BIOCHIMIE METABOLIQUE CHAP I ENZYMOLOGIE

Transcription

1 BICHIMIE METABLIQUE CHAP I EZYMLGIE Cinétique enzymatique...3. Définitions et généralités Rappels de cinétique chimique otion d énergie libre et d énergie d activation Energie libre Energie d activation et rôle des catalyseurs Cinétique des réactions enzymatiques Activité enzymatique otion de vitesse initiale Influence de la concentration en enzyme sur la vitesse de la réaction Influence de la concentration en substrat sur la vitesse de la réaction Résultats graphiques : Représentation en coordonnées directes représentation d Eadie Hofstee Représentation de Lineweaver et Burk Représentation de Dixon Influence des agents chimiques et physiques sur la réaction enzymatique Influence de la température Influence du ph Influence des effecteurs Les activateurs Les inhibiteurs Inhibiteurs compétitifs Inhibiteurs non compétitifs Inhibiteurs incompétitifs enzymes allostériques Mode d action des enzymes otion de site actif Spécificité de la réaction enzymatique Classification des enzymes classification internationale des enzymes Les coenzymes Les coenzymes d'oxydoréduction : Les nicotinamides dinucléotides : AD et ADP Les flavines nucléotides : FM et FAD Les coenzymes hématiniques ou porphyriques L acide lipoïque L ubiquinone ou coenzyme Q Les coenzymes transporteurs de groupement la biotine phosphate de pyridoxal Thiamine pyrophosphate TPP Coenzyme A S.Adenosyl Méthionine Cobalamine l'atp (adénosine triphosphate) ainsi que UDP CTP...27

2 2

3 Cinétique enzymatique. Définitions et généralités Les enzymes sont des catalyseurs biologiques de nature protéique (sauf quelques AR doués eux aussi d activité enzymatique et qui sont nommés ribozymes), qui permettent aux réactions chimiques, nécessaires à la vie de s effectuer de façon rapide et avec une grande spécificité. Définition : un catalyseur est une substance qui augmente la vitesse d une réaction chimique sans en modifier le rendement et qui n est pas consommée au cours de la réaction. Pour savoir si une catalyse est de nature enzymatique il suffit de chauffer fortement la préparation : les enzymes étant de nature protéique elles seront dénaturées par la chaleur et l action catalytique sera perdue après refroidissement. Les enzymes sont des protéines simples ou conjuguées (hétéroprotéines), comportant une ou plusieurs sous unités, mais toujours de forme globulaire (sphéroprotéines). Il existe également des systèmes ou complexes multienzymatiques qui sont des associations à l échelle moléculaire capables d effectuer une suite de réactions biochimiques. Un certain nombre d enzymes a besoin pour exercer son action catalytique d un cofacteur, qui peut être un ion métallique (souvent Zn ++ ou Mg ++, on parle alors de métalloenzymes), un groupement prosthétique fortement lié à la protéine (par ex groupement porphyrine semblable à l hème de l hémoglobine), ou un coenzyme qui participe à la réaction enzymatique. n appelle substrat de l enzyme la molécule organique qui sera transformée en produit au cours d une réaction enzymatique, souvent le coenzyme est en fait un co-substrat. Des isoenzymes sont des enzymes dont la structure protéique est différente mais qui exercent la même activité catalytique..2 Rappels de cinétique chimique Toute réaction chimique, non totale, atteint un équilibre au bout d un temps plus ou moins long. Une réaction réversible va s écrire : A + B k 2 k C + D La vitesse de la réaction qui produit C et D s écrit : v = k [A]. [B], et la réaction inverse qui produit A et B s écrit : v 2 = k 2 [C]. [D]. k et k 2 sont les constantes de vitesse des réactions. L équilibre est atteint lorsque les vitesses v et v 2 sont égales. v = v 2 = k [A] e.[b] e = k 2 [C] e.[d] e. [C] e.[d] e k d où : = = Ke constante d équilibre. [A] e.[b] e k 2 Soit une réaction : A + B + C+. M + + P + La vitesse de cette réaction peut être mesurée en suivant la disparition de n importe lequel des réactifs en fonction du temps ou en suivant l apparition de n importe lequel des produits en fonction du temps. 3

4 Si la vitesse de la réaction ci-dessus est suivie par la disparition de A, on peut l exprimer par la relation : d[a] = k [A] n. [B] n2.[c] n3... dt otion d ordre de réaction : Soit n l ordre de cette réaction n est l ordre global de la réaction, n est égal à n + n 2 + n 3 + n est l ordre partiel de la réaction par rapport à A n 2 est l ordre partiel de la réaction par rapport à B etc. Si n = 0 l ordre de la réaction est égal à 0, la vitesse ne dépend pas d une concentration d[a] = = k si [A 0 ] est la concentration initiale de A on a alors : [A] = [A 0 ].kt dt Ce qui peut se représenter graphiquement par : k v ou v ou k v 0 v 0 temps temps Si n = l ordre de la réaction est égal à, la vitesse ne dépend que de la concentration de A d[a] d[a] = = k [A] et = kdt, si [A 0 ] est la concentration initiale de A on a alors : [A] = dt [A] [A 0 ].e -kt [A] = e -kt [A] [A0] [A0] kt soit ln = -kt soit ln = kt soit log = [A0] [A0] [A] [A] 2,03 Ce qui peut se représenter graphiquement par : k log [A 0] [A] v k 2,03 temps k Si n = 2 l ordre de la réaction est égal à 2, la vitesse dépend que de la concentration de A et de celle de B 4

