Docteur Laurent PELLETIER
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1 Biologie Cellulaire Chapitre 5 : Biologie cellulaire de l angiogenèse Docteur Laurent PELLETIER MED@TICE PCEM1 - Année 2006/2007 Faculté de Médecine de Grenoble - Tous droits réservés.
2 Angiogenèse Définitions, généralités Histoire de l angio : Folkman & Cie Angiogenèse en pathologie : excès et insuffisances L angiogenèse en cancérologie Mécanismes cellulaires et moléculaires de l angiogenèse Modèles d étude de l angiogenèse Thérapies pro- & anti-angiogéniques
3 Angiogenèse Léonard De Vinci, 1508 L anatomie humaine : Le système cardiovasculaire
4 Définitions Angiogenèse : Vasculogenèse : Artériogenèse : Physiologique ou pathologique?
5 Structure d un capillaire
6 Structure d un capillaire
7 Fonctions d échanges
8 Vasculogenèse & angiogenèse Sprouting and non-sprouting angiogenesis in the 3-day old quail yolk sac. Both processes occur simultaneously. Black arrows point to the intussusceptive pillars and the white arrows indicate the long tips of sprouts.
9 Vasculogenèse & angiogenèse Remodelage vasculaire : Elargissement et séparation des vaisseaux qui forment les branchements caractéristiques du réseau vasculaire typique Maturation, stabilisation, quiescence : Interactions avec la matrice extracellulaire et les cellules de soutien (cellules musculaires & péricytes) Yancopoulos et al., 2000 (Nature 407:242)
10 Vasculogenèse & angiogenèse Formation de nouveaux vaisseaux - Structure déstabilisée - bourgeonnement vasculaire - risque de régression
11 Etapes de l angiogenèse 1, 2 - Réception stimulus 3 - Protrusion des cellules - Dégradation de la lame basale endothéliales 4 - Migration des CE 5 - Réorganisation des CE en capillaire - Division des CE en retrait - Reconstitution de la lame basale (stabilisation de la structure)
12 Angiogenèse en pathologie : excès et insuffisance Rétinopathies, Arthrite, Cancer Ischémie des membres inférieurs
13 Etapes de l angiogenèse Angiogenèse = tumeur & Tumeur = angiogenèse?
14 J. Folkman & Cie J. Folkman & F. Becker, 1963 Substitut du sang Thyroïde Cellules tumorales Temps Mesure de culture de la croissance tumorale Petites tumeurs blanches Grosses tumeurs vascularisées Efficacité substitut Temps de survie Les tumeurs ne se développent pas dans un environnement avasculaire
15 J. Folkman & Cie J. Folkman Anti-angiogenesis : new concept for therapy of solid tumors Ann. Surg., 175, , 1972 Solid tumors are angiogenesis-dependent Once tumor take has occurred, every increase in tumor cell population must be preceded by an increase in new capilaries that converge upon the tumor Lorsqu une tumeur est apparue, toute croissance de la population cellulaire tumorale doit être précédée par une augmentation de nouveaux capillaires qui convergent vers la tumeur
16 J. Folkman & Cie Is angiogenesis the Achilles heel of cancer?
17 J. Folkman & Cie Tumeur primaire Inhibiteur : Anti-angiogène? Tumeur secondaire Croissance
18 J. Folkman & Cie J. Folkman, 1994 Angiostatin : a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression on metastases by a Lewis Lung Carcinoma. Sécrétion d inhibiteurs naturels de l angiogénèse par la tumeur primaire Isolement de l angiostatine ( fragment C-terminal de 38 kda du plasminogène)
19 J. Folkman & Cie J. Folkman, 1995 Dormancy of micrometastases : balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression Les tumeurs dormantes présentent un équilibre prolifération / apoptose Pas de différence de prolifération entre les cellules de tumeurs dormantes ou non Contrôle de la croissance métastatique par des inhibiteurs de l angiogénèse qui accroissent l apoptose des cellules tumorales
20 J. Folkman & Cie J. Folkman, 1996 Fighting cancer by attacking its blood supply Des garrots sur les tumeurs Les tumeurs solides sont angiogénèse-dépendantes La thérapie anti-angiogénique doit aider à la lutte contre les tumeurs
21 J. Folkman & Cie J. Folkman, 1997 Endostatin : an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth Isolement de l Endostatine (fragment C-terminal de 20 kda du collagène XVIII) L endostatine - inhibe la prolifération des CE, - inhibe l angiogénèse (CAM) - entraîne la régression de tumeurs primaires ou métastatiques jusqu à un niveau microscopique
22 J. Folkman & Cie
23 J. Folkman & Cie J. Folkman, 1997 Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance Traitement répété de tumeurs par l endostatine arrêt de la croissance après traitement non acquisition de résistance au traitement Endostatine + Angiostatine : régression complète de Lewis Lung Carcinoma lésions non détectées après 11 mois
24 J. Folkman & Cie Tumor is not ameliorated! Réponse d une tumeur solide à un traitement avec des inhibiteurs de l angiogenèse.
