recherche & Développement UMR991 : Optimisation de la transfection de cellules humaines primaires ou lignées peu proliférantes (lymphocytes, macrophages, hépatocytes humaines primaires, cellules HepaRG..) Transfection de cellules de granulosa ovarienne de truite Transfection de gamétophytes de l algue brune ectocarpus

19 L électroporation de cellules «peu» proliférantes La seule méthode non virale de transfert d un vecteur d expression permettant une expression significative d une protéine dans des cellules peu ou pas proliférantes Cellules HepaRG progénitrices (proliférantes) ou différenciées (quiescentes) : lipofection KLN47 HepaRG progénitrices: Cellules proliférantes Contraste de phase Détection de la GFP HepaRG différenciées «Hepatocyte-like Cells» : Cellules quiescentes

20 GFP positive cells (%) Viability (%) GFP positive cells (%) Viability (%) Transfection de cellules HepaRG progénitrices ou différenciées par électroporation (Microporator MP100/Neon, 0,5 µg pegfp pour 10 5 cellules) NT NT V. Laurent, A. Fraix, T. Montier, S. Cammas-Marion, C. Ribault, T. Benvengu, PA. Jaffres, P. Loyer. Biotechnol J, 2010, 5, J. Dumont, R. Jossé, C. Lambert, S. Anthérieu, V. Laurent, P. Loyer, MA Robin, A. Guillouzo. Toxicol Appl Pharmacol., 2010, 249,

21 Vecteurs cationiques fluorescents : Synthèse et caractérisation de nouveaux lipides fluorescents pour l étude de la biodistribution de liposomes in vivo chez la souris Recherche & Développement en électroporation : Développement de nouveaux protocoles d électroporation dans des cellules issues d organismes non mammifères

22 Electroporation (Microporator MP100/Neon) : Transfection de cellules de granulosa isolées à partir de follicules ovariens de truite Electroporation des cellules 24h après isolement par un plasmide codant la GFP et visualisation par microscopie à fluorescence. Des cellules GFP+ : ~50% Photographies fournies par E. Marivin et A. Fostier, INRA.

23 % cellules positives Electroporation (Microporator MP100/Neon) : Transfection de cellules de granulosa isolées à partir de follicules ovariens de truite MO CTRL 0 µm 1 µm 5 µm 10 µm 50 µm 100 µm Electroporation des cellules 24h après isolement par un morpholino fluorescent (fluorescéine) et détection par cytométrie en flux des cellules positives. E. Marivin et A. Fostier, INRA.

24 Transfection de gamétophytes de l algue brune ectocarpus D. Scornet & M. Cock, CNRS, Station de biologie, Roscoff

25 Nombre de filaments/boîte Transfection de gamétophytes de l algue brune ectocarpus Mise au point de tampons isotoniques permettant la survie des gamétophytes Identification de paramètres d électroporation permettant la survie des gamétophytes et le développement de filaments Microporator/Neon Nucleofector/Amaxa D. Scornet & M. Cock, CNRS, Station de biologie, Roscoff

26 Vecteurs cationiques fluorescents : Synthèse et caractérisation de nouveaux lipides fluorescents pour l étude de la biodistribution de liposomes in vivo chez la souris Recherche & Développement en électroporation : Développement de nouveaux protocoles d électroporation dans des cellules issues d organismes non mammifères: Les techniques d électroporation sont applicables à des modèles de cellules eucaryotes issues d organismes non mammifères après des mises au point sur les paramètres de survie et le type d acides nucléiques vectorisables

27 Comité de direction de gauche à droite : Thierry Benvegnu, Pascal Loyer, Tristan Montier (Directeur de la plateforme), Paul-Alain Jaffrès Inserm U1078 (T.Montier, MCU, Directeur). Tony Le Gall (IR). Yann Sibrill (AI). Caroline Denis (TR). Véronique Laurent (IE) UMR CNRS6226, ENSCR (T.Benvegnu, PU). Jean-Paul Guegan (AI). Sandrine Cammas-Marion (CR). Loïc Lemiègre (MCU). Jelena Jeftic (PU). Thomas Vives (AI) UMR CNRS6521 (PA.Jaffres, PU). Hélène Couthon-Gourvès (MCU) Inserm UMR991 (P.Loyer, CR). Catherine Ribault (TRE). Véronique Laurent (CM)