5 d[a] = = k [A]. [B] dt si [A 0 ] est la concentration initiale de A et [B 0 ] la concentration initiale de B et si [A 0 ] = [B 0 ] on a la relation =. kt [A] [A 0] Ce qui peut se représenter graphiquement par : [A] [A0] k.3 otion d énergie libre et d énergie d activation.3. Energie libre La capacité à réagir d une molécule est caractérisée par un paramètre qui s exprime en kcal/mol et qui est l énergie libre : Soit la réaction : A + B k C + D [C][D] n a G = G0 + RTln avec les concentrations [A], [B], [C], [D] maintenues [A][B] constantes. G : variation d énergie libre G 0 : variation d énergie libre standard = variation d énergie libre dans les conditions dites standard : température de 298 K, pression de atm, ph = 0 et [A], [B], [C], [D] maintenues constantes à mol/l. G dépend donc de G 0, des conditions opératoires et de la concentration des réactifs et des produits. Si G < 0 la réaction est dite exergonique et s accompagne donc d une diminution d énergie libre, la réaction est spontanée, elle est susceptible de fournir de l énergie sous forme de chaleur, d énergie mécanique, ou lumineuse, dans l organisme cette énergie peut être également stockée sous forme d énergie chimique. Si G> 0 la réaction est dite endergonique il faut fournir de l énergie pour qu elle puisse se réaliser. Si la réaction est à l équilibre, ni elle ne fournit d énergie libre, ni elle n en consomme donc G = [C] e[d] e [C] e.[d] e 0 donc 0 = G 0 + RTln soit : G 0 = RTln Donc G 0 = -RTln K [A] e[b] e [A] e.[b] e k 2 5

6 .3.2 Energie d activation et rôle des catalyseurs Seule une réaction exergonique peut avoir lieu spontanément, c est à dire qu elle peut se réaliser sans apport d énergie, mais cette réaction peut être extrêmement lente, elle ne sera pas perceptible. Le rôle des catalyseurs chimiques ou enzymatiques est d accélère la vitesse des réactions thermodynamiquement possible.! Un catalyseur ne peut pas rendre possible une réaction dont le G est< à 0. Action d un catalyseur : Soit la réaction A + B C + D, le chemin réactionnel pour transformer A et B en C et D nécessite le passage par un état privilégié de réactivité que l on appelle complexe activé AB*. La formation de ce complexe activé nécessite l apport d énergie libre extérieure appelée énergie libre d activation G. Une réaction peut avoir un G < à 0, si on ne lui fournit pas d énergie d activation elle n aura jamais lieu. Pour que la vitesse d une réaction soit rapide il faut que la concentration en complexe activé [AB*] soit grande, il y a pour cela deux possibilités : -élévation de la température, ce qui augmente l agitation moléculaire donc le nombre de chocs entre A et B favorisant [AB*] -ajout d un catalyseur dont le rôle est de baisser l énergie d activation libre G nécessaire à la réaction. Plus l énergie libre d activation à fournir aux réactifs est faible plus le catalyseur est efficace. L énergie libre réactionnelle G reste inchangée en présence du catalyseur Exemple : l'énergie d'activation nécessaire à la décomposition de H 2 2 en H 2 est de 75 kj.mol - en l'absence de catalyseur, de 49 kj.mol - en présence de platine colloïdal et d'environ 8,4 kj.mol - en présence de catalase..4 Cinétique des réactions enzymatiques.4. Activité enzymatique La vitesse d une réaction enzymatique est suivie en général par la mesure de la quantité de substrat transformé par unité de temps ou de produit formé par unité de temps. Pratiquement on fait un prélèvement dans le milieu réactionnel à différents temps puis on effectue un dosage approprié. L activité enzymatique peut être exprimée de différentes façons suivant le degré de pureté de l échantillon : Pour des préparations brutes (sérum, milieu de culture, broyat tissulaire.) L unité d activité enzymatique est l unité d enzyme (UI) définie en 96 ou le Katal défini en 972. L UI est la quantité d enzyme qui catalyse la transformation d une micromole de substrat par minute dans des conditions définies ( de préférences optimales de température, de ph, de concentration en substrat.) 6

7 Le katal est la quantité d enzyme qui catalyse la transformation d une mole de substrat par seconde dans des conditions définies. Le katal étant une très grosse unité on utilise souvent le µkat ou le nkat. Si l échantillon est liquide (sérum) on peut parler de concentration d activité enzymatique en UI/L ou Kat/L. Si le taux de protéines de la préparation est connu on définit l activité spécifique de la préparation qui s exprime en UI par g (ou mg) de protéines ou en Kat par g (ou mg) de protéines. Cette activité spécifique augmente au fur et à mesure de la purification de l enzyme. Pour une enzyme pure l unité d activité devient l activité spécifique moléculaire (ou turnover number) qui est le nombre de micromole de substrat transformé par minute et par micromole d enzyme, soit le nombre d unités par µmole d enzymes..4.2 otion de vitesse initiale Lorsqu on suit la quantité de substrat transformé en fonction du temps la courbe est de ce type : Au départ la courbe se présente comme une droite, puis la courbe s infléchit pour devenir un plateau lorsque tout le substrat est consommé A chaque instant t la vitesse instantanée est la tangente à la courbe. La vitesse évolue donc au cours de la réaction : Pendant la période stationnaire initiale la vitesse est constante (courbe = droite, vitesse = pente) et maximale, c est la vitesse initiale. Ensuite on peut calculer la vitesse dc instantanée au temps t : vt = dt c est la dérivée par rapport au temps de [P] formé période stationnaire initiale la fonction C = f(t). elle diminue au cours du temps Lorsque le plateau est atteint, la vitesse devient nulle. i t t période post-stationnaire Temps Pour comparer les cinétiques de différentes réactions enzymatiques on doit se placer dans la même zone de vitesse, par convention il s agit de la vitesse initiale..4.3 Influence de la concentration en enzyme sur la vitesse de la réaction Méthode : pour une même réaction enzymatique on étudie la vitesse de transformation du substrat (mis en excès) pour différentes concentrations d enzyme. Résultats graphiques : 7