25 J. Folkman & Cie J. Folkman, 1997 Spectrum of tumor angiogenesis in the bone marrow of children with acute lymphoblastic leukemia La moelle osseuse d enfants atteints de LMA : accroissement du réseau vasculaire (x 7) réseau vasculaire complexe avec branchements bfgf dans les urines - important au diagnostic - normal après thérapie et rémission Thérapie anti-angiogénique des leucémies?
26 Le switch angiogénique Inhibitors Thrombospondin, endostatin, angiostatin, interferons, TIMPs, and others + Angiogenesis _ Stimulators VEGF, FGF, PDGF, PD-ECGF, EGF, HGF, TGF-α, and others
27 Processus métastatique invasion extravasation Alberts et al. Figure 24-16
28 Mécanismes cellulaires et moléculaires
29 Mécanismes cellulaires et moléculaires VEGFs bfgf Angiopoïétines Ephrines PDGF TGFβ
30 Le VEGF et ses récepteurs (Vascular Endothelial Growth Factor) 4 VEGF : VEGF-A VEGF-D + PlGF VEGF-A : 121, 145, 165, 183, 189, 206 Fixation à l ECM Dimères de kda (pont dis)
31 Le VEGF et ses récepteurs (Vascular Endothelial Growth Factor) Facteur angiogénique clé : 1 er facteur angio décrit Induit la perméabilité vasculaire Stimule la prolifération des CE Stimule la migration des CE Facteur trophique des CE «spécifique des CE» Mobilise les cell. Souches hématopoiétiques Angio physiologique et pathologique
32 Le VEGF et ses récepteurs KO VEGF-A Embryos with yolk sac at E10; arrows indicate sites of vascularization*
33 Le VEGF et ses récepteurs
34 Le VEGF et ses récepteurs Ras-Raf Raf-MAPK Hypoxia
35 Angiopoïétines Le VEGF doit agir de concert avec d autres facteurs qui régulent et complètent son action Angiopoïétine 1 et le récepteur Tie2 Tie2 exprimé par les CE Vaisseaux adultes Ang1 + Tie2 stabilisation (cell. Péri-endothéliales + MEC)
36 Angiopoiétine 2 Antagoniste de Ang1 Blocage de la stabilisation des vaisseaux Déstabilisation initiale des vaisseaux Régression de la structure vasculaire en l absence de facteur de VEGF Effet pro-angiogénique en présence de VEGF
37 Ephrines
38 Ephrines Adams and Klein Trends in Cardiovascular Medicine 10:183
39 Ephrines
40 Biodisponibilité & Crinopexie Médiateurs solubles sont-ils réellement diffusibles? Crinopexie = séquestration Protéoglycanes (PG) = cœur protéique + Glycoaminoglycanes (GAG) H COO - H OH H O H OH H - O3 SO O H CH 2 OH H H O H H O NHCOOCH 3 GlcA(β1 3) GalNAc (β 1 4) Acide glucuronique & N-acétyl-galactosamine
41 Biodisponibilité & Crinopexie Gel hydraté Hydrophile Charges négatives H COO - CH 2 OH O - O H G A O3 SO G H OH H O H H H H H OH H O NHCOOCH 3 4 familles - résidus glucidiques - types liaisons - Nbre & position sulfates Interaction : Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Basic Fibroblast Growth Factor (bfgf) Transforming Growth Factor β (TGF β) Hepatocyte Growth Factor (HGF)