8 Résultats bruts i = f([e]) [P] [E 4 ] initial [E 3 ] [E 2 ] [E ] Temps Avec [E 4 ] > [E 3 ]> [E 2 ]> [E ] [E] La vitesse est strictement proportionnelle à la concentration en enzyme : i =k[e]. Si le graphe i = f([e]) ne donne pas une droite, on peut être en présence d un inhibiteur ou d un mélange d enzymes..4.4 Influence de la concentration en substrat sur la vitesse de la réaction Méthode : on maintient constante la concentration en enzyme dans le milieu réactionnel et on mesure la vitesse de la réaction en faisant varier la concentration initiale en substrat Résultats graphiques : Exemple de l étude de la cinétique de la βgalactosidase par le dosage du glucose libéré à partir du lactose 80 [Glc] µmol/l Activité de la β-galactosidase [Lac] = 0,5 mmol/l [Lac] = 0,7 mmol/l [Lac] = mmol/l [Lac] = 2 mmol/l [Lac] = 5 mmol/l 0 0,5,5 2 2,5 3 Temps(min) 8

9 Expression de la vitesse initiale de la réaction en fonction de i ordre 0 ordre La vitesse est, pour des concentrations faibles en substrat, linéairement proportionnelle à. : i = k la cinétique est d ordre. puis lorsque augmente la vitesse devient maximale et indépendante de, l ajout de substrat est sans influence sur la vitesse. Pour expliquer cela ictor Henri émet la théorie du complexe enzyme-substrat : Le substrat se combine réversiblement à l enzyme pour former un complexe enzyme-substrat, la vitesse de la réaction de transformation du substrat en produit est proportionnelle à la concentration de ce complexe. k k 3 E + S ES P + E k 2 Soit : concentration initiale en substrat [P] concentration en produit [E t ] concentration totale en enzyme [E l ] concentration en enzyme libre (non liée au substrat) [ES] concentration en complexe enzyme-substrat Tant que la concentration en substrat est faible toutes les molécules d enzymes ne sont pas combinées au substrat ([ES] < [E t ]) la concentration en complexe enzyme-substrat n est donc pas maximale et la vitesse non plus, [ES] est proportionnelle à et i aussi (ordre par rapport à S). Lorsque la concentration en substrat augmente toutes les molécules d enzymes sont combinées sous forme de complexe enzyme-substrat ([ES] = [E t ]) et l activité catalytique est maximale donc i = max. L analyse mathématique de l influence de la concentration en substrat tenant compte de cette théorie fut faite en 93 par Michaelis et Menten. Ils se basèrent sur le fait que la vitesse de la réaction est en fait fonction de la concentration en complexe enzyme-substrat 9

10 () k, (3) k 3 E + S ES P + E (2) k 2 Soit, 2, 3 = vitesses respectives des réactions,2 et 3. Soit k, k 2, k 3 constantes de vitesses respectives des réactions,2 et 3. La vitesse de disparition du substrat est égale à d = 2 et la vitesse d apparition du dt d[p] produit est égale à = 3, or en tout instant ces deux vitesses sont égales donc 2 = dt 3 est la vitesse de formation du complexe enzyme-substrat Donc = K. [E l ] = K.([E t ] [ES]). 2 est la vitesse de séparation du complexe enzyme-substrat donc 2 = K 2 [ES] 3 est la vitesse de transformation du complexe enzyme-substrat en enzyme + produit donc 3 = K 3 [ES] Puisque 2 = 3 on a : soit K 3 [ES] = K. ([E t ] [ES]). - K 2 [ES] K.([E t ] [ES]). = (K 3 + K 2 )[ES] K2 + K3 ([Et] [ES])[S0] [E t] [ES] [E t] soit = = = [ S] =K m K [ES] [ ES] [ES] [ ES] K m est la constante de Michælis du système enzymatique K m peut-être dans beaucoup de cas assimilée à la constante de dissociation du complexe ES en en E + S. Quand la vitesse de formation du complexe est plus grande que celle de sa décomposition on a : K > K 2 >>K 3 Lorsque la réaction de formation du complexe a atteint l équilibre, on a : = 2 donc K.([E t ] [ES]). = K 2 [ES] D où : K = K 2 ([Et] [ES]) [ES] = K m Km est la constante d équilibre de la réaction E+ S ES Km est une constante qui définit qui définit l affinité de E pour S. [E t] [Et] Dans tous les cas Km = d où K m + =, donc à tout moment la [ES] [ES] [E t] concentration du complexe enzyme-substrat est : [ES] = Km + La vitesse de la réaction () est comme vu plus haut, égale à la vitesse d apparition du produit [E t] 3 : = 3 = K 3 [ES] = K 3 Soit : [E t] Km + = K 3 alable pour Km + un excès de substrat 0