42 Biodisponibilité & Crinopexie Ex : Angiogenèse tumorale
43 Biodisponibilité & Crinopexie Capillaire sanguin Tissu sain Cellules tumorales
44 Dégradation de la MEC Cellule endothéliale Pro-uPA MMP latentes Pro-uPA upa-r upa Pgn-R Pgn Plasmine Plasmine STOP MMP activées (MMP1 & MMP3) PAI-1, (PAI-2) tpa Fibrine, Fibronectine, Laminine, upa : urokinase Plasminogen Activator tpa : tissue Plasminogen Activator PAI : Plasminogen Activator Inhibitor MMP : Matrix MetalloProtease Peptides solubles + Peptides anti-angiogéniques + Médiateurs libérées de la MEC Collagènes, Fibronectine, Laminine, Elastine
45 Maturation des vaisseaux Bourgeon endothélial Migration Facteur de recrutement PDGF-BB Ang1 PDGF-Rβ, Tie2 Cellule mésenchymateuse
46 Maturation des vaisseaux Inhibition de la prolifération Facteur de maturation Contact Différenciation en péricyte / CML (actine αsm) Lame basale
47 Maturation des vaisseaux Cellules endothéliales quiescentes + péricytes / SMC Vaisseau mature
48 TGFβ 3 TGFβ Expression ubiquiste, action pléiotrope, complexe TGFβ1 = Homodimère de 25 kda (2 x 112 aa (12.5 kda)) Sécrété sous une forme latente 3 récepteurs : TGFβR I-III + endogline Transforming Growth Factor β
49 RER Golgi H 2 N TGFβ SLN LAP TGFb1 (112 aa) H 2 N H 2 N S-S S-S S-S COOH COOH COOH Furine (endopeptidase) Pro-TGFb1 (390 aa) S-S S-S S-S kda S-S S-S S-S SLTC (100 kda) S-S S-S S-S S-S LTBP LLTC (260 kda) Sécrétion Latency-Associated Peptide Small Latent TGFb Complex Large Latent TGFb Complex Latent TGFb Binding Protein
50 TGFβ Plasminogène upa - PAI-1 + TGFß Cellules endothéliales Plasmine LTBP TGFβ LAP L-TGFß Cellule mésenchymateuse
51 Maturation des vaisseaux Inhibition de la prolifération Facteur de maturation = TGFβ Différenciation en péricyte / CML (actine αsm) Contact Lame basale
52 Hypoxie et angiogenèse Hypoxie STOP Prolyl hydroxylase Ubiquitine ligase : Von Hippel Lindau (pvhl) Protéasome : dégradation Synthèse HIF1α STOP HIF1α I OH HIF1α I Ub-Ub-Ub HIF1 HRE Promoteur HIF1β Transcription EPO, VEGFR1, VEGF, Ang2 Séquence codante HIF : Hypoxia-Inducible Factor HRE : HIF Responsive Element (Elément de Réponse à HIF)
53 Hypoxie et angiogenèse
54 Anomalies des vaisseaux tumoraux Angiogenèse = processus multiétapes, nombreuses régulations Réponse physiologique à des besoins accrus (hypoxie & VEGF) Modifications géniques des cellules tumorales
55 Anomalies des vaisseaux tumoraux Réseau vasculaire normal Réseau vasculaire tumoral
56 La voie VEGF VEGF Overexpression and Abnormal Blood Vessels A. Vasculature from wild type mice B. Vasculature from mice overexpressing VEGF Thurston et al. Science. 1999;286:2511.