11 Cette vitesse globale est maximum lorsque toute l enzyme est combinée au substrat, c est à dire [ES] = [E t ] Ceci est réalisé lorsque la concentration en substrat est très importante devant la concentration en enzyme (>>>[E t ]), la concentration [ES] est maximale, elle ne varie plus et la réaction est d ordre 0. max = K 3 [ES] = K 3 [E t ] Si dans la formule de on remplace K 3 [E t ] par max, on obtient :.B : Si >>K m on a = Si <<K m on a = max max K m max = Km + Equation de Michælis et Mentens = max donc est linéairement proportionnel à max >>K m <<K m Transformons de l équation : = K m + (k m + ). = max max k m +. = max k m = max -. max. -. max. K m = =.(max - ) max u K m = = La constante de Michælis est caractéristique de l enzyme, c est une valeur très importante.

12 Elle a les dimensions d une concentration, c est en fait la concentration du substrat qui permet d obtenir une vitesse de réaction égale à. Si on remplace en effet par max 2 Km = on obtient max max/2.=.(2-) = Km mesure l affinité l enzyme pour le substrat, si K m est élevé l affinité est faible et inversement. max et K m se déterminent graphiquement de plusieurs manières : Représentation en coordonnées directes i Courbe de Michaelis max max 2 i = max K M + K M Cette représentation est à éviter car on ne peut pas être sûr d avoir atteint max ce qui va induire une erreur dans la détermination de K m surtout si K m est élevé représentation d Eadie Hofstee L équation des vitesses est transformée ainsi : max : =.K m +. = max., en divisant les deux cotés par K max. on Km + max r obtient : = ou en multipliant par K m : = max (.Km) Km Km soit en représentation graphique : Représentation d Eadie : = f( ) 2

13 m ou -K m -/K m m Représentation de Lineweaver et Burk L équation est mise sous la forme : Km + K = = m m m x + x m = K m m x + m Soit K = m m x + m k m et max étant des constantes cette équation est du type y =ax+b Donc si on représente en.fonction.de. on obtient : r [S0] Une droite de pente, d ordonnée à l origine et donc le point de m rencontre avec l axe des abscisses est Km 2 max i Lineweaver-Burk K M max - max K M K M Représentation de Dixon n multiplie l équation précédente par et on représente en fonction de 3

14 pente = max K m max - K m.5 Influence des agents chimiques et physiques sur la réaction enzymatique.5. Influence de la température Si on étudie la vitesse initiale d une réaction enzymatique en fonction de la température on obtient une courbe qui est la résultante de deux phénomènes : Augmentation de la vitesse avec la température Dénaturation de la protéine i Dénaturation thermique Activation (Arrhénius) Entre 0 C et 40 C la vitesse de la réaction augmente avec la température car le complexe enzyme-substrat se forme plus vite si on fournit plus d énergie au système. Puis au-delà d une certaine température qui varie selon les enzymes on assiste à la θ critique dénaturation de la protéine. n définit la température optimale d action d une enzyme qui est la température pour laquelle la vitesse initiale est la plus élevée. θ C.5.2 Influence du ph L étude de la courbe i =f(ph) montre qu il existe pour chaque enzyme une zone pour laquelle l activité catalytique est maximum : c est le ph optimum de l enzyme. De part et d autre de ce ph optimum l activité décroît très rapidement et en général à ± 2 unités du ph optimum, l activité devient négligeable. 4

15 Les variations de ph vont avoir un effet sur : La stabilité de l enzyme : la conformation tridimensionnelle native de l enzyme peut être modifiée si le ph change car l ionisation des groupements fonctionnels va changer La formation du complexe enzyme substrat : si les acides aminés du centre actif subissent des modifications de charge la liaison enzyme-substrat ne se fera plus convenablement. Le substrat lui-même. i pepsine ph optimum de la pepsine ph optimum amylase trypsine Le ph optimum varie beaucoup suivant les enzymes, il peut être très acide (pepsine, enzyme stomacale ph opt,5 à 2) très basique (arginase ph opt 9,5 à 0), il est souvent proche de la neutralité..5.3 Influence des effecteurs Les effecteurs sont des substances chimiques qui modifient l activité des enzymes. n distingue : les activateurs qui augmentent l activité catalytique les inhibiteurs qui diminuent l activité catalytique. ph.5.3. Les activateurs Certains cations augmentent l activité des enzymes comme Mg 2+ pour les kinases, Zn 2+ pour les phosphatases alcalines (PAL), Mg 2+ et a + pour la β-galactosidase i max Activateur Les inhibiteurs Il faut distinguer les inhibiteurs irréversibles qui dénaturent l enzyme de manière non spécifique (solvants organiques, urée, acides, bases..) et les inhibiteurs réversibles qui sont spécifiques et qui laissent intacte la structure chimique de l enzyme, ils diminuent la vitesse de la réaction enzymatique. Il existe des inhibiteurs réversibles dits compétitifs et d autres dits non compétitifs. K M K' M Inhibiteur compétitif Inhibiteur non compétitif Inhibiteurs compétitifs Un inhibiteur compétitif est une substance qui entre en compétition avec le substrat pour se lier à l enzyme, il vient donc occuper la place du substrat sur l enzyme, il existe une analogie structurale entre l inhibiteur et le substrat. L inhibiteur peut avoir une affinité pour l enzyme plus grande que celle du substrat et il empêchera la formation du complexe enzyme-substrat. Le % d inhibition dépend des concentrations respectives en substrat s et en inhibiteur I, on peut lever l inhibition en 5

16 augmentant la concentration de S. Ce type d inhibition concerne l affinité de l enzyme pour le substrat donc K m est modifié mais pas max. n a simultanément E + S ES E + P et E + I EI Il se forme les complexes ES et EI mais jamais ESI. [E].[I] n définit K i = [EI] Représentation graphique (Lineweaver et Burk): r [I] croissant max Km Kmi Ces inhibiteurs sont employés comme antibiotiques, insecticides, herbicides Inhibiteurs non compétitifs L inhibiteur se fixe sur un site autre que le site actif, on aura donc : E + S ES E + I EI ES + I ESI EI + S EIS Inactifs L affinité de l enzyme pour le substrat n est pas diminuée donc Km reste constante alors que max diminue. Représentation graphique (Lineweaver et Burk): 6

17 r [I] croissant max Km Inhibiteurs incompétitifs L inhibiteur se fixe uniquement sur le complexe enzyme-substrat qu il inactive, mais jamais à l enzyme seule. ES + I ESI inactif I est fixé avec S dans le site actif on a à la fois diminution de l affinité et de la vitesse. K m et max varient Représentation graphique (Lineweaver-Burk) : r [I] croissant max Km.6 enzymes allostériques Les enzymes étudiées ci-dessus sont des enzymes à cinétique dite michaelienne. D'autres enzymes de structure plus complexe ont une affinité vis à vis du substrat qui n'est pas une constante ou bien voient leur vitesse maximum changer en fonction de la concentration des effecteurs : ce sont les enzymes à cinétique allostérique. Pour les enzymes allostériques la courbe = f( est une sigmoïde. 7

18 Ces enzymes ont toujours une structure quaternaire composée de plusieurs chaînes d'acides aminés, formant des sous-unités (protomères) identiques ou non entre elles. La protéine est donc un oligomère de 2 ou 4 sous-unités par exemple. Les protomères sont arrangés dans l'espace de façon que chacun d'entre eux ait les mêmes liaisons avec les autres. Un tel arrangement est dit symétrique. Ces enzymes possèdent, outre le site catalytique où se fixe le substrat, un ou plusieurs sites allostériques où peuvent se fixer des effecteurs allostériques (activateurs ou inhibiteurs) n ayant aucune analogie structurale avec le substrat. Chaque ligant (substrat, activateur, inhibiteur) possède un site de fixation sur chaque protomère. Les protomères d une enzyme allostérique peuvent exister sous deux conformations (formes) appelées état R et état T dont l affinité vis à vis du substrat varie. Le passage d une conformation à une autre est appelé transition allostérique. L activité des enzymes allostériques est caractérisée par un effet coopératif et par l action des effecteurs. Effet coopératif : la fixation d une première molécule de substrat sur un protomère facilite la fixation des suivantes sur les autres protomères. (d où existence d une sigmoïde) Action des effecteurs : lorsqu un activateur se fixe au site allostérique il s ensuit une transition allostérique qui entraîne une modification de la conformation du site actif provocant une augmentation de l affinité de l enzyme pour le substrat. Dans le cas d un inhibiteur il se produit le phénomène inverse. T R Effet coopératif Action des effecteurs Ce mécanisme permet une régulation très fine de l activité de ces enzymes. Très souvent l enzyme catalysant la première réaction d une séquence métabolique est une enzyme allostérique et on observe ce type de contrôle, (avec E enzyme allostérique) : X A E B E 2 C E 3 D H Activeur allostérique inhibiteur Activation Exemple : activité de l aspartate transcarbamylase (ATCase) inhibition 8

19 L'ATP est un activateur allostérique, le CTP un inhibiteur allostérique. Les deux se fixent sur les sous-unités régulatrices de l'atcase. Sans ces sous-unités, l'enzyme est désensibilisée. 2 Mode d action des enzymes 2. otion de site actif Les enzymes sont des protéines souvent de très grosse taille alors que le substrat est une petite molécule organique, donc la molécule d enzyme n est pas utilisée en totalité pour la catalyse. Il existe un site privilégié appelé site actif ou site catalytique dans lequel se fixe le substrat par l intermédiaire de liaisons hydrogène avec des acides aminés polaires (histidine, sérine, cystéine ) Les acides aminés du site actifs sont éloignés les uns des autres dans les structure primaire, ce sont les repliements dus à la structure tertiaire qui les rapprochent, il est donc fondamental de maintenir cette conformation sous sa forme native pour garder les propriétés catalytiques. La taille du site actif varie d une enzyme à l autre selon sa complexité et sa spécificité. Les acides aminés de l enzyme peuvent être classés en quatre catégories selon le rôle qu ils jouent dans l édification du site actif : Acides aminés de contact : c est grâce à eux que se créent les liaisons enzyme-substrat Acides aminés auxiliaires : ils ne sont pas en contact avec le substrat mais participent au centre actif en lui conférant une certaine flexibilité. Acides aminés collaborateurs : ils assurent le maintient de la structure tertiaire autour du site actif Acides aminés non collaborateurs : peuvent être enlevés sans diminuer l activité catalytique. Pour les enzymes utilisant un coenzyme le centre catalytique comprend le site actif et le site de fixation du coenzyme. 9