57 Méthodes d étude de l angiogenèse In vitro : Cell number/3h-thymidine Endothelial migration/scratch Tube formation In vivo : Chick Chorioallantoic membrane Rabbit/Mouse ear chamber Rabbit corneal eyepocket Rabbit hindlimb ligated artery Sponge implant Capillary / fibre ratio
58 Méthodes d étude de l angiogenèse Prolifération des cellules endothéliales en culture Thymidine tritiée ( 3 H) Compte cellulaire
59 Méthodes d étude de l angiogenèse Migration des cellules endothéliale en culture A travers un filtre Blessure sur monocouche
60 Méthodes d étude de l angiogenèse Induction de réseau vasculaire en culture tridimensionnelle (gel de MEC) +/- formation d un réseau Cellules endothéliales Cellules endothéliales + Facteur de croissance angiogénique
61 Méthodes d étude de l angiogenèse Méthode in vivo plus pertinentes que les méthodes in vitro «Plug» de collagène Membrane chorio-allantoidienne
62 Méthodes d étude de l angiogenèse Membrane chorio-allantoidienne de poulet Fibrin plug impregnated with FGF Pre-existing vessels New vessels Minischetti M, et al Br J Haematol 2000 Jun;109(4):829-3
63 Méthodes d étude de l angiogenèse Rabbit Corneal Eyepocket Iris Implanted disk Pupil New vessel growth
64 Méthodes d étude de l angiogenèse Etude de l angiogenèse in situ : directement dans les organes Immunomarquage des vaisseaux : Ex : facteur VIII, CD34, intégrine alpha-v béta 3 (marqueur de vaisseaux en angiogenèse) numération & morphologie des vaisseaux
65 Angiogenèse thérapeutique Induction de l angiogenèse par l administration de VEGF Ex : artériopathies des membres inférieurs
66 Angiogenèse thérapeutique Induction de l angiogenèse Tammela, 2005 VEGF-A165 VEGF-B VEGF-C Témoin
67 Applications thérapeutiques Inhibition de l angiogenèse dans des pathologies ou un excès d angiogenèse est observé cancer & rétinopathie diabétique
68 VEGF Expression Correlates With Colon Cancer Metastasis Patients With Metastases (%) /19 10/ and /14 Tumor specimens obtained from 62 patients were stained with an anti- VEGF antibody. For each patient group with different levels of staining intensity (measured on a scale), the percentage of metastatic disease was calculated. Intensity of VEGF Staining *Takahashi et al. Cancer Res
69 VEGF Expression Correlates With Colon Cancer Recurrence Non-Recurrence (%) VEGF 2 + or < 2 + P < VEGF Follow-Up (months) Archived tumor specimens from 27 patients were stained with an anti-vegf antibody, and the staining intensity was measured on a scale Takahashi et al. Arch Surg
70 Approaches to VEGF Signal Inhibition 1. Ligand sequestration : mabs, soluble receptors 2. Receptor blocking: mabs p85 3. Tyrosine kinase inhibition : TKIs 4. VEGFR antisense oligonucleotide PLCγ 6. Transcription factor inhibition GRB2 5. Inhibition of downstream signaling events Endothelial cell
71 La voie VEGF Agents Targeting the VEGF Pathway Anti-VEGF antibodies (bevacizumab) VEGF Soluble VEGF receptors (VEGF-TRAP) P P P P VEGFR-1 P P P P VEGFR-2 Anti-VEGFR antibodies (IMC-1121b) Endothelial cell Small-molecule VEGFR inhibitors (PTK787, SU11248, ZD6474)
72 La voie VEGF Selected Agents Targeting the VEGF Pathway Class Examples Targets Agents targeting the VEGF ligand Antibodies Soluble receptors Bevacizumab (Avastin ) HuMV833 2C3 VEGF-TRAP VEGF VEGF VEGF* VEGF and PlGF Agents targeting the VEGF receptors Smallmolecule inhibitors PTK787 VEGFR-1/2, Kit PDGFR, c- SU11248 VEGFR-2, PDGFR, c-kit ZD6474 VEGFR-2, EGFR/FGFR-1 Stage of Development Approved Phase I completed Preclinical Phase I Phase III Phase III Phase II Company Genentech Protein Design Labs Peregrine Regeneron Pfizer Novartis AstraZeneca Antibodies IMC-1121b VEGFR-2 Preclinical ImClone Ribozymes Angiozyme VEGFR-1 Phase II RPI *Inhibits interaction with VEGFR-2 only.
73 L'ensemble de ce document relève des législations française et internationale sur le droit d'auteur et la propriété intellectuelle. Tous les droits de reproduction de tout ou partie sont réservés pour les textes mais aussi pour l'ensemble des documents iconographiques, photographiques, vidéos et sonores. Ce document est interdit à la vente ou à la location. La diffusion de ce document, sa duplication, sa mise à disposition du public à sa demande ou non, sa mise en réseau, sa communication publique, partielle ou totale, sous quelque forme ou support que ce soit, est formellement interdite et strictement réservée à la Faculté de Médecine de Grenoble et à ses auteurs. L utilisation de ce document est strictement réservée à l usage privé et non marchand aux fins de représentation sur écran monoposte des étudiants inscrits à la Faculté de Médecine de Grenoble et non destinées à une utilisation collective, gratuite ou payante. L utilisation de ce document à titre d enseignement est strictement réservée à la Faculté de Médecine de Grenoble et à ses auteurs. Ce document a été réalisé par la Cellule TICE Médecine de la Faculté de Médecine de Grenoble. MED@TICE PCEM1 - Année 2006/2007 Faculté de Médecine de Grenoble - Tous droits réservés.
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