20 Le coenzyme le plus souvent sert de donneur ou de récepteur de groupement ôté ou fixé au substrat. Mécanisme d action d une enzyme : la créatine kinase (= ATP créatine phosphotransférase E.C ) -L enzyme et les différents ligands : l activateur ( Mg 2+ ), le substrat ( la créatine), et le coenzyme ( l ATP ) électrons délocalisés 2 - Formation du complexe E ATP S Création de liaison hydrogène («««) entre S et ATP, ATP et E, E et S. Puis redistribution des électrons ce qui aboutit à la création de nouvelles liaisons et à la rupture des anciennes 3 Un groupement phosphate a été transféré de l ATP à la créatine, il y a donc création de créatine-phosphate et d ADP. Certains atomes d hydrogène ont également été déplacés 2.2 Spécificité de la réaction enzymatique La spécificité est l une des caractéristiques principales des enzymes, elle permet d éviter la formation de sous produits de la réaction. La spécificité d une réaction enzymatique s exerce à plusieurs niveaux : Au niveau de la réaction catalysée : cette spécificité est absolue : une enzyme catalyse toujours un seul type de réaction. Au niveau du substrat : cette spécificité peut être absolue pour certaines enzymes (ex α amylase n hydrolyse que la liaison α -4 unissant deux molécules de D glucopyranose.) ou plus 20

21 large : l enzyme intervient sur une famille de composés ( ex la β galactosidase coupe les liaisons osidiques impliquant le carbone β du galactose quel que soit le groupement suivant) voire très large : l enzyme agit sur une grande variété de composés (Ex les phosphatases qui coupent les liaisons phosphoester quelque soit le composé phosphoré) Au niveau de la stéréoisomérie : beaucoup d enzymes sont capables de distinguer deux isomères l un de l autre et n agir que sur l un d entre eux. Les coenzymes sont non spécifiques, leur type dépend de la nature de la réaction catalysée (Cf. 2.4 les coenzymes). 2.3 Classification des enzymes Un très grand nombre d'enzymes ont été identifiées au cours des dernières années. Se pose alors le problème de leur dénomination et de leur classification. Certaines enzymes sont désignées par un nom ancien consacré par l'usage : pepsine, trypsine, Une nomenclature dans laquelle on ajoute le suffixe ASE est encore utilisée : soit en l'ajoutant au substrat : uréase, phosphatase, soit au type de réaction catalysée : oxydase, hydrolase. Une classification plus rigoureuse a toutefois été proposée pour nommer de façon non ambiguë toutes les enzymes connues et non encore connues : c'est la nomenclature officielle dans laquelle on dénombrait 72 enzymes en 96, 222 en 78. Chaque enzyme se voit attribué un de code, un nom systématique et éventuellement un nom commun recommandé. LES 6 CLASSES D'EZYMES (978) Les oxydoréductases Catalysent des réactions où sont transférés des électrons accompagnés ou non de protons. Ces enzymes fonctionnent avec des coenzymes divers (AD +, FAD, ) qui se comportent comme des accepteurs intermédiaires et transitoires des électrons. La plupart de ces enzymes sont des déshydrogénases, d autres sont des oxydases, des peroxydases, des réductases, Exemples : alcool déshydrogénase éthanol + AD + éthanal + ADH + H + lactate déshydrogénase L-lactate + AD + pyruvate + ADH + H Les transférases Catalysent des transferts de groupement d'une molécule à une autre. Exemples : phosphofructokinase D-fructose 6 P + ATP D-fructose,6 di P + ADP alanine aminotransférase L-alanine + 2-oxo-glutarate pyruvate + L-glutamate Les hydrolases Catalysent l'hydrolyse (coupure par l eau) de diverses liaisons (ester, osidiques, ) Exemple : α amylase : amidon dextrines maltose trypsine hydrolyse les liaisons peptidiques du type Arg Y ou Lys Y avec Y Pro Les lyases Catalysent le déplacement d'un groupement à partir d'un substrat avec apparition d'une double liaison sur ce substrat. 2

22 Exemple : fumarase L-malate fumarate + H 2 Les isomérases Catalysent des inversions de configuration. Exemples : glucose 6 phosphate isomérase D-glucose 6 P D-fructose 6 P glucose épimérase β-d-glucose α-d-glucose Les ligases ou synthétases Catalysent des réactions de synthèse où l'énergie est en général fournie par l'atp: Exemples : butyryl CoA synthétase (thiokinase) butyrate + HS CoA + ATP butyryl CoA + AMP + PP i glutamine synthétase L-glutamate + ATP + H + 4 L-glutamine + ADP + P i.le UMÉR DE CDE C'est un numéro de code à 4 chiffres séparés par des points. Le er chiffre indique la classe à laquelle l'enzyme appartient Le second précise la sous-classe Le troisième la sous-sous-classe Le quatrième chiffre indique le numéro d'ordre de l'enzyme dans la sous-sous-classe. LE M SYSTÉMATIQUE Ce nom précise la nature du donneur, la nature de l'accepteur et le type de réaction catalysée. Exemples : La L-lactate AD oxydoréductase catalyse la réaction : L-lactate + AD + pyruvate + ADH + H + La L-aspartate 2-oxoglutarate aminotransférase catalyse la réaction : L-aspartate + 2-oxoglutarate oxaloacétate + L-glutamate LE M CMMU RECMMADÉ C'est l'appellation consacrée par l'usage Exemples : Glucokinase, Lactate déshydrogénase EXEMPLE La glucokinase porte le numéro EC : c'est une transférase 7 : le groupement transféré contient du phosphore : le groupement accepteur a une réactivité alcool 2 : c'est le numéro de la glucokinase dans la série définie par les trois premiers nombres. om systématique: ATP D-glucose 6 phosphotransférase ; nom commun recommandé : glucokinase classification internationale des enzymes Le document de base est actuellement «Enzyme omenclature 978». En se limitant aux classes et sous-classes, la classification est la suivante :. XYD-REDUCTASES.. Agissant sur les groupes CH H.2. Agissant sur les groupes aldéhydes et cétones.3. Agissant sur les groupes CH CH.4. Agissant sur les groupes CH H 2.5. Agissant sur les groupes CH H.6. Agissant sur le ADH ou ADPH.7. Agissant sur les autres groupes azotés 22

23 .8. Agissant sur les groupes soufrés.9. Agissant sur les groupes hématiques.0. Agissant sur les diphénols et les substances apparentées.. Agissant avec H Agissant sur l'hydrogène comme donneur.3. Comportant l'incorporation d'oxygène moléculaire et un donneur unique.4. Comportant l'incorporation d'oxygène moléculaire et des donneurs multiples.5. Agissant sur les radicaux superoxydes.6. xydant les ions métalliques.7. Agissant sur les groupes CH Autres oxydo-réductases 2. TRASFÉRASES 2.. Transférant un groupe monocarboné 2.2. Transférant un résidu aldéhydique ou cétonique 2.3. Acyl-transférases 2.4. Glycosyl-transférases 2.5. Transférant des groupes alkyl ou aryl, autres que le méthyle 2.6. Transférant des groupes azotés 2.7. Transférant des groupes phosphorés 2.8. Transférant des groupes soufrés 3. HYDRLASES 3.. Agissant sur les liaisons esters 3.2. Agissant sur les composés glycosylés 3.3. Agissant sur les liaisons éther-oxydes 3.4. Agissant sur les liaisons peptidiques 3.5. Agissant sur les liaisons C non peptidiques 3.6. Agissant sur les anhydrides d'acides 3.7. Agissant sur les liaisons C C 3.8. Agissant sur les liaisons halogéniques 3.9. Agissant sur les liaisons P 3.0. Agissant sur les liaisons S 3.. Agissant sur les liaisons C P 4. LYASES 4.. C C Iyases 4.2. C Iyases 4.3. C S Iyases 4.5. C halogène Iyases 4.6. P Iyases 4.99 Autres Iyases 5. ISMÉRASES 5.. Racémases et épimérases 5.2. Cis-trans isomérases 5.3. xydoréductases intramoléculaires 5.4. Transférases intramoléculaires 5.5. Lyases intramoléculaires Autres isomérases 6. LIGASES (U SYTHÈTASES) 6.. Formant des liaisons C 6.2. Formant des liaisons C S 6.3. Formant des liaisons C 6.4. Formant des liaisons C C 6.5. Formant des liaisons ester-phosphate 23

24 2.4 Les coenzymes A l'exception des hydrolases, les enzymes requièrent pour leur fonctionnement la présence absolue d'une molécule annexe : le coenzyme. Si l'on connaît plus de 2000 enzymes, le nombre des coenzymes est plus restreint, environ une vingtaine. Un coenzyme est une petite molécule (parfois un simple ion métallique) lié à la protéine enzymatique. Les coenzymes ne sont pas de nature protéique (ils sont thermostables) La plupart possède un ou plusieurs cycles avec des structures électroniques fortement conjuguées (succession de liaisons σ π) riches en électrons mobiles. Beaucoup de ces noyaux ne sont pas synthétisés par l'homme et doivent être fournis par l'alimentation sous forme de vitamines. Ils participent stœchiométriquement à la réaction chimique mais diffèrent complètement des substrats des réactions, en effet, alors que les substrats sont transformés en produit, les coenzymes, après une ou plusieurs réactions retrouvent toujours leur état initial. La spécificité de la réaction ne dépend pas des coenzymes, mais uniquement de l'apoenzyme. Il existe deux types de coenzymes : Les réactions où prennent part les coenzymes peuvent se ramener à des réactions de transfert (e -, H +, P m, acyl, ). Le coenzyme sert d'accepteur transitoire et fonctionne selon 2 modes : Les coenzymes activateurs (coenzyme groupement prosthétique ex : le FAD) Coenzymes fortement liés à l'enzyme par des liaisons covalentes qu'il n'est pas possible de séparer sans dénaturer la protéine. Au cours de la réaction, le coenzyme ne se détache pas de l'apoenzyme. Les coenzymes transporteurs (coenzyme cosubstrat ou coenzyme rai ex : le AD) Coenzymes facilement dissociables de la partie protéique de l'enzyme (une simple dialyse suffit). Le coenzyme ne retrouve son état initial que dans une seconde réaction qui fait intervenir un second enzyme Les coenzymes d'oxydoréduction : ce sont des accepteurs d électrons et de protons Les nicotinamides dinucléotides : AD et ADP icotinamide adénine dinucléotide et nicotinamide adénine dinucléotide phosphate. La répartition cellulaire est universelle, la vitamine PP est un précurseur dans la synthèse de l'amide nicotinique dont dérive la nicotinamide. icotinamide ' Ribose 5' P P 5' Adénine ' Ribose Structure schématique du AD Spectre d'absorption caractéristique dans l'u avec un pic vers 260 nm et, pour la forme réduite uniquement un autre pic à 340 nm. (application aux déterminations d'activité catalytique en techniques cinétiques). AD fonctionne le plus souvent à l'état oxydé : (AD + ADH + H + ) dans les réactions du catabolisme, en particulier avec de nombreuses déshydrogénases, il est ensuite réoxydé dans la chaîne respiratoire, ou par un processus fermentaire anaérobie. 24

25 ADP fonctionne le plus souvent à l'état réduit : (ADPH + H + ADP + ) dans les biosynthèses des acides gras par exemple. Structure générale du AD H 2 CH 2 icotinamide Adénine H H AD Ribose 2' ' CH 2 5' H P H P CH 2 5' β Ribose ' 2' H H Mécanisme d'action H C C H 2 H C H C H 2 + H + R AD + (AD ox ) AH 2 A R ADH + H + (AD red ) Exemple de réaction : 3-P glycéraldéhyde + P m + AD +,3-P glycérate + ADH + H + (glycolyse) Les flavines nucléotides : FM et FAD Dérivent de la riboflavine (vitamine B2). FM : flavine mononucléotide et FAD : flavine adénine dinucléotide. Absorbent dans le visible (jaune à l'état oxydé, incolore à l'état réduit.) H 3 C CH 2 CHH CHH CHH CH 2 P H 3 C H FM Mécanisme d'action R R H AH 2 A H FM FAD FMH 2 FADH 2 25

26 Exemple de réaction : Acyl CoA + FAD Déhydroacyl 2,3-ène CoA + FADH 2 (β oxydation des AG) Les coenzymes hématiniques ou porphyriques éritables groupements prothétiques à rôle activateur que l'on rencontre dans les cytochromes et certaines oxydoréductases (transport des électrons dans les peroxydases). Union complexe d'un atome de fer avec une porphyrine comme l'hème de l'hémoglobine. C est le fer qui change de degré d oxydation Mécanisme d'action : Cytochromes, c est le fer qui change de degré d oxydation : Fe 2+ Fe 3+ + e - catalases, peroxydases : le fer reste à l'état Fe III L acide lipoïque Il intervient comme transporteur de 2H + et de 2 e - dans les réactions de décarboxylations oxydatives. Mécanisme d'action : agit par l intermédiaire de son pont disulfure : L ubiquinone ou coenzyme Q0 Il intervient comme transporteur de 2H + et de 2 e - dans des réactions de la chaîne respiratoire Mécanisme d'action : il intervient par l intermédiaire de son groupement quinone Les coenzymes transporteurs de groupement la biotine C est un transporteur de groupement CH par l intermédiaire de son atome d azote, qui intervient dans les réactions de carboxylation, par ex. au cours des synthèses lipidiques Mécanisme d'action biotine + C 2 carboxybiotine carboxybiotine + Substrat biotine + Substrat CH (accepteur) 26

27 phosphate de pyridoxal Dérive de la vitamine B6, très grand rôle dans le catabolisme des acides aminés par ex. dans les réactions de transamination où il fixe de manière transitoire l acide aminé par l intermédiaire de son groupement aldéhyde : Mécanisme d'action Thiamine pyrophosphate TPP Dérive de la vitamine B, La thiamine diphosphate joue le rôle de coenzyme dans les réactions de décarboxylation des acides α-cétoniques et dans les réactions de transcétolisation des sucres. Elle intervient par un des atomes de carbone de son noyau thiazole qui, après élimination d'un proton, forme un carbanion qui attaque le carbone de l'acide α-cétonique. Le magnésium est indispensable à l'activité enzymatique Coenzyme A Synthétisé à partir de l'acide pantothénique (vitamine du groupe B). Joue un rôle dans le transport de groupements acyl. La fonction thiol se condense avec un groupement carboxylique des substrats à activer (formation d'une liaison "riche en énergie" acyl thio ester). Exemple de réaction R CH + CoA SH R C S-CoA Avec R = CH 3 on a l'acétyl CoA : CH 3 C S-CoA Coenzyme F u acide ptéroyl L glutarique (PGA) ou acide tétrahydrofolique (THF) c est la forme activée de l acide folique vitamine du groupe B. C est un coenzyme de transport de groupement à un seul atome de Carbone S.Adenosyl Méthionine C est un transporteur de groupement méthyl Cobalamine La vitamine B2 est le cofacteur de réactions de transméthylation et de réactions d'isomérisation. Chez les micro-organismes, la vitamine B2 participe à la méthylation des métaux comme l'arsenic, l'étain, le mercure, le plomb, ce qui augmente la toxicité pour l'homme de certains d'entre eux, mais réduit celle de certains autres comme l'arsenic. Chez les mammifères la vitamine B2, sous forme de méthylcobalamine et d'adénosylcobalamine, catalyse l'activité de la méthionine synthase, de la méthylmalonyl-coamutase l'atp (adénosine triphosphate) ainsi que UDP CTP ATP :ucléotide (base azotée pentose phosphate) qui possède un double rôle : rôle de réserve énergétique et rôle de coenzyme transporteur de groupement phosphate. AMP : adénosine 5'-monophosphate ADP : adénosine 5'-diphosphate ATP : adénosine 5'-triphosphate 27

28 H 2 H H P H H P P 5' 2 CH 2 9 Adénine Adénosine Ribose ' AMP ADP ATP UTP intervient dans le transport des oses et permet leur entrée dans le métabolisme glucidique CTP sert au transport de la choline et de l éthanolamine pour la synthèse des phospholipides